李 萍，潘曉麗，鄭小香，李 健，馬玉芳，黃一帆

(福建農(nóng)林大學(xué)中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350002)

金線蓮(Anoectochilus roxburghii(wal1.)Lind1.)又稱花葉開(kāi)唇蘭、金絲草、金蠶、金不換、烏人參、金線入骨消等，是蘭科開(kāi)唇蘭屬的一種多年生草本植物。金線蓮以全草入藥，在民間被視為珍稀名貴藥材，其藥用價(jià)值倍受人們青睞，有“藥王”之稱。其味甘、性平，具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕、強(qiáng)心利尿、固腎、平肝等功效［1－2］。多糖(polysaccharides)是生物體內(nèi)普遍存在的一類生物大分子物質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中，具有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、抗炎、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等功能［3－4］。Hsieh等研究表明金線蓮水提物能夠調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和過(guò)敏反應(yīng)及調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群等［5］;Yang等研究發(fā)現(xiàn)金線蓮水提物可以防止骨質(zhì)流失［6］和益生腸道菌群的作用［7］;Cui等研究表明金線蓮水提物具有降血糖［8］、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)活性［9］;劉青等通過(guò)試驗(yàn)證明金線蓮多糖在體外試驗(yàn)中有清除自由基及抗氧化作用［10］。綜上所述，金線蓮廣泛的藥理活性很可能與其高含量的多糖有關(guān)。林麗清等研究表明金線蓮粗多糖生藥量為37.45%［11］。目前已有許多關(guān)于金線蓮多糖提取工藝研究［12－13］，如趙保發(fā)等以乙醇回流過(guò)的藥渣為材料，分別用響應(yīng)面法和正交試驗(yàn)法對(duì)金線蓮多糖提取工藝進(jìn)行研究［13］;李德華等以金線蓮水溶性多糖含量為指標(biāo)，用正交試驗(yàn)法對(duì)煎煮過(guò)程中水的用量、浸提時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察［14］。但考慮到煎煮過(guò)程中高溫對(duì)多糖會(huì)有一定的破壞作用，且從金線蓮全草中提取金線蓮多糖工藝研究鮮有報(bào)道，因此，對(duì)金線蓮多糖提取工藝進(jìn)行研究具有重要的意義。該研究擬以金線蓮全草為試驗(yàn)對(duì)象，以粗多糖提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)從浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比3個(gè)方面優(yōu)化金線蓮多糖的提取工藝，為金線蓮多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑。金線蓮(購(gòu)自福建南靖)，D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自福建省藥檢所)，無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、濃硫酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器。電子天平(梅特勒－托利多儀器上海有限公司);純水機(jī)(Milli-Q);數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司);SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);冷凍離心機(jī)ALLEGRA X-22R(Beckman，USA);TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 金線蓮多糖提取工藝。金線蓮全草→干燥→粉碎→蒸餾水浸提→抽濾→濃縮→醇沉→離心→復(fù)溶→多糖溶液(供試樣品)。

1.2.2 金線蓮多糖提取。精確稱取金線蓮粉末1.0 g于錐形瓶中，加入一定體積的蒸餾水，置水浴鍋中，浸提一定時(shí)間后抽濾，殘?jiān)蒙僭S蒸餾水洗滌2次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至100 ml，取2 ml加入8 ml無(wú)水乙醇，過(guò)夜，離心(3 000 r/min，15 min)，沉淀用蒸餾水復(fù)溶后于100 ml容量瓶中定容，得金線蓮多糖供試溶液。

1.2.3 金線蓮粗多糖提取率的測(cè)定。金線蓮多糖的測(cè)定采用苯酚—硫酸法［15］。

1.2.3.1 苯酚溶液的配制。取苯酚5.0 g，溶于一定體積的水中，并定容至100 ml棕色容量瓶中，搖勻，即得5%苯酚溶液，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中避光，冷藏。

1.2.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。將100 mg的D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品加蒸餾水溶解，并定容于100 ml容量瓶中，得濃度為1 mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。分別取1 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 1、2、3、4、5、6、7、8 ml于100 ml容量瓶中，蒸餾水定容。精密吸取蒸餾水或上述供試液2.0 ml于試管中，分別加入5%苯酚溶液1.0 ml，搖勻，沿管壁迅速加入濃硫酸5.0 ml，混勻，置沸水浴中加熱15 min。冷卻至室溫后，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以吸光度(y)為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度(x)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得出回歸方程，并做出標(biāo)準(zhǔn)曲線［16－17］。

1.2.3.4 金線蓮多糖提取率的計(jì)算。金線蓮多糖提取率=100%。

1.2.4 單因素試驗(yàn)。浸提溫度采用 60、70、80、90、100 ℃ 5個(gè)水平，浸提時(shí)間采用1、2、3、4、5 h 5個(gè)水平，料液比采用1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.5 正交試驗(yàn)［18］。在上述單因數(shù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定三因素三水平作正交試驗(yàn)，優(yōu)選出金線蓮水溶性多糖提取的最佳工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 從圖1可以看出，葡萄糖在490 nm處，10～70 μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，擬合方程為 A=0.013 9C －0.014 4，相關(guān)系數(shù) R2=0.998 7。

2.2 單因素對(duì)多糖提取率的影響

2.2.1 浸提溫度對(duì)金線蓮多糖提取率的影響。從不同浸提溫度對(duì)金線蓮粗多糖提取率的影響(圖2)可以看出，60～90℃間隨著溫度的升高，金線蓮粗多糖的得率不斷增加，在90℃時(shí)達(dá)最大，但在100℃時(shí)又略有下降，故浸提溫度以90℃為宜。

2.2.2 浸提時(shí)間對(duì)金線蓮多糖提取率的影響。從圖3可以看出，浸提時(shí)間在1～4 h時(shí)，金線蓮多糖的提取率逐漸增高，在4 h時(shí)金線蓮多糖的提取率最高，在5 h時(shí)略有下降。說(shuō)明浸提時(shí)間并不是越久越好，且以4 h為宜。

2.2.3 料液比對(duì)金線蓮多糖提取率的影響。由料液比對(duì)金線蓮多糖提取率的影響(圖4)可見(jiàn)，料液比在1∶20時(shí)多糖提取率最高，為最適料液比。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化金線蓮粗多糖提取工藝 在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比3個(gè)因素各選取3個(gè)水平制定因素水平表(表1)。按此正交表安排試驗(yàn)，以多糖得率作為衡量提取效率的指標(biāo)，對(duì)金線蓮多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。為了提高試驗(yàn)的可靠性，每一條件下均做重復(fù)試驗(yàn)3次(n=3)，測(cè)定結(jié)果取其平均值供統(tǒng)計(jì)分析用。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

正交試驗(yàn)極差分析(表2)顯示，3個(gè)因素對(duì)金線蓮多糖提取率影響的主次順序?yàn)榻釡囟龋窘釙r(shí)間＞料液比，金線蓮多糖提取的最佳工藝為浸提溫度90℃、浸提時(shí)間4 h、料液比1∶20;驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，在此條件下，3次試驗(yàn)的提取率平均值為28.47%。

由正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果(表3)可見(jiàn)，溫度對(duì)金線蓮多糖提取率的影響差異性顯著，且影響最大，其次是浸提時(shí)間，這與上述的極差分析結(jié)果一致。時(shí)間和料液比對(duì)金線蓮多糖提取率的影響不大，差異不顯著。

表3 正交試驗(yàn)方差分析

3 結(jié)論與討論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)浸提溫度進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的增高，金線蓮粗多糖的得率呈上升趨勢(shì)，在90℃時(shí)達(dá)最大，但在100℃時(shí)又略有下降，可能是由于高溫破壞了部分多糖的結(jié)構(gòu)，從而使金線蓮粗多糖提取率下降，故浸提溫度以90℃為宜;對(duì)浸提時(shí)間進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，浸提時(shí)間在1～4 h時(shí)，金線蓮粗多糖的提取率逐漸增高，而在5 h時(shí)略有下降，說(shuō)明浸提時(shí)間并不是越久越好，且以4 h為宜;對(duì)料液比進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，料液比在1∶20時(shí)多糖提取率最高，表明水過(guò)多或過(guò)少均會(huì)影響多糖的溶出，故料液比以1∶20為宜。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，金線蓮多糖提取的最佳工藝條件為浸提溫度90℃、浸提時(shí)間4 h、料液比1∶20;驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，在此條件下，3次試驗(yàn)的提取率平均值為28.47%。這與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，證明試驗(yàn)結(jié)果可靠。通過(guò)該試驗(yàn)的研究，優(yōu)化了金線蓮多糖的提取工藝，不僅提高了金線蓮原材料的利用率，也為金線蓮多糖生理活性方面的研究奠定了基礎(chǔ)，具有十分重要的意義。

此外，此次試驗(yàn)所測(cè)得的金線蓮粗多糖的提取率較某些文獻(xiàn)中報(bào)道的提取率偏高［19－22］。這與金線蓮的產(chǎn)地、培養(yǎng)時(shí)間等不同有關(guān)。陳曉蘭等研究表明不同產(chǎn)地金線蓮根莖和葉中多糖的含量有所不同［19］。黃瑞平等研究發(fā)現(xiàn)不同月齡金線蓮多糖的含量有所不同［20］;金線蓮在移栽培養(yǎng)5個(gè)月時(shí)，多糖含量最高［21］;組培金線蓮樣品中的多糖遠(yuǎn)高于野生金線蓮樣品［22］;林麗清等研究表明金線蓮粗多糖生藥量為37.45%，精制金線蓮多糖生藥量也可達(dá) 27.14%［11］。

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