閆 丹，郭慧琛，馮 霞，靳 野，魏衍全，孫世琪(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疾病病原生物學(xué)國家重點實驗室，甘肅蘭州730046)

口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)是小RNA病毒科口蹄疫病毒屬的成員，根據(jù)血清學(xué)類型可以分為7種血清型，分別為O型、A型、C型、亞洲1型(Asia 1)、南非1 型(SAT1)、南非 2 型(SAT2)和南非 3 型(SAT3)［1］。FMDV基因組由單股正鏈RNA組成，長度約為8 500 bp，病毒核酸被衣殼蛋白包被，形成二十面體結(jié)構(gòu)，該二十面體衣殼是由口蹄疫病毒的4個結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60個拷貝組成。大量研究表明，口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白可以在體外環(huán)境中自組裝形成不含病毒遺傳物質(zhì)的空衣殼，即病毒樣顆粒(Virus-like particle，VLP)。病毒樣顆粒作為納米級生物材料，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力，除了利用病毒樣顆粒優(yōu)越的免疫原性來研發(fā)新型疫苗外［2］，由于其生物相容性好，有較大的體表面積，運載量大，目前病毒樣顆粒在異源抗原呈遞、藥物載體和運載外源小分子等方面也表現(xiàn)出獨具的優(yōu)勢［3］。

抗癌藥物阿霉素(DOX)在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療，但由于其自身對細(xì)胞沒有選擇性，在應(yīng)用中的缺點是毒副作用較大，這限制了其在臨床上的應(yīng)用，因此有必要對其進(jìn)行相應(yīng)修飾，改善其藥物動力學(xué)效應(yīng)，以期實現(xiàn)增效減毒的目的［4］。常用方法是在抗癌藥物表面鏈接靶向分子(如抗體、受體配體等)，或者利用藥物載體運載抗癌藥物等［5－8］。筆者基于亞洲1型口蹄疫衣殼蛋白VP0、VP3、VP1在體外具有自組裝能力，應(yīng)用融合表達(dá)技術(shù)，原核表達(dá)可溶性口蹄疫病毒衣殼蛋白6×His-SUMO-VP0、6×His-SUMO-VP3和6×His-SUMO-VP1，切除衣殼蛋白肽鏈N端的6×His-SUMO標(biāo)簽蛋白使衣殼蛋白在特定組裝體系中自組裝成VLPs［9］，然后在其表面偶聯(lián)抗癌藥物，探索口蹄疫病毒樣顆粒作為抗癌藥物載體的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器 BIO-RAD DNA Engine(USA);BIO-RAD蛋白電泳儀(USA);核酸電泳儀和脫色搖床(北京六一儀器廠);振蕩儀HZQ-Q(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱和恒溫水浴鍋，均購自上海精宏;Gel-DOC XR凝膠成像儀(USA);臺式常溫離心機(jī)和各種規(guī)格微量移液器，均購自Eppendorf;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物股份有限公司);貝克曼超速離心機(jī)(XPN-100/90/80);紫外吸收儀(B＆W TEK;USA);酶標(biāo)儀(PerkinElmer Victor X4);共聚焦激光顯微鏡(Leica，USA)

1.2 試劑 蛋白純化樹脂(Ni-NTAsefinoseTMresin)親和層析柱，購自上海生工生物工程股份有限公司。阿霉素、偶聯(lián)試劑碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，均購自Sigma公司;咪唑和TritonX-100，均購自Amresco公司;其他化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM)和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;試驗用水均為超純水(18.2 MΩ/cm)。

1.3 菌種、表達(dá)載體及抗體 含亞洲1型FMDV分離株VP1編碼區(qū)的重組克隆質(zhì)粒pSMA-VP1及帶有SUMO和6×His融合標(biāo)簽的pSMK、pSMA表達(dá)載體與JM109大腸桿菌及BL21(DE3)-RIL表達(dá)菌株，均購自生工生物工程(上海)有限公司。兔抗亞洲1型單克隆抗體、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體，均購自Sigma公司。

1.4 方法

1.4.1 FMDV衣殼蛋白VP0、VP3和VP1的表達(dá)純化。將測序正確的陽性重組質(zhì)粒pSMK-VP0VP3和pSMA-VP1共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)-RIL中，挑取單克隆菌落，接種于卡那霉素、氯霉素和氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下220 r/min過夜培養(yǎng)，然后將過夜培養(yǎng)的表達(dá)菌按1∶100的比例重新接種到新的含有上述抗性的LB培養(yǎng)基，于37℃，220 r/min的條件下培養(yǎng)至OD600為0.9左右，將菌液轉(zhuǎn)入16℃條件下，加入1 mol/ml的 IPTG，使終濃度為 0.75 mmol/ml，誘導(dǎo)表達(dá)16 h后收集樣品。按1∶50濃縮比例將菌體懸浮于 Buffer A(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L Imidazole，2 mmol/L DTT，0.05%TritonX-100，pH 8.4)中，充分混勻后在冰上超聲波處理8 min，然后11 500 r/min 4℃下離心20 min收集上清，通過親和層析鎳柱純化目的蛋白。然后，將純化后的蛋白按照1∶100的體積加入SUMO酶，混勻后加入到截留分子量為8 kD的透析袋中，過夜透析，切除標(biāo)簽蛋白。

1.4.2 免疫印跡試驗。將切除標(biāo)簽蛋白的樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳(80 V，2 h)，隨后用半干轉(zhuǎn)法將重組蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯雜交膜(PVDF膜)上(200 mA，3 h)，用5%脫脂奶粉(PBS，pH7.0)37℃條件下封閉1 h，TBST洗滌3次，然后分別用兔抗亞洲1型血清(1∶4 000)37℃孵育1 h，TBST充分洗滌后分別用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗體IgG(1∶6 000)37℃孵育1 h，TBST充分洗滌后于暗室加入ECL發(fā)光底物反應(yīng)3 min，膠片曝光，顯影及定影固定后觀察目的蛋白表達(dá)情況。

1.4.3 FMDV-VLPs體外組裝。將切除標(biāo)簽蛋白的樣品裝入截留分子量為8 kD的透析袋中，透析袋置于500 ml組裝Buffer(250 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L Imidazole，1 mmol/L CaCl2，2 mmol/L DTT，0.1%TritonX-100，pH 8.4)中，4℃下輕微攪拌。24 h后收樣，使用動態(tài)光散射儀(DLS)檢測組裝情況。

1.4.4 FMDV-VLPs體外偶聯(lián)阿霉素。取1 ml組裝好的體系，加入EDC和NHS溶液各40 μl(濃度均為1 mmol/ml)，反應(yīng)30 min后將混合物加入到透析袋中，置于4℃冰箱內(nèi)過夜透析，將未反應(yīng)的分子去除。然后，將透析后的偶聯(lián)物平鋪到蔗糖密度梯度(15%、25%、35%、45%)離心管上，小心放到超高速低溫離心機(jī)中，4℃下35 000 r/min離心2 h，然后將離心管中的液體每毫升收集1次，通過SDS-PAGE確定偶聯(lián)物所在的位置。

1.4.5 細(xì)胞示蹤試驗。將A549細(xì)胞接種到有玻片的35 mm培養(yǎng)皿中，接種密度約為1×104個/ml，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。加入口蹄疫病毒樣顆粒和復(fù)合物后1 h和2 h分別處理細(xì)胞，接著用PBS洗滌3次，然后用4%的多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞15 min，再用PBS洗滌3次，用1‰ Triton X-100穿透15 min，用1∶2 000的豬源亞洲1型口蹄疫血清孵育1 h，PBS洗滌3次后，用FITC標(biāo)記的山羊抗豬的二抗孵育1 h，PBS洗滌3次后用DAPI進(jìn)行染核處理。15 min后用共聚焦顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白純化結(jié)果 將實驗室保存的陽性重組質(zhì)粒pSMK-VP0VP3和pSMA-VP1共轉(zhuǎn)化E.coli表達(dá)菌BL21(DE3)codon plus-RIL中，發(fā)現(xiàn)融合蛋白His-SUMO-VP0、His-SUMO-VP3及His-SUMO-VP1在16℃條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能成功表達(dá)，其分子量與理論值(45 kD、36 kD、35 kD)相近。分析發(fā)現(xiàn)，目的蛋白以可溶性融合蛋白的形式出現(xiàn)在菌體裂解液的上清中可溶性效果好，經(jīng)親和層析柱純化融合蛋白(圖1)，并且在低溫條件下可溶性蛋白的表達(dá)量達(dá)到2.5 mg/ml。為了進(jìn)行體外組裝，用特異性SUMO酶對his-sumo標(biāo)簽進(jìn)行酶切，利用SDS－PAGE和Western blot進(jìn)行驗證，如圖2所示。

2.2 FMDV-VLPs體外組裝結(jié)果 模擬病毒體外組裝條件，將切除His-SUMO標(biāo)簽后的衣殼蛋白置于自組裝Buffer中，輕微攪拌24 h 后，用0.22 μm 的濾器過濾，加入 60 μl樣品到動態(tài)光散射儀的測量杯中，按照儀器的操作說明測量后得到粒徑大小分布圖。從圖3可以看出，偶聯(lián)阿霉素后的病毒樣顆粒粒徑大小有增大的趨勢，這是因為阿霉素偶聯(lián)在病毒樣顆粒的表面，增加了病毒樣顆粒的粒徑，也說明了病毒樣顆粒確實和阿霉素發(fā)生了偶聯(lián)。剩下的病毒樣顆粒用于后續(xù)偶聯(lián)試驗。

2.3 FMDV-VLPs病毒樣顆粒偶聯(lián)阿霉素 從圖4可以看出，阿霉素在其含氧苯環(huán)側(cè)鏈上帶有一個伯胺基團(tuán)，而病毒樣顆粒表面有很多羧基，通過常用的化學(xué)偶聯(lián)試劑碳二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，使伯胺和羧基形成腙鍵，從而將阿霉素偶聯(lián)到病毒樣顆粒的表面。在SDS-PAGE和核酸膠上，由于DOX自身有熒光，能在紫外光下被激發(fā)而表現(xiàn)出熒光，從而可以證明DOX是否與病毒樣顆粒發(fā)生偶聯(lián)。從圖5可以看出，目的條帶所在的位置有明顯的熒光，而沒有偶聯(lián)的病毒樣顆粒在相同的位置處，沒有熒光。用非變性核酸膠電泳，由于病毒樣顆粒攜帶了阿霉素，與未偶聯(lián)的相比泳動速度變慢，從而跑在病毒樣顆粒后面。

2.4 細(xì)胞示蹤作用 通過不同的時間點(1、2 h)收集A549細(xì)胞樣品，探討偶聯(lián)后的復(fù)合物是否能夠特異性吸附癌細(xì)胞并且通過受體介導(dǎo)的作用進(jìn)入細(xì)胞。已經(jīng)有大量研究表明，在癌細(xì)胞表面，整合素受體與細(xì)胞的擴(kuò)散增殖有關(guān)，所以會過量表達(dá)［10－12］，而口蹄疫病毒樣顆粒在自組裝的過程中保持了空間構(gòu)型的完整，在VP1的loop結(jié)構(gòu)中有抗原決定區(qū)，已經(jīng)被證實該區(qū)域的RGD序列高度保守，能夠利用整合素受體吸附細(xì)胞從而被內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞。從圖6可以看出，在共聚焦顯微鏡照片中，單獨的病毒樣顆粒和偶聯(lián)阿霉素的病毒樣顆粒都能夠隨著時間的變化從細(xì)胞膜向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移，說明病毒樣顆粒偶聯(lián)阿霉素后并沒有影響其與整合素受體結(jié)合的能力。

3 討論

探索新一代生物材料始終是納米科技發(fā)展比較活躍的領(lǐng)域，其中VLP是自然存在的來自病毒蛋白的納米級生物材料，在運載外源物質(zhì)方面展示出極大應(yīng)用潛力［13－15］。首先，病毒樣顆?？梢栽诙喾N表達(dá)系統(tǒng)中得到有效表達(dá)，在原核系統(tǒng)中VLP的純化比較簡單，能夠在體外高效表達(dá)和純化，易于大規(guī)模生產(chǎn)純化。其次，VLP作為一種納米級材料，具有與其他納米材料許多相同的特性，比如可以在其表面或者內(nèi)部進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)或者基因修飾，能夠容忍一定數(shù)量和大小的外源蛋白插入，這些特點賦予了它們可以通過分子生物技術(shù)手段而獲得了更多的生物醫(yī)學(xué)功能。再次，來自不同病毒的VLP在其外殼蛋白中一般會含有該病毒吸附侵入病毒時所用到的一些結(jié)合位點，可以靶向性結(jié)合宿主細(xì)胞，例如犬細(xì)小病毒樣顆粒(CPV-VLP)對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體有天然吸附趨勢，因此可以通過和癌細(xì)胞表面過量表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵素受體結(jié)合，就可能達(dá)到靶向性治療癌癥的作用。因此，VLP可以作為一種生物學(xué)應(yīng)用的工具而成為一個良好的多功能平臺，在藥物運輸、基因治療、細(xì)胞靶向定位和治療癌癥等方面發(fā)揮作用。

筆者利用大腸桿菌融合表達(dá)亞洲1型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3，并在體外組裝緩沖液中形成和自然病毒形態(tài)機(jī)構(gòu)十分相似的病毒樣顆粒，運用一步偶聯(lián)反應(yīng)將抗癌藥物偶聯(lián)到口蹄疫病毒樣顆粒表面，得到新型抗癌藥物載體。通過SDS-PAGE和瓊脂糖凝膠初步驗證口蹄疫病毒樣顆粒和抗癌藥物發(fā)生了偶聯(lián)，然后通過動態(tài)光散射儀測定了粒徑大小，再次佐證了偶聯(lián)反應(yīng)確實發(fā)生。這說明口蹄疫病毒樣顆?？梢宰鳛橐环N納米材料，對其表面進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，結(jié)果表明這些化學(xué)修飾沒有破壞病毒樣顆粒的完整性。

同時，還初步探討了口蹄疫病毒樣顆粒是否能夠像自然病毒一樣吸附入侵細(xì)胞，將偶聯(lián)后的復(fù)合物和癌細(xì)胞共同孵育一段時間，然后借助共聚焦顯微鏡觀察到病毒樣顆粒復(fù)合物能夠攜帶藥物入侵到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，這為藥物隨后的治療作用發(fā)揮提供了前提條件。該研究中獲得病毒樣顆粒表達(dá)系統(tǒng)為原核表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)成本低，表達(dá)量高，這些條件為病毒樣顆粒的其他生物應(yīng)用提供了條件，使口蹄疫病毒樣顆粒具有發(fā)展成為潛在的外源分子運載體的能力。雖然證實VLPs和藥物可以形成復(fù)合物，但二者的最佳結(jié)合率還需要進(jìn)一步摸索，新形成的復(fù)合物在不同條件下的的穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步探索，新形成的復(fù)合物的抗癌效果還可能需要體外或者體內(nèi)試驗進(jìn)行驗證，這些初步探索為病毒樣顆粒發(fā)揮更多的生物學(xué)應(yīng)用提供了借鑒。

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