鐘 燦，宋 瀟，周海燕，謝昭明*(.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南長沙4003;.湖南省中醫(yī)藥高等?？茖W校，湖南株洲40)

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根莖，為多年生草本植物［1］，為大宗常用中藥材，有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等功用，對許多疾病均有治療作用，特別是對心腦血管病具有很好的臨床療效。

丹參對土壤氣候適應性強，適宜種植在土層深厚、排水良好、中等肥力的砂壤土中，粘土和鹽堿地不宜生長。性喜溫暖濕潤、陽光充足的環(huán)境，耐寒、耐旱。李倩等對商洛6個地區(qū)丹參的研究表明，無霜期與年極端最高溫度是影響丹參素含量的主導因子，7月均溫、年均溫度、年極端最高溫度是影響丹參酮IIA含量的主導因子［2］。劉紅云通過大田試驗、盆栽試驗等研究不同生長因子和環(huán)境因子對丹參生長和活性成分積累的影響，從而建立丹參生長模擬模型指導丹參生產(chǎn)，以期獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的丹參藥材［3］。舒志明等研究指出春季地溫10℃時開始返青，溫度20～26℃、相對濕度80%時生長旺盛，秋季氣溫降至10℃以下時，地上部分開始枯萎，根在-15℃的情況下，可安全越冬［4］。該研究從河南省三門峽市盧氏縣引種的丹參，產(chǎn)量高。經(jīng)過多年發(fā)現(xiàn)栽培極少數(shù)一部分丹參0℃以下長達30多天不倒苗，經(jīng)篩選、移栽作為抗寒丹參，冬季倒苗的稱為普通丹參。在此以抗寒丹參和普通丹參為材料，通過研究其形態(tài)、葉片和根莖的抗氧化酶活性和可溶性多糖含量的差異，探討抗寒丹參的抗寒機理并對其進行選育，對培育出具有優(yōu)良抗寒能力的丹參良種具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2013年11月20日和2013年12月15日，在湖南省望城區(qū)銅官鎮(zhèn)丹參栽培基地隨機分別采挖兩年生抗寒丹參和普通丹參植株，取其葉片和根莖進行抗氧化酶活性和可溶性糖含量的測定。

1.2 測定指標

1.2.1 抗氧化酶活性測定。隨機取抗旱丹參和普通丹參葉片和根及根莖測定其抗氧化酶活性，其中用KMnO4標準溶液滴定法測過氧化氫酶(CAT)活性、愈創(chuàng)木酚法測POD活性、NBT還原法測SOD活性和考馬斯亮藍(G-250)法測可溶性蛋白質(zhì)含量［5］。SOD活性以抑制氮藍四唑NBT光氧化還原50%的酶量為1個活力單位u，CAT活性以1 min每毫克蛋白質(zhì)酶解1 μmol H2O2為1個活力單位u，POD活性以1 min每毫克蛋白質(zhì)催化的470 nm下OD值變化為一個酶活單位 u［5］。

1.2.2 可溶性糖含量測定。

1.2.2.1 試驗材料。隨機取抗寒丹參和普通丹參葉片于80℃烘箱中烘干，粉碎，過80目篩，備用。

1.2.2.2 對照品溶液的制備。取經(jīng)105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品41.3 mg，精密稱定，置100 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.2.3 供試品制備。取丹參葉粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取50 ml水，稱重，超聲1 h，冷卻，補足損失水量，過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.4 樣品含量測定。分別精密吸取供試液0.3 ml于25 ml具塞試管中，加水至2.5 ml，加入5.0%苯酚水溶液6.0 ml，在冰水浴中緩緩加入濃硫酸至刻度，搖勻，放冷后置沸水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，放冷至室溫，隨行溶劑空白，于489 nm測定吸收度。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗寒丹參與普通丹參外觀形態(tài)比較 通過多年丹參栽培發(fā)現(xiàn)極少數(shù)一部分丹參冬季不倒苗，將其稱為抗寒丹參。普通丹參幼苗最抗寒，播種發(fā)芽后2個月左右不怕冰凍、嚴寒，半年內(nèi)抗寒能力比抗寒丹參還強，一年以上老苗抗寒能力差，普通丹參中抗寒丹參植株僅有1% ～2%能夠經(jīng)受2～3場雪，將抗寒丹參于保鮮膜內(nèi)裝好，放置冰柜內(nèi)-3℃ 4 d以上，顏色沒有變化，仍然鮮活、不失綠，表明篩選出來的丹參抗寒能力強，能長期抵抗-3℃的低溫和寒冬。

抗寒丹參與普通丹參在形態(tài)上有較大的差別，抗寒丹參基生葉多，葉密集，葉片大，不斷萌發(fā)新葉片，老葉呈墨綠色，新葉片呈新綠色，葉厚實，色濃綠，多皺折，凹凸不平，海綿組織、柵欄組織發(fā)達，寒冬、低溫不枯萎、變黃，無明顯老葉，莖較矮，莖生葉少，根外皮呈褐色，纖維較多。普通丹參基生葉較少，葉較稀疏，葉片較小，葉薄，色綠、黃綠、淺綠，皺折較少，較平坦，海綿組織、柵欄組織較發(fā)達，生長中期有明顯老葉，莖高，莖生葉多，寒冬、低溫一段時間后，地上部分枯萎、變黃，葉片從外至內(nèi)依次變黃直至枯萎，整個地上部分枯萎、變黃，第二年春季才開始萌發(fā)，根呈紫紅色，纖維較少。

2.2 丹參不同部位抗氧化酶活性比較研究

2.2.1 不同丹參根及根莖抗氧化酶活性的比較。從表1可以看出，抗寒丹參和普通丹參根及根莖在經(jīng)歷了一段時間的低溫后，其根及根莖內(nèi)的保護酶活性有差異，抗寒丹參根及根莖內(nèi)POD、CAT保護酶活性明顯高于普通丹參，而SOD酶活性則略低于普通丹參。由此可見，當?shù)⒌母o受到寒冷時，抗寒丹參為了維持其地上部分的生長所需的水分和礦質(zhì)養(yǎng)分，其根莖種抗氧化酶活性升高以保護其免受冷害、凍害威脅，寒冷季節(jié)能夠正常生長。

表1 不同丹參根莖酶活性測定的比較

2.2.2 不同丹參葉片抗氧化酶活性的比較。從表2可以看出，抗寒丹參和普通丹參經(jīng)過一段時間的低溫后，抗寒丹參葉片內(nèi)的SOD、CAT酶活性顯著高于普通丹參葉片，而POD酶活性則兩者相差甚微，研究結(jié)果表明植物酶活性與植物抗寒性具有一定的關(guān)系。

表2 不同丹參葉片抗氧化酶活性的比較

2.3 不同丹參葉片可溶性糖含量的比較 可溶性糖以及與之共存的可溶性物質(zhì)，如甘氨酸甜菜堿、脯氨酸在寒冷保護中的作用已被廣泛報道。植物學研究中一直把擬南芥作為模式植物，研究各種條件下植物的生理生態(tài)變化，Strand等就利用轉(zhuǎn)基因擬南芥研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中蔗糖磷酸合酶的超表達可促進蔗糖水平的提高，同時可以在一定程度上提高植株的耐寒性［6］。通過紫外分光光度計法，用葡萄糖作為標準品，測定抗寒丹參葉片和普通丹參葉片內(nèi)可溶性糖的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗寒丹參葉片內(nèi)的可溶性糖含量為3.55%，普通丹參葉片內(nèi)可溶性糖的含量為2.02%，兩者差異十分明顯。

3 小結(jié)與討論

試驗結(jié)果表明，抗寒丹參與普通丹參不僅在外觀形態(tài)上存在差異，其植株內(nèi)的抗氧化酶活性和可溶糖含量也存在差異?？购⑷~片濃綠、厚實、基生葉密集，根及根莖表皮褐色，多纖維;而普通丹參的葉片翠綠、稍薄、葉片稀疏，根及根莖表皮紫紅色，肉質(zhì)少纖維。植物葉片形態(tài)與抗寒性有很大關(guān)聯(lián)，抗寒植物海綿組織、柵欄組織發(fā)達，排列緊密，葉綠素多，細胞質(zhì)濃，內(nèi)含物多，抗寒植物除激素、酶活性水平較高外，還有其物質(zhì)結(jié)構(gòu)和代謝物質(zhì)基礎(chǔ)作為保證。有報道稱培育小麥壯苗壯蘗可以提高其抗寒能力［7］，但未見利用某種具體模式植物研究其形態(tài)結(jié)構(gòu)與抗寒性的關(guān)系。

Scebba等研究表明植物遇低溫會積累大量對膜和膜相關(guān)的生物大分子有害的活性氧(AOS)，而低溫馴化可使植物體內(nèi)抗氧化物酶系統(tǒng)加強，從而提高植物對活性氧的耐受力［8］。該研究發(fā)現(xiàn)，抗寒丹參葉片的保護酶活性均高于普通丹參，其中SOD和CAT酶活性有顯著性差異;抗寒丹參根莖中POD和CAT酶活性顯著高于普通丹參根莖，而SOD酶活性略低于普通丹參根莖?？购⑷~片中可溶性糖含量明顯高于普通丹參，與可溶性糖對植物冷害能起到一定保護作用的文獻報道結(jié)果相一致［9］。

綜上所述，抗寒丹參和普通丹參在形態(tài)和生理上存在差異，當抗寒丹參受到冷害、凍害時，其葉片中SOD、CAT酶以及可溶性糖含量升高，當抗寒丹參根及根莖受到冷害、凍害時，根莖中的POD和CAT含量升高，抗寒丹參有其形態(tài)、生理、抗氧化酶活性、可溶性糖含量等作為其抗寒的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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