施沖旭，張杰(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室/國家口蹄疫參考實驗室，甘肅蘭州730046)

豬繁殖與呼吸障礙綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗稱“豬藍(lán)耳”，是一種高度接觸性傳染病，主要特征是引起母豬發(fā)熱、厭食和流產(chǎn)、早產(chǎn)、木乃伊胎及弱仔等，在仔豬和生長豬均出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病和高度死亡率［1－2］。1987年在美國中西部和1990年在中歐突然出現(xiàn)，隨后該病廣泛流行于北美、歐洲等養(yǎng)豬國家和地區(qū)［3］。1991年荷蘭和美國的調(diào)查者認(rèn)定PRRSV是豬繁殖與呼吸障礙綜合征(PRRS)的致病原，PRRS是豬的一種嚴(yán)重疾?。?］。自發(fā)現(xiàn)PRRSV以來，該病毒在世界范圍內(nèi)迅速傳播，1991年第1次出現(xiàn)在我國，隨后迅速流行于全國各地［5］，目前PRRS已經(jīng)成為全球最具有經(jīng)濟(jì)意義的豬傳染病。

PRRSV是隸屬套式病毒目、動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬的單股正鏈RNA?。?］。病毒基因組長約15．4 kb，包含10個開 放 閱 讀 框 (ORFs):ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORFs 3 ～7，包括 ORF5a［7－8］。PRRSV 被分為 2 個主要的基因型:歐洲型(I型)和美洲型(II型)。PRRSV的2個基因型之間接近60% 的基因具有同源性，Lelystad(LV)和VR－2332分別是I型和II型的2個經(jīng)典代表毒株［9］。

隨著我國特有的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)毒株的出現(xiàn)，PRRS的疫情變得更加復(fù)雜。與經(jīng)典毒株相比，HPPRRSV的變異株在細(xì)胞適應(yīng)性和抗原性方面都顯著增強，能更快地在豬體內(nèi)增殖，使感染豬更早出現(xiàn)病毒血癥，致病性和致死性能力也顯著增強［10－11］。迄今為止，HP-PRRSV毒株在我國的豬群中依然存在，再加上一些中小型養(yǎng)豬場又存在管理不規(guī)范的問題，致使HP-PRRS的疫情在我國一些地方依然很嚴(yán)重［12］，使HP-PRRSV毒株變成近年來在我國流行的優(yōu)勢毒株［11，13］。最近又出現(xiàn)了高毒力歐洲毒株(如Lena［14－15］)和高致病性美洲毒株(如 JXA1［10］、HLJA1［16］和HLJB1［17］)，使 PRRSV 顯得更加神秘，也給養(yǎng)豬業(yè)造成更嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

為了研究青海PRRSV毒株對細(xì)胞的適應(yīng)性和增殖速率以及致病性強弱和毒力，筆者以PRRSV青海毒株、海利和諾倍威CH-1R弱毒疫苗株、吉林GW-HR毒株及其在Marc-145細(xì)胞上的傳代毒株為研究對象，對4種毒株及其傳代毒株的TCID50值和細(xì)胞病變作用(CPE)出現(xiàn)的時間進(jìn)行比較，探討了PRRSV青海毒株對Marc-145細(xì)胞的適應(yīng)性及其在Marc-145細(xì)胞內(nèi)的增殖速率以及該毒株的毒力。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞與毒株 Marc-145細(xì)胞來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心;PRRSV青海株由家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室分離并鑒定;CH-1R弱毒疫苗株分別購于上海海利生物技術(shù)股份有限公司和浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司;GW-HR株由家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室保存。

1．2 主要試劑 DMEM(高糖)培養(yǎng)基，購自GIBCO公司;胎牛血清，購自PAA公司;胰蛋白酶(含EDTA)，購自Bostar公司;1×PBS，購自Sigma公司;臺盼藍(lán)，購自Amresco公司;青鏈霉素雙抗，購自Hyclone公司;25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、六孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，購自Corning公司;FITC標(biāo)記的PRRSV N蛋白的單抗SR30F，購自Rural technologies，Inc(RTI)公司;多聚甲醛，購自Alorich公司。

1．3 Marc-145細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 將試驗用的1XPBS和含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基置于37℃水浴鍋中預(yù)熱。選取健康的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng);棄掉細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)基，用1×PBS(0．01 mol/L，pH 為7．2)清洗1 ～2 次，然后加入Bostar胰酶進(jìn)行消化，在37℃溫箱消化4 min左右，觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)圓縮并且彼此分離的現(xiàn)象時，說明細(xì)胞已經(jīng)消化完全;棄掉消化液，加入5 ml左右含10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞后，用移液槍吸出少量細(xì)胞懸液，用臺盼藍(lán)染色后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù);最后，根據(jù)計數(shù)的結(jié)果將細(xì)胞用新鮮的含10%FBS和1%雙抗的DMEM稀釋成1×106個/ml的密度，分裝于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶10 ml，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．4 PRRSV的增殖 傳代培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞，細(xì)胞生長密度達(dá)到80%左右可進(jìn)行接毒試驗。PRRSV青海株為細(xì)胞毒，常溫融化后可直接進(jìn)行接毒;CH-1R株用疫苗伴侶溶液融化后接毒。棄去細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)基，用1×PBS清洗2次(目的是洗去細(xì)胞瓶中的血清，避免血清對接毒試驗造成影響);根據(jù)TCID50計算的細(xì)胞毒價，各組分別按照MOI=0．5、1．0、1．5 和 2．0 的接毒量接毒，將接毒后的細(xì)胞放入37℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h(使病毒與細(xì)胞充分接觸);然后棄去細(xì)胞瓶中PRRSV毒液，再加10 ml左右含5%PAA血清的DMEM，37℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每天觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)CPE達(dá)到80%時收獲病毒。將細(xì)胞瓶放入－80℃，反復(fù)凍融3次后，2 000 g 4℃離心30 min，取上清，用0．22 μm 的濾膜過濾除菌，分裝后 －80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 病毒滴度的測定 采用TCID50方法測定病毒滴度，具體步驟如下:①鋪板，將在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中長成單層的Marc-145細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)溫的PBS沖洗2遍，隨后加入適量胰酶消化液，37℃培養(yǎng)箱消化4 min左右即可;調(diào)整消化好的Marc-145細(xì)胞密度為1×105個/ml，用八孔排槍加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μl，置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②大約24 h后細(xì)胞長成單層，小心吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，并用1×PBS清洗96孔板中的細(xì)胞2遍，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基將PRRSV病毒液進(jìn)行連續(xù)10倍的稀釋，稀釋梯度為10－10～100。③將稀釋好的病毒液加入到 Marc-145單層細(xì)胞孔內(nèi)，每個稀釋度接種8孔(一縱排)，每孔接種病毒液100 μl，用正常不接毒的細(xì)胞作對照。5%CO2的37℃培養(yǎng)箱吸附1 h后，加入細(xì)胞維持液(5%胎牛血清的DMEM)，100 μl/孔，5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。④每隔24 h觀察1次，一般需要觀察5～7 d。⑤根據(jù)CPE出現(xiàn)的情況，采用Reed-Muench法計算病毒TCID50。

2 結(jié)果與分析

2．1 Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)不同時間段的形態(tài)觀察 Marc-145細(xì)胞按照1×106個/ml的密度傳代分裝于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中后，約48 h生長密度達(dá)到100%，可再次進(jìn)行傳代，所以采集了3個不同時間點的細(xì)胞形態(tài)(圖1)。

2．2 PRRSV不同毒株各代次的TCID50值 4株P(guān)RRSV體外傳代各代次logTCID50值，青海PRRSV傳代毒F1～F10代logTCID50值范圍為10－9．25～10－4．75個/ml;GW-HR 株F1 ～ F10代 logTCID50值范圍為 10－9．2～10－4．7個/ml;海利 CH-1R F1 ～F10 代 logTCID50值范圍為 10－8．8～ 10－4．25個/ml，諾倍威 CH-1R F1 ～ F10 代 logTCID50值范圍為10－7．6～10－3．35個/ml;應(yīng)用Graphpad軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。從圖2可以看出，QH08株的TCID50在F4代和F5代之間有顯著增加(P＜0．005)，到 F8 代時達(dá)到最高毒價 10－9．25個/ml，F(xiàn)9 代和 F10代已經(jīng)趨于穩(wěn)定。圖3是QH08株的F1代到F10每一代都與GW-HR株、HILE株和諾倍威毒株同時比較得出的結(jié)果。與GW-HR株相比，F(xiàn)2代F8代都有顯著性差異，只有F1代、F9代和F10代沒有，說明QH08株在F2～F8代的TCID50值顯著高于GW-HR株。與HILE株和諾倍威株相比，F(xiàn)1～F10每一代的TCID50值都有顯著性差異，并且P值都小于0．000 1，說明QH08株的毒力明顯高于HILE和諾倍威毒株。這說明QH08株的毒力隨著體外傳代的增加而增加，說明毒株逐漸適應(yīng)Marc-145細(xì)胞的生長環(huán)境，但是病毒毒力的增加是有限度的，在F8代已趨于穩(wěn)定。通過與其他毒株的比較，發(fā)現(xiàn)QH08株每一代的毒力都明顯高于HILE和諾倍威CH-1R株，F(xiàn)2～F8代高于GW-HR株，說明QH08株的毒力最強。

表2 PRRSV不同毒株體外傳代各代次感染Marc-145細(xì)胞CPE產(chǎn)生的時間

2．3 不同毒株各代次CPE出現(xiàn)的時間 共選取了4株P(guān)RRSV，4株毒株分別在Marc-145細(xì)胞上傳了10代，分別觀察CPE出現(xiàn)的時間。由表2可知，QH08株和GW-HR F1～F4代CPE出現(xiàn)的時間主要集中在35 h左右，而伴隨著毒株代次的增加，傳代毒株在Marc-145細(xì)胞上CPE出現(xiàn)的時間提前，F(xiàn)10代出現(xiàn)CPE的時間已經(jīng)穩(wěn)定在26h左右。從F1代到F10代，病毒在細(xì)胞上出現(xiàn)CPE的時間縮短10 h，即毒株逐漸適應(yīng)了Marc-145細(xì)胞上的生長環(huán)境。海利CH-1R株F1～F4代CPE出現(xiàn)的時間主要集中在43 h左右，到F10代CPE出現(xiàn)的時間穩(wěn)定在31 h，F(xiàn)1代到F10代CPE出現(xiàn)的時間提前了14 h左右。諾倍威CH-1R株F1～F4代CPE出現(xiàn)的時間主要集中在50 h左右，F(xiàn)5～F10代的CPE時間穩(wěn)定在42 h左右，隨著毒株體外傳代代次的增加，CPE出現(xiàn)的時間提前了12 h左右。與QH08株和GW-HR株相比，從F1代到F10代海利CH-1R株CPE出現(xiàn)的時間提前了14 h，諾倍威CH-1R株CPE出現(xiàn)的時間提前了12 h，QH08株和GWHR株在細(xì)胞上出現(xiàn)CPE的時間只縮短了10 h左右，說明海利和諾倍威CH-1R對Marc-145細(xì)胞的適應(yīng)性比QH08株和GW-HR株強，原因可能是海利和諾倍威CH-1R都是弱毒疫苗，弱毒疫苗的生產(chǎn)都是經(jīng)過在Marc-145細(xì)胞上多次傳代制備的，所以海利和諾倍威CH-1R株對細(xì)胞的適應(yīng)性更強。從F1代到F10代，QH08株在細(xì)胞上CPE出現(xiàn)的時間都是最早的，說明QH08株對Marc-145細(xì)胞的致病性比其他3株都強。

3 討論

高致病性PRRS現(xiàn)在仍然是對我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害的頭號疫病，目前疫苗接種是對該病預(yù)防和控制的最有效方法［18］。筆者選用的CH-1R株就是由PRRSV通過連續(xù)性傳代致弱獲得的弱毒疫苗，PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞變圓，細(xì)胞之間有間隙。不同毒株在Marc-145細(xì)胞上所引起的細(xì)胞病變也有明顯區(qū)別，如接種青海毒株和GW-HR的Marc-145細(xì)胞中病變的細(xì)胞聚集呈叢狀，而諾倍威引起的細(xì)胞病變多是均勻的拉網(wǎng)式。此外，隨著PRRSV在Marc-145細(xì)胞上傳代代次的增加，病毒對細(xì)胞的適應(yīng)性逐漸增強，且增殖速率加快，CPE出現(xiàn)的時間提前(F10代較F1代約提前了9 h)。海利CH-1R弱毒疫苗株從F1代到F10代CPE出現(xiàn)的時間提前了14 h左右，諾倍威CH-1R弱毒疫苗株CPE出現(xiàn)的時間提前了12 h，QH08株和GW-HR株在細(xì)胞上出現(xiàn)CPE的時間只縮短了10 h左右，CPE出現(xiàn)時間的提前說明病毒對細(xì)胞的適應(yīng)性逐漸增強，且增殖速率加快。因為海利和諾倍威CH-1R株從F1代到F10代CPE出現(xiàn)的時間縮短了14 h，而QH08株只縮短了10 h，這說明海利CH-1R弱毒疫苗株和諾倍威CH-1R弱毒疫苗株對Marc-145細(xì)胞的適應(yīng)性比QH08株和GW-HR株強，原因可能是海利和諾倍威CH-1R都是弱毒疫苗，弱毒疫苗都是Marc-145細(xì)胞經(jīng)過多次傳代制備而成的，所以海利和諾倍威CH-1R株對細(xì)胞的適應(yīng)性更強。但是，從F1代到F10代，QH08株在細(xì)胞上CPE出現(xiàn)的時間都是最早的，說明QH08株對Marc-145細(xì)胞的致病性比其他3株都強。

在TCID50試驗中，通過多組培養(yǎng)比對，去掉差異顯著值后取均值判斷，不同PRRSV株傳代毒F1～F10代TCID50值的總趨勢為漸變上調(diào)的趨勢，間接表明PRRSV隨著代次的增加，在相同時間、相同條件下培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞中復(fù)制能力增強。QH08毒株及其體外傳代毒株的TCID50在F4代和F5代之間有顯著增加(P＜0．005)，當(dāng)體外傳至F8代時達(dá)到最高毒價(10－9．25個/ml)，F(xiàn)9代和 F10代已經(jīng)趨于穩(wěn)定。與GW-HR株相比，F(xiàn)2代到F8代都存在顯著差異，只有F1代、F9代和F10代沒有明顯差異，說明QH08株從F2到F8代的TCID50值顯著高于GW-HR株。與HILE株和諾倍威株相比，從F1代到F10代每一代的TCID50值都存在顯著差異，并且P值都小于0．000 1，說明QH08株的毒力明顯高于HILE和諾倍威毒株。這說明QH08株的毒力隨著體外傳代代次的增加而增加，說明毒株逐漸適應(yīng)在Marc-145細(xì)胞的生長環(huán)境，但是病毒毒力的增加是有限度的，在F8代時已趨于穩(wěn)定。通過與其他毒株的比較，發(fā)現(xiàn)QH08株的毒力每一代都明顯高于HILE和諾倍威CH-1R株，F(xiàn)2～F8代高于GWHR株，說明QH08株的毒力最強。

PRRSV的感染具有階段性，一般感染后CPE出現(xiàn)的時間和初始病毒感染量(MOI值為0．5～2．0)的關(guān)系不大，出現(xiàn)CPE的時間與病毒復(fù)制周期的縮短和釋放時間的減少有關(guān)。PRRSV從F1代到F10代CPE首先出現(xiàn)的時間呈現(xiàn)逐漸縮短到的趨勢，說明隨著PRRSV毒株代次的增加，病毒在Marc-145細(xì)胞上復(fù)制周期也在逐漸縮短。PRRSV不同毒株F10代較F1代的復(fù)制周期都縮短了12 h左右，表明PRRSV不同毒株F10代都比F1代在Marc-145細(xì)胞中的復(fù)制能力更強。此外，與海利和諾倍威CH-1R相比，QH08株F1～F10代傳代毒株CPE出現(xiàn)的時間都是最早的，QH08株在Marc-145細(xì)胞上傳到F10代時，CPE出現(xiàn)的時間穩(wěn)定在26 h左右，這表明與其他3個毒株相比，PRRSV青海株在Marc-145細(xì)胞中的復(fù)制能力更強，對細(xì)胞的適應(yīng)性較強，增殖速率較快，在致病力和毒力方面也較強。

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