黃玉蘭 (黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，黑龍江大慶163319)

黃瓜(Cucumis sativus L．)是葫蘆科黃瓜屬1年生蔓生草本植物，是我國主要的蔬菜作物之一。黃瓜播種面積和總產(chǎn)量在我國主要蔬菜中位居前列［1］。近年來，隨著我國保護地黃瓜栽培面積的逐漸擴大，黃瓜病害、連作障礙和種性退化現(xiàn)象嚴重［2］。因此，“優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗、生態(tài)、高效”黃瓜新品種的選育迫在眉睫。農(nóng)藥作為補救性措施雖然得到了廣泛的應(yīng)用，同時也帶來了農(nóng)藥殘留和人體內(nèi)毒性積累的問題。為適應(yīng)不良環(huán)境，植物本身有多種反擊有害生物侵害的方法，利用次級代謝產(chǎn)物驅(qū)蟲，阻止病菌的侵染就是一種重要的化學防御措施，其中黃酮類和三萜類皂苷是植物抗病蟲侵害的2類重要的次生代謝物質(zhì)［3－5］。

絞股藍(Gynostemma pentaphyllum)是多年生蔓生藤本，為葫蘆科植物，有“南方人參”和“第二人參”的美譽，別名小苦藥、公羅鍋底、五葉藤、遍地生根、甘茶蔓等［6－7］。有研究表明，絞股藍黃酮類和三萜類化合物的含量較高，絞股藍中僅8種黃酮含量就高達2．4 mg/g，僅18種三萜類皂苷含量高達89．9 mg/g［8］。林毅等研究表明，中草藥絞股藍具有廣譜的抗植物病毒活性和抵抗多種植物病原真菌以及農(nóng)業(yè)害蟲的活性，為培育抗病蟲作物新品種提供了新資源［9］。如果將絞股藍黃酮和三萜類化合物高效的合成能力及抗病蟲能力轉(zhuǎn)移到黃瓜上，黃瓜的抗病蟲防衛(wèi)能力將有可能增強。為此，筆者通過植物外源遺傳物質(zhì)動態(tài)導(dǎo)入法［9］，選取絞股藍染色體作為供體，黃瓜原生質(zhì)體作為受體，采用電擊法將絞股藍染色體轉(zhuǎn)至黃瓜原生質(zhì)體細胞中，研究了其調(diào)控黃瓜次生代謝產(chǎn)物的作用，以期為黃瓜育種工作提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 供試植物。絞股藍種子購自安康平利縣百草堂科技有限公司絞股藍種質(zhì)資源圃基地;黃瓜品種“津研4號”由黑龍江八一農(nóng)墾大學植物科學技術(shù)學院提供。

1．1．2 試劑。甘露醇(天津市福晨化學試劑廠)、纖維素酶(Onozuka R-10，日本 Yakult公司)、果膠酶(Macerozyme R-10，日本 Yakult公司)。

1．1．3 儀器。HZS-H水浴振蕩器;UV-2100型紫外可見分光光度計;GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機;TGL-16G臺式離心機;恒壓、恒流DF-D電泳儀;UV-ⅥA型紫外透射反射儀;Shimadzu LC2010HT高效液相色譜儀、LCsolution色譜工作站(日本島津公司);多功能細胞電穿孔儀。

1．2 方法

1．2．1 絞股藍懸浮細胞培養(yǎng)及莖段染色體片段的分離制備［10－11］。取絞股藍無菌苗的葉片和莖段為外植體，切成0．5 cm小段培養(yǎng)在1．0 mg/L 6-BA+1．0 mg/L NAA組合的MS培養(yǎng)基上進行愈傷組織常規(guī)誘導(dǎo)，選擇最佳的激素配比進行愈傷組織的增殖培養(yǎng)，調(diào)控6-BA和NAA的濃度將增殖培養(yǎng)的愈傷組織繼代培養(yǎng)成胚性愈傷組織。將胚性愈傷組織接種液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，獲得絞股藍懸浮細胞。

取相對飽滿的懸浮細胞用質(zhì)量百分比為0．1%的秋水仙素處理16 h，用MS培養(yǎng)基洗滌后稱10 g放入100 ml裂解液中，解離絞股藍懸浮細胞的細胞壁和細胞質(zhì)膜10 h;采用蔗糖密度梯度離心對懸浮細胞細胞核純化，過濾，1 500×g離心濃縮細胞核，低溫保存;將收集到的細胞核用75 mmol/L氯化鉀4℃低滲10 min，1 000 r/min離心10 min，沉淀懸于0．75 mol/L 1，6-己二醇的CPW緩沖溶液上37℃水浴10 min，再用7號針頭10 ml注射器推擠。將染色體溶液置于25%蔗糖溶液中，500×g離心60 min，大量染色體都集中在25%蔗糖界面上。

1．2．2 黃瓜原生質(zhì)的制備與純化。選取植株頂端未充分展開的幼嫩子葉，用清水沖洗干凈，75%乙醇浸泡數(shù)秒，再用0．1%HgCl2溶液消毒7 min，然后用無菌水清洗4～5次，撕下葉片下表皮，并將去掉下表皮一面置于盛有酶液培養(yǎng)皿中，在黑暗條件下25℃恒溫搖床上50 r/min振蕩，以分離原生質(zhì)體。

1．2．3 絞股藍染色體片段轉(zhuǎn)染黃瓜原生質(zhì)體。受體:黃瓜原生質(zhì)體。DNA供體:分離純化的染色體。采用多功能細胞電穿孔儀器。使用參數(shù):脈沖電壓100～500 V，脈沖時間20～100 μs，脈沖寬度20 ～60 μs，脈沖次數(shù)1 ～5。電轉(zhuǎn)染緩沖液:0．5 mol/L 蔗糖、10 mmol/L CaCl2，10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4(pH 6．0)和0．03% 葡聚糖硫酸鉀。用轉(zhuǎn)染緩沖液調(diào)整原生質(zhì)體或細胞核濃度至1×107～5×107個/ml，取0．8 ml于每個 Eppendorf管中，加入10～50 μg供體染色體，混勻，置冰上10 min。然后將原生質(zhì)體－染色體懸液轉(zhuǎn)入電擊小室，迅速放入電融合儀進行脈沖電擊，將轉(zhuǎn)染后收集原生質(zhì)體進行看護培養(yǎng)。

1．2．4 轉(zhuǎn)染子的培養(yǎng)與再生愈傷組織的誘導(dǎo)。以平皿固體培養(yǎng)基上生長旺盛的黃瓜愈傷細胞為看護者，其上覆蓋2張中速濾紙，將轉(zhuǎn)染子與融合子置于其上培養(yǎng)。經(jīng)過篩選培養(yǎng)條件:黑暗，(25±1)℃，空氣相對濕度為60% ～70%。培養(yǎng)基為KM8P添加0．5 mol/L甘露醇、30 g/L葡萄糖、0．03%葡聚糖硫酸鉀、0．5 mg/L 2，4-D 和 1．0 mg/L 6-BA。培養(yǎng) 15 ～30 d后，2，4-D減半，甘露醇減半，調(diào)控不同的激素濃度誘導(dǎo)出再生愈傷組織。

1．2．5 再生愈傷組織中總黃酮和人參皂苷Rb1檢測。采用分光光度法，以蘆丁對照品配制標準溶液，于510 nm波長下比色定量測定再生愈傷組織中總黃酮吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，得蘆丁濃度(Y)與吸光度(A)的關(guān)系曲線的回歸方程:Y=0．101 7A－0．001 6。相關(guān)系數(shù) r=0．998 2，蘆丁濃度與吸光度有良好的相關(guān)性。

采用HPLC法，以流動相為乙腈(a)－水(b)梯度洗脫(0～10 min，15%a→20%a;10 ～40 min，20%a→40%a;40 ～60 min，40%a～15%a)，流速為1 ml/min，檢測波長為203 nm，柱溫30℃的條件對標品和各樣品進行梯度洗脫，測其再生愈傷組織人參皂苷Rb1的含量。

2 結(jié)果與分析

2．1 絞股藍懸浮細胞培養(yǎng)及染色體的分離 在優(yōu)化的培養(yǎng)基上對絞股藍愈傷組織進行細胞的懸浮培養(yǎng)，懸浮細胞可不斷增殖，狀態(tài)良好。其胚性愈傷組織培養(yǎng)的懸浮細胞見圖1。將絞股藍懸浮細胞預(yù)處理和酶解去除細胞壁細胞膜，經(jīng)抽濾、自然沉降、離心等方法得到絞股藍染色體(圖2)。

2．2 黃瓜原生質(zhì)體的制備分離與純化 圖3是由懸浮培養(yǎng)的“津研4號”黃瓜胚性細胞經(jīng)酶解制備的原生質(zhì)體，原生質(zhì)體的產(chǎn)率和完整率都較高，獲得了高質(zhì)量的原生質(zhì)體，建立了黃瓜原生質(zhì)體的制備和培養(yǎng)等方法。

圖1 絞股藍懸浮細胞

圖2 絞股藍染色體

2．3 轉(zhuǎn)染子的培養(yǎng)與再生愈傷組織的誘導(dǎo) 轉(zhuǎn)染后的原生質(zhì)體培養(yǎng)采用的是固體薄層培養(yǎng)法，將3～4 ml的原生質(zhì)體按照一定細胞密度(1×104～1×105個/L)與等體積的處于45℃的瓊脂培養(yǎng)基混合，在培養(yǎng)皿中制成薄層固體平板，在含0．5 mg/L 2，4-D、1．0 mg/L 6-BA 的MS 固體培養(yǎng)基上長成結(jié)構(gòu)致密的帶綠點大塊愈傷組織(圖4)。

圖3 純化的原生質(zhì)體

2．4 愈傷組織中黃酮化合物含量的測定 由表1可知，侵染絞股藍DNA的再生黃瓜愈傷組織中總黃酮含量高于對照組，其再生愈傷組織總黃酮含量高達1．248%，比對照組高出4．38%，也明顯高于蔡健等測得的含量［12］。

2．5 再生愈傷組織人參皂苷Rb1含量的測定 測定結(jié)果表明，侵染絞股藍黃瓜愈傷組織中含有絞股藍人參皂苷Rb1達(0．92 ±0．07)mg/g，雖然含量很低，但可以說明絞股藍中某些成分對黃瓜的次級代謝產(chǎn)物起了一定的作用，具體如何調(diào)控還有待于進一步研究。

圖4 再生愈傷組織

表1 愈傷組織中黃酮化合物含量的比較

圖5 絞股藍皂苷Rb1標品色譜

圖6 轉(zhuǎn)染組愈傷組織樣品色譜

轉(zhuǎn)染組愈傷組織樣品液相色譜分離情況按“1．2．5”色譜條件測定，比較人參皂苷Rb1標準品及轉(zhuǎn)染組色譜(圖5、6)，可以看出在該試驗條件下色譜峰分離良好。在保留時間為11．198 min時出現(xiàn)人參皂苷Rb1的峰值，是否存在其他皂苷還有待于進一步研究。

2．5．1 線性關(guān)系的考察。分別取絞股藍皂苷Rb1標準品5、10、15、20 和 25 μl進樣，在相同條件下測定，以峰面積(y)為縱坐標，進樣量(x)為橫坐標做標準曲線，計算回歸曲線性方程:y=324 161x－244 034，r=0．999 8，表明進樣量在 0．5 ～2．5 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．5．2 精密度試驗。量取對照溶液，按“1．2．5”色譜條件連續(xù)進樣5次，測定峰面積的相對標準偏差(RSD)為1．02%。

2．5．3 重現(xiàn)性試驗。取供試品1份，按供試品溶液制備方法平行制備5份并測定。測定含量的RSD為2．18%，表明重現(xiàn)性較好。

2．5．4 回收率試驗。取同一樣品6份，分別加入人參皂苷Rb1對照品2 mg，按照供試品溶液制備方法，進樣10 μl，測定含量，計算平均回收率為98．20%，RSD為2．20%。

2．5．5 含量測定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組愈傷組織人參皂苷Rb1含量為 1．04 mg/g。

3 討論

外源DNA導(dǎo)入一些物種可以達到基因轉(zhuǎn)移的目的，其可靠性和可行性已經(jīng)在水稻、野生大豆外源DNA導(dǎo)入研究中得到驗證［13－15］。而絞股藍和黃瓜同屬葫蘆科植物，在次生代謝的調(diào)節(jié)上有很多共同之處，它們的甲羥戊酸途徑是比較活躍的，能夠較好地合成距離人參皂苷非常近的前體物2，3-氧化鯊烯［16］。然而絞股藍在黃酮和皂苷上的代謝上要遠比黃瓜活躍。

該研究將絞股藍懸浮細胞預(yù)處理和酶解去除細胞壁細胞膜，經(jīng)抽濾、自然沉降、離心等方法得到絞股藍染色體，為絞股藍染色體轉(zhuǎn)染黃瓜原生質(zhì)體提供了較好的受體。試驗結(jié)果表明，黃酮含量高于對照組，轉(zhuǎn)染組愈傷組織中黃酮含量比對照組高出4．38%。而且在轉(zhuǎn)染組還含有人參皂苷Rb1，雖然含量較低，但可以說明絞股藍種皂苷成分可能對黃瓜的次級代謝產(chǎn)物的調(diào)控起了一定的作用，可能就是甲羥戊酸途徑中距離人參皂苷非常近的前體物——2，3-氧化鯊烯所調(diào)控，具體的調(diào)控機制還有待于進一步研究。

該研究采用電轉(zhuǎn)染試圖將絞股藍染色體轉(zhuǎn)染至黃瓜原生質(zhì)體，并經(jīng)過經(jīng)看護培養(yǎng)誘導(dǎo)出再生愈傷組織，經(jīng)分光光度檢測轉(zhuǎn)染組黃酮含量比對照組高，尤其是再生黃瓜愈傷組織中檢測到絞股藍人參皂苷Rb1。利用該項技術(shù)實現(xiàn)作物科間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移在一定條件下是可能的，同時為黃瓜的種質(zhì)資源創(chuàng)新及育種提供了理論與技術(shù)依據(jù)。

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