任冬雪 成剛 李濤 王茜 路一平 趙海南(.北京中醫(yī)藥大學東方學院，

河北 廊坊 065001；2.北京燕山玉龍石化工程有限公司， 北京 102500）

0 引言

白芍為茅根科多年生草本芍藥的干燥根。味苦酸，性涼；入肝、脾經(jīng)，對胸腹脅肋疼痛，瀉痢腹痛，自汗盜汗，陰虛發(fā)熱，月經(jīng)不調等癥有較好治療效果[1]。白芍的主要成分是芍藥苷，然而芍藥苷的藥用開發(fā)目前還有很多工作要做，如改進分離、提取工藝，以獲得更多的有效成分。本試驗通過改變芍藥苷前處理方法，簡化實驗步驟，并通過改變洗脫溶劑，盡可能多的除去雜質，以減小試驗系統(tǒng)誤差、增加實驗的準確度、同樣使樣品得到更好的分離，并延長色譜柱使用壽命，為白芍提取物的含量測定提供簡便可行的方法。

1 超高效液相色譜(UPLC）

超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography/UPLC)是分離科學中的一個全新類別，其原理與高效液相色譜法基本相同。UPLC借助于HPLC(高效液相色法)的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。目前，超高效液相色譜儀已經(jīng)開始逐漸地投入液相實驗中。主要應用于藥物分析(如天然產(chǎn)物中復雜組分的分析）[2]、生化分析(如蛋白質、多肽、代謝組學等生化樣品）、食品分析(如食品中農(nóng)藥殘留的檢測）[3]和環(huán)境分析(如水中微囊藻毒素的檢測）[4]，此外，還用于化妝品中違禁品的檢測。

超高效液相色譜儀尤其對中藥研究領域的發(fā)展是一個極大的促進。中藥的組分復雜，分離困難等問題都可以通過超高效液相色譜法逐漸解決。

2 實驗部分

2.1 儀器與藥品

實驗儀器:萬分之一電子天平；超高效液相色譜儀；Waters UPLC ；Waters T3。

實驗藥品:芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供）；甲醇(分析純）；甲醇(色譜純）。

2.2 實驗方法

(1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

實驗是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；以甲醇-異丙醇-檸檬酸水溶液(5mol/L）(18∶2∶80）為流動相；檢測波長240nm；理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應不低于4000。配制流動相用甲醇及異丙醇采用色譜純，其余試藥及溶劑采用分析純。

(2）對照品溶液的制備

精密稱定芍藥苷對照品10mg，置50ml容量瓶中，加80%甲醇溶解，定容，搖勻，精密量取5ml于50ml的容量瓶中，加80%甲醇制成每1ml含芍藥苷20μg的溶液，搖勻即得。

(3）供試品溶液的制備

取本品 0.08g(天平:萬分之一），精密稱定于25ml容量瓶中，加入80%甲醇適量，超聲處理使充分溶散，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2ml至25ml量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22um濾膜，即得。

(4）測定法

精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μL，依次注入超高效液相色譜儀，測定，根據(jù)色譜圖的積分值按公式進行計算，即得。

3 實驗結果與討論

3.1 線性和范圍

以峰面積為縱坐標，以對照品進樣濃度(mg/ml）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性方程相關系數(shù)r，r≥0.999。

3.2 重復性

取同一批號樣品，平行制備6份供試品溶液，并按其色譜條件進行測定，計算6份樣品測定結果的RSD值。經(jīng)測定白芍提取物中芍藥苷的平均含量為75.4mg/g，RSD%=0.61%，重復性良好。

3.3 穩(wěn)定性

制備對照品溶液，進行對照品溶液穩(wěn)定性實驗。分別在0、2、4、8、16、24小時進樣測定，計算峰面積的RSD 值。經(jīng)計算芍藥苷對照品溶液在24小時內(nèi)進樣峰面積的RSD分別為1.8%，24小時內(nèi)穩(wěn)定。

供試品溶液穩(wěn)定性實驗方法同上，經(jīng)計算芍藥苷供試品溶液在24小時內(nèi)進樣峰面積的RSD分別為1.2%，24小時內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 回收率

采用加入50%量的對照品，以同一批6份樣品測定結果進行評價。

取同一批白芍浸膏約0.04g，精密稱定，再分別精密加入濃度為32.02mg/ml的對照品溶液10ml，相當于加入芍藥苷對照品3.202mg。按照供試品制備方法制備供試品溶液，并進行測定。結果如下表1。

表1 芍藥苷加樣回收率結果

結論:平均回收率為98.2%，RSD為1.4%，準確度良好。

3.5 耐用性

按照上述實驗方法和條件，分別用2種色譜柱(色譜柱①Waters T3；色譜柱② Waters BEHC18）對一批樣品芍藥苷含量進行測定，觀察不同色譜柱對含量測定的影響。經(jīng)觀察兩種色譜柱測得芍藥苷含量的相對平均偏差為0.53%，耐用性良好。

取3批樣品，按同樣方法及色譜條件進行檢測，結果見表2。結果顯示樣品測定中兩份平行相對樣品的相對平均偏差均小于2.0，耐用性良好。

表2 耐用性樣品測定結果

4 結語

本文通過超高效液相色譜法對白芍浸膏芍藥苷含量測定方法進行驗證，包括線性與范圍、精密度、重復性、溶液穩(wěn)定性、準確性(即回收率）、耐用性及樣品含量測定。實驗結果顯示利用UPLC方法測定芍藥苷的含量有很多優(yōu)點，如可以提高實驗效率，簡化實驗步驟，減小實驗系統(tǒng)誤差、增加實驗的準確度，使樣品得到更好的分離，提高分離度，為白芍提取物含量測定提供了簡便可行的方法。

[1]黃兆勝，中藥學[M].人民衛(wèi)生出版社,2011,452.

[2]王蕓.復雜天然產(chǎn)物特征組分HPLC篩選方法的研究[M].華東理工大學,2011.

[3]Chen L.G.,Lan D.,Jin H.Y.et al.The determination of organochlorine pesticides based on dymanic microwave-assisted extraction coupled with on-line solid-phase extraction of highperformance liquid chromatography[J].Analytic Chimica Acta,2007,589:239-246.

[4]張立將，尹立紅，等.水中微囊藻毒素高效液相色譜檢測與前處理條件優(yōu)化[J].東南大學學報(自然科學版),2005,3:446-451.