張貽榮，黃世杰，劉云高

福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院晉江分院/福建省晉江市醫(yī)院檢驗科,福建晉江362200

熒光定量PCR與ELISA法檢測兒童肺炎支原體感染的方法比較

張貽榮，黃世杰，劉云高

福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院晉江分院/福建省晉江市醫(yī)院檢驗科,福建晉江362200

目的探討實時熒光定量PCR與ELISA血清學兩種方法學在診斷兒童肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae, MP）感染中所具有的臨床診斷價值。方法對2013年1月—2014年12月在該院兒科門診和住院治療并懷疑MP感染的嬰幼兒及兒童，均常規(guī)采集咽拭子或痰標本和EDTA抗凝血2 mL的標本共計1 590例，分別用于熒光定量PCR法MP-DNA和ELISA法MP-IgM抗體的檢測，并對兩組實驗結果進行比較分析。結果結果顯示MP-DNA陽性共計168例，占10.6%；而MP-IgM陽性共計459例,占28.9%，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論實時熒光定量PCR法與ELISA血清學方法對診斷兒童MP感染有著各自的優(yōu)勢，但PCR法的假陽性率低于ELISA血清學方法，更適合用于兒童肺炎支原體感染的早期診斷，若兩種方法同時進行，則可以提高臨床診斷的準確性。

實時熒光定量PCR；ELISA；肺炎支原體

肺炎支原體(Mycoplasma pneumaniae,MP)主要侵犯呼吸系統(tǒng)，常伴有上呼吸道感染的癥狀，三分之一的感染者可致肺炎，患兒感染潛伏期為2～3周，在家庭及學校和幼兒園中傳播易見，個別患兒可引發(fā)肺外并發(fā)癥，包括腦膜炎、橫斷性脊髓炎、心包炎、關節(jié)炎和皮膚黏膜損害等，是兒童急性呼吸道感染的主要病原體[1]。近幾年，在嬰幼兒及兒童人群中，由肺炎支原體引起的呼吸道感染有所上升，如何進行及時有效的診斷，是臨床常須面對的問題。熒光定量PCR法和ELISA法作為實驗室診斷兒童肺炎支原體感染常用的指標，經(jīng)常由于兩種檢測方法敏感性和特異性之間的差異，使在同一患兒身上仍有可能出現(xiàn)兩種并不一致的結果[2]。為了探討MP-DNA和MP-IgM兩種方法在兒童早期感染肺炎支原體后，哪種方法更具有診斷價值，收集了2013年1月—2014年12月在該院門診和住院治療并懷疑MP感染的嬰幼兒及兒童患者共計1 590例進行了MP-DNA和MP-IgM的檢測，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在該院兒科門診就診和收治住院的患兒中，收集疑似肺炎支原體感染的嬰幼兒及兒童共計1 590例，均進行了MP-DNA和MP-IgM的檢測，其中男810例，女780例，年齡0～14周歲。

1.2 儀器與試劑

無菌痰杯和咽拭子購自浙江省拱東醫(yī)療科技有限公司，肺炎支原體核酸檢測試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供，MP-IgM抗體ELISA檢測試劑盒購自歐蒙醫(yī)學診斷股份公司，主要儀器有美國ABI公司生產(chǎn)的ABI 7300型全自動熒光定量PCR擴增儀和伯樂公司生產(chǎn)的Bio-Rad 680型酶標儀等。

1.3 方法

1.3.1 標本采集咽拭子采集：用無菌拭子采集患兒的扁桃體、咽部及咽后壁的分泌物后密封送檢，采集時應避免碰舌面及口腔內(nèi)其它部位。痰標本采集：由于患兒常無法自行咳痰，可用負壓吸痰器吸取痰標本置無菌痰杯后送檢。血漿標本采集：靜脈穿刺采集2 mL靜脈血注入EDTA抗凝管中上下混勻，3 000 rpm離心5 min，取上層液體即為血漿標本。

1.3.2 咽拭子或痰MP-DNA檢測采用熒光定量PCR法，＞500 copies為陽性。具體步驟：取1.5 mL的無菌離心管，加入1 mL生理鹽水，放入拭子并充份震蕩，擠干棉拭子里的液體，立即離心或置4℃冰箱備用；痰標本中加入4倍痰體積的生理鹽水，充分震蕩或用1 mL的槍頭反復吸打后置4℃冰箱過夜，使痰充分液化；將處理好的咽拭子標本或吸取液化好的痰標本1～1.5 mL的離心管中，12 000 rpm離心5 min，棄上清液，沉淀物中加入50 uL的DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理10 min，12 000 rpm離心5 min，取上清液2uL進行PCR擴增檢。試驗過程中均設陰性、弱陽性質(zhì)控品、空白及陽性定量參考品（105、106、107、108基因拷貝/mL），所有操作均嚴格按照操作說明書進行。

1.3.3 血清MP-IgM檢測采用ELISA法檢測血中IgM抗體，Cut-off值＜0.8為陰性,≥0.8～1.1為弱陽性（可疑），≥1.1為陽性。具體步驟：向相應微孔中加100 uL標準品、陽性對照、陰性對照及待檢標本，室溫（18～25℃）溫育30 min，倒掉板內(nèi)液體，用清洗緩沖液洗板3次拍干，每孔滴加100 uL酶結合物室溫（18～25℃）溫育30 min，洗板3次拍干，滴加顯色液A和B各100 uL室溫（18～25℃）避光溫育15 min后加終止液100 uL，酶標儀450 nm比色測Cut-off值。

1.4 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，計數(shù)資料用百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MP-DNA的檢出率

1590例疑似呼吸道肺炎支原體感染的患兒中，結果為MP-DNA陽性共計168例，總檢出率10.6%，其中＜1歲31例，1～3歲79例，4～6歲40例，7～14歲18例。陽性患者主要集中在1～3歲患兒中，在各年齡組之間MP-DNA的陽性率的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 MP-IgM的檢出率

1 590例疑似呼吸道肺炎支原體感染的患兒中，結果為MP-IgM弱陽性共計159例，檢出率為10.0%,結果為陽性的共計300例，檢出率為18.9%，兩者陽性結果相加共459例，總檢出率為28.9%，其中＜1歲51例，1～3歲278例，4～6歲93例，7～14歲37例，1～3歲和4～6歲兩組IgM陽性率顯著高于其他組（P＜0.05）。

2.3 MP-DNA的檢出率與MP-IgM檢出率比較

1590例疑似呼吸道肺炎支原體感染的患兒中，MP-DNA組總檢出率為10.6%，MP-IgM組總檢出率為28.9%，兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義（χ2=168.23，P＜0.01）見表1。

表1 MP-DNA組MP-IgM組呼吸道感染患兒MP感染陽性率比較[n(%)]

3 討論

肺炎支原體（MP）肺炎是兒童社區(qū)獲得性肺炎的常見病因，但其癥狀、體征及胸部X線胸片等缺乏特異性，確診往往需要依靠病原學檢查[3]。近幾年，在兒童社區(qū)獲得性肺炎中，典型肺炎在廣譜抗生素廣泛的使用后得到了一定的控制，而由MP感染引起的非典型肺炎卻有明顯上升趨勢,由于缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，常常未引起臨床醫(yī)生的重視甚至漏診而引起嚴重的肺炎,有的還引起嚴重的并發(fā)癥或持久的后遺癥,嚴重的肺炎可導致死亡。該研究結果顯示MP-DNA和MP-IgM總檢出率分別為10.5%和28.9%,檢出率分別與文獻[4-6]報道的基本一致，兩者結果陽性率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

血清學ELISA方法是實驗室診斷肺炎支原體感染的常用方法之一，該研究通過對不同年齡段的患兒進行分析，發(fā)現(xiàn)1～3和4～6歲兩組的患兒MP-IgM陽性率顯著高于其它組別,而MP-DNA陽性率在各組別之間幾乎一致,這說明不同年齡階段患兒免疫應答存在差異，造成抗體的產(chǎn)生有所不同，由于MP-IgM抗體在體內(nèi)存在時間短，常常難以把握最佳檢測時間,所以血清學方法檢測可能具有年齡階段的差異。而實時熒光定量PCR法則直接檢測病原體的目的核酸，不會因為年齡不同而影響檢出結果。該次統(tǒng)計血清學ELISA法檢測MP-IgM抗體中，結果為弱陽性共159例占10%，陽性300例占18.9%，兩者總檢出率28.9%，顯著高于熒光定量PCR法MP-DNA檢測陽性的10.6%（P＜0.05），說明結果存在一定的假陽性率，根據(jù)王利君等[7]的統(tǒng)計ELISA血清學MP-IgM方法的靈敏性為98.5%，特異性為70.8%，假陽性率為29.2%,臨床需對單份血清抗體陽性結果的解釋應持慎重態(tài)度，MP-IgM抗體單一陽性結果不適合作為早期兒童肺炎支原體感染的唯一診斷標準。另MP-IgM抗體雖然是MP感染后最早產(chǎn)生的抗體，但其產(chǎn)生仍需一定時間，且必須在感染1周左右才可檢測到,10～20 d達到高峰，所以早期的檢測仍可能出現(xiàn)假陰性[7]。最好在入院診斷初期和治療過程的中后期各采集雙份血清查MP-IgM抗體，并同時對兩份血清IgM抗體的Cut-off值進行動態(tài)比較，若Cut-off值進行性升高則診斷價值更大,是臨床診斷兒童近期肺炎支原體感染與否較為可靠的免疫學方法。

實時熒光定量PCR法是一種敏感性和特異性均較高的方法，而且簡便快速，明顯比血清學方法具有優(yōu)勢，已在各大醫(yī)院廣泛開展。通過袁藝等[3]研究結果顯示定量PCR的敏感性為92.7%，特異性為93.3%，而IgM抗體檢測的敏感性僅為66.7%～83.9%，從而提示熒光定量PCR能更早診斷MP感染，這也與其它文獻報道相似[8]。但由于采集的咽拭子及痰標本易受口腔內(nèi)MP定植的污染，所以MP-DNA的陽性并不能排除病原菌在上呼吸道定植的可能，同時PCR檢測的是病原體的核酸，在抗生素治療后期無法區(qū)分病原體是否已被殺死或清除，也不能用于其治療預后的判斷，需根據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)和其他輔助檢查結果共同作出合理的診斷。該院目前PCR標本送檢率較低，可能是由于患兒小，常常不愿配合咽拭子標本的采集，所以也存在咽拭子標本比血清標本更難采集的問題，也是造成PCR法送檢率低的客觀原因之一。PCR是一項用于臨床病原學診斷的技術，由于采用咽拭子及痰標本時不會出現(xiàn)PCR擴增抑制,同時能夠提供定量結果,對患兒呼吸道是否感染肺炎支原體，可以提供準確的診斷依據(jù)，是臨床診斷肺炎支原體肺炎常用的實驗室方法,對患者早期得到有效的治療具有重要意義。

總之，患兒肺炎支原體的呼吸道感染缺乏臨床特異性的診斷，而肺炎支原體的培養(yǎng)與分離鑒定是其診斷的“金標準”，但因其培養(yǎng)周期長，有時需要20 d或更長時間，所以對臨床所需的快速診斷意義不大，熒光定量PCR法可以彌補培養(yǎng)在時間方面長的不足，代替分離培養(yǎng)用于臨床的早期診斷。在條件允許的情況下，可同時采用熒光定量PCR法與雙份血清抗體檢測法同時檢測，既有利于肺炎支原體肺炎的早期診斷，又能各自彌補兩種方法學所存在的局限性，從面提高診斷的準確性，更有利于其早期合理的治療。

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Comparison Between FQ-PCR and ELISA in the Detection of Mycoplasma Pneumoniae Infection in Children

ZHANG Yi-rong,HUA NG Shi-jie,LIU Yun-gao
Clinical Laboratory,Jinjiang Branch of the Second Hospital Affiliated to Fujian Medical University(Jinjiang City Hospital), Jinjiang,Fujian Province,362200 China

ObjectiveTo investigate the value of real-time FQ-PCR and ELISA in the diagnosis of mycoplasma pneumoniae(MP)infection in children.MethodsFQ-PCR was used to detect the MP-DNA and ELISA was used to detect the MPIgM antibody in a total of 1590 specimens of conventional throat swab or sputum and 2mL EDTA anticoagulation from the infants and children suspected with MP infection and underwent pediatric outpatient and hospitalization treatment in our hospital from January 2013 to December 2014.And the results of the two sets were analyzed comparatively.ResultsThe results showed that there were 168 cases of positive MP-DNA,accounting for 10.6%,whereas there were 459 cases of positive MP-IgM,accounting for 28.9%,the difference was significant(P＜0.05).ConclusionBoth real-time FQ-PCR and ELISA serological methods have their own advantages in the diagnosis of MP infection in children.But the false positive rate of FQ-PCR is lower than that of ELISA serological method,so FQ-PCR is more suitable for the early diagnosis of MP infection in children,but using both methods can improve the accuracy of clinical diagnosis.

Real-time FQ-PCR;ELISA;Mycoplasma pneumoniae

R725

A

1674-0742（2015）11（a）-0005-03

2015-08-04）

張貽榮(1979.10-)，男，福建晉江人，大專，主管檢驗師，主要從事臨床微生物學與檢驗工作。