通信作者：張維農(nóng)(1969-)，男，教授，E-mail：zhangweinong@163.com.

高脂血癥血清脂肪酸分析

劉小珊，趙秀舉，胡志雄，齊玉堂，張維農(nóng)

(武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

摘要：探討高脂血癥小鼠血清脂肪酸水平的變化。以高脂血癥小鼠為模型，以生化檢測(cè)指標(biāo)為基礎(chǔ)，通過GC—MS檢測(cè)技術(shù)監(jiān)測(cè)基礎(chǔ)組、高脂組及配方油脂干預(yù)組小鼠血清脂肪酸的差異。將50只SPF級(jí)KM系雄性小鼠隨機(jī)分為基礎(chǔ)組、高脂組、配方油低中高劑量組。連續(xù)喂養(yǎng)4周，提取小鼠血清，檢測(cè)血清生化指標(biāo)，并使用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)其脂肪酸的種類與含量。結(jié)果表明，成功建立高脂血癥小鼠模型，且小鼠血清脂肪酸種類并無差別；而與基礎(chǔ)組比較，高脂組C14∶0、C16∶1、C18∶1、C22∶6的含量有顯著性差異；與高脂組相比，配方油組各脂肪酸含量均有不同程度變化，其中C16∶1、C18∶1、C22∶6的含量變化趨勢(shì)顯著(P<0.05)；且不飽和脂肪酸比例在各組之間也有顯著性差異。根據(jù)GC—MS(氣質(zhì)聯(lián)用)監(jiān)測(cè)結(jié)果可知，C16∶1、C18∶1、C22∶6三種脂肪酸在各組之間變化顯著，與高脂血癥代謝異常有關(guān)，血清不飽和脂肪酸比例與高脂血癥關(guān)系密切。

關(guān)鍵詞：高脂血癥；血清脂肪酸；GC—MS；不飽和脂肪酸

收稿日期：2015-03-23.修回日期：2015-05-12.

作者簡(jiǎn)介：劉小珊(1989-)，女，碩士研究生，E-mail：13554338623@163.com.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)

文章編號(hào)：2095-7386(2015)03-0025-06

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2015.03.006

中圖分類號(hào)：R 589.2

Research on biomarkers in serum fatty acids of hyperlipidemia

LIUXiao-shan,ZHAOXiu-ju,HUZhi-xiong,QIYu-tang,ZHANGWei-nong

(School of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract：To explore the differences of serum free fatty acids (FFA) of hyperlipidemia.Based on the hyperlipidemia model, the biochemical detection index, looking at the differences of serum fatty acids of group, fat group, formula oil low, medium, high dose groups. After continuously feeding four weeks, the serum was taken, the biochemical indexes were detected and the content of fatty acids were detected with gas chromatography-mass spectrometry. The results showed that the model of hyperlipidemia was successfully established and there was no species difference in all these fatty acids. Compared with the basic group, the content of C14∶0,C16∶1,C18∶1,C22∶6 of high-fat group were significantly different. Compared with the high-fat group, the fatty acid of formula oil groups varied on some degrees, and the diversification of C16∶1、C18∶1、C22∶6 was significantly. The ratio of unsaturated fatty acid was significantly difference between the groups. Based on GC-MS monitoring results, we could know that C16∶1,C18∶1,C22∶6 changed significantly between the groups, and could be related with the abnormal metabolism of hyperlipidemia, and the proportion of unsaturated fatty acids in serum had a close relationship hyperlipidemia.

Key words：hyperlipidemia; serum fatty acids; GC-MS; unsaturated fatty acids

1引言

游離脂肪酸即非酯化脂肪酸或未酯化脂肪酸是人體內(nèi)重要活性物質(zhì)，參與多種生理功能，代謝活性高且易受脂肪代謝影響；隨著血清游離脂肪酸與疾病關(guān)系的研究不斷深入，已證實(shí)游離脂肪酸，尤其是不飽和脂肪酸[1-2]與很多系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有研究顯示血清中脂肪酸組成能反映某些疾病特點(diǎn)，飽和脂肪酸有促進(jìn)血小板聚集作用，可誘發(fā)冠狀動(dòng)脈急性阻塞而導(dǎo)致心肌梗塞；不飽和脂肪酸中的亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸屬于必需脂肪酸，對(duì)人體有重要作用[3-8]。臨床醫(yī)學(xué)證實(shí)血清游離脂肪酸的濃度變化與很多疾病有關(guān)。因此測(cè)定人體中脂肪酸含量，尋找潛在疾病標(biāo)志物，對(duì)于疾病預(yù)防控制、治療有意義[9-10]。筆者在血清生化檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，研究功能性油脂干預(yù)后的各組小鼠血清脂肪酸的差異，期待找到與高脂血癥血清脂質(zhì)代謝異常相關(guān)的物質(zhì)，為進(jìn)一步深入研究提供參考。

2材料與方法

2.1材料與試劑

SPF級(jí)KM系小鼠60只，18—20 g，雄性，由湖北省疾控中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供；功能性油脂：配方油(85%米糠油、10%亞麻籽油、5%玉米油)，中興能源湖北有限公司提供；動(dòng)物基礎(chǔ)飼料,華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；康德牌蛋黃粉,江蘇南通康德生物制品有限公司；新鮮豬油,武商量販常青店；膽鹽3號(hào),國藥集團(tuán)試劑有限公司；膽固醇(純度大于95%),Aladdin公司；高脂飼料(自制),配比為78.8%的基礎(chǔ)飼料粉料、10%的豬油、10%的蛋黃粉、0.2%膽鹽3號(hào)、1%膽固醇；正己烷(色譜純),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸(分析純) 、甲醇(分析純)、氯化鈉(分析純),天津市天力化學(xué)試劑有限公司；總膽固醇試劑盒(酶法)、甘油三酯試劑盒(酶法)、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒(選擇性沉淀法)、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒(選擇性沉淀法),北京北化康泰臨床試劑有限公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒(葡萄糖氧化酶法),中生北控生物科技股份有限公司。

2.2儀器與設(shè)備

XW-80A微型漩渦混合儀,上海滬西分析儀器廠有限公司；ACS-3JZ電子計(jì)重秤,中山市衡新電子有限公司；TGL-16G 臺(tái)式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠制造；DZF-6021型真空干燥箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Agilent7890GC/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,國華電器有限公司。

2.3實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1動(dòng)物分組與喂養(yǎng)

60只SPF級(jí)昆明系雄性小鼠18 g左右在25 ℃，濕度為70%的環(huán)境下適應(yīng)10 d，淘汰掉體重較平均值低以及病態(tài)的小鼠10只。適應(yīng)期間全部喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料和飲用水，自由取食。適應(yīng)期后將剩下的50只小鼠隨機(jī)分為5組(A—E組)，每組10只。其中A組在實(shí)驗(yàn)期間喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，剩余組均喂養(yǎng)高脂飼料(78.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、0.02%3號(hào)膽鹽、1%蛋黃粉、10%豬油)。

此外C—E組小鼠每天定點(diǎn)灌胃配方油(85%米糠油、10%亞麻籽油、5%玉米油)，喂養(yǎng)4周。分組情況和劑量設(shè)置如表1所示。

表1小鼠實(shí)驗(yàn)分組與劑量/(mL/10g)

2.3.2小鼠血清的提取

禁食12 h后，對(duì)小鼠采取摘除眼球法取血，隨后引頸處死。采集的血液4 ℃靜置30 min以上，3 000 r/min離心10 min，取上層血清并轉(zhuǎn)移到液氮中保存，最后將所有分離出的血清轉(zhuǎn)移到-80 ℃條件下保存待測(cè)。

2.3.3小鼠血清血生化檢測(cè)

血清中需要檢測(cè)的指標(biāo)主要有總甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。采用酶法試劑盒來檢測(cè)血脂的各項(xiàng)指標(biāo)[11]，根據(jù)測(cè)量結(jié)果判定血脂調(diào)節(jié)效果。

2.3.4小鼠血清甲酯化

甲酯化方法參照李海靜[1]、馬曉麗[2]的實(shí)驗(yàn)方法。取血清樣品100 μL于EP管中，加1 mL 10% H2SO4和甲醇混合溶液，渦勻震蕩。于70 ℃恒溫水浴30 min，結(jié)束后冷卻至室溫，在試管中加入1 mL正己烷和1 mL飽和食鹽水，震蕩萃取，3 000 r/min離心10 min，取上層正己烷，N2吹干，用100 μL正己烷復(fù)溶后，待用。

2.3.5氣相色譜—質(zhì)譜分析

色譜條件：HP-FFAP石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；采用程序升溫法：起始溫度為100 ℃，保持1 min，然后以3 ℃/min升到220 ℃，保持29 min。載氣為N2。質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，傳輸溫度250 ℃，離子源溫度220 ℃，電離方式EI-，質(zhì)量掃描范圍m/z50—800。

2.3.6數(shù)據(jù)處理

3結(jié)果與討論

3.1各組血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)功能性油脂的降脂功效以生化檢測(cè)結(jié)果為依據(jù)，各組小鼠血清的TC、TG、LDL-C、HDL-C含量整理見表2。(1)總膽固醇：與空白組相比，高脂組血清TC水平有極顯著差異，說明高脂組小鼠在飼養(yǎng)高脂飼料期間TC水平明顯升高。與高脂組相比，配方油高、中劑量組有顯著差異，說明配方油能顯著減少TC水平。(2)總甘油三酯：與空白組相比，高脂組小鼠血清中TG水平有極顯著差異。與高脂組相比，配方油高低劑量組有顯著性差異，說明配方油能降低血清TG水平。(3)低密度脂蛋白膽固醇：與空白組相比，高脂組小鼠血清LDL-C水平有極顯著差異。與高脂組相比，低劑量配方油組有顯著性差異。(4)高密度脂蛋白膽固醇：與空白組相比，高脂組小鼠血清HDL-C水平有極顯著差異；與高脂組相比，配方油各劑量組均顯著升高血清HDL-C水平。根據(jù)以上分析結(jié)果可知：配方油有輔助降血脂功效。

3.2基礎(chǔ)組、高脂血癥組、配方油脂干預(yù)組脂肪酸檢測(cè)結(jié)果

3.2.1各組小鼠血清脂肪酸定量分析

表2　各組小鼠血脂指標(biāo)　/(mmol/L)

注：(1)■■與A組比較有極顯著差異(P<0.01)；(2)■與A組比較有顯著差異(P<0.05)；(3)##與B組比較有極顯著差異(P<0.01)；(4)#與B組相比有顯著差異(P<0.05)。

在該實(shí)驗(yàn)條件下，各組小鼠血清游離脂肪酸都可以得到完全分離，各組均檢測(cè)到C14∶0、C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C20∶3、C20∶4、C22∶6。各組小鼠血清脂肪酸只有量的差異，無種類差異。

使用峰面積歸一法，測(cè)得各組小鼠血清脂肪酸相對(duì)百分含量，詳見表3。

(1)B組(高脂組)與A組(基礎(chǔ)組)相比較，C14∶0、C16∶1有顯著性差異(P<0.05)，C18∶1、C22∶6有極顯著性差異(P<0.01)。C16∶0、C18∶0、C18∶2、C20∶3、C20∶4都有不同程度的差異，但是差異不顯著(P>0.05)。綜上可知高脂組相對(duì)于基礎(chǔ)組而言C14∶0、C16∶1、C18∶1、C22∶6四種脂肪酸變化顯著。

(2)C—E組與B組比較，C14∶0的含量有上升趨勢(shì)，但是C—E組C14∶0整體與B組比較差異不顯著；C16∶1的含量有下降趨勢(shì)，其中D、E組差異顯著(P<0.05)，C組差異極顯著(P<0.01)；C18∶1的含量整體下降，C—E組差異均顯著(P<0.05)；C22:6含量上升，且C—E組差異顯著(P<0.05)；而剩余五種被檢測(cè)出的脂肪酸在C—E組與B組之間雖然也產(chǎn)生差異，但是差異不顯著。綜上可知C—E組也即配方油干預(yù)組相對(duì)于B組也即高脂組而言，C16∶1、C18∶1、C22∶6三種脂肪酸變化顯著。

表3小鼠血清脂肪酸相對(duì)含量的變化

脂肪酸ABCDEC14:01.228±0.0750.672±0.245▲0.796±0.0560.878±0.3100.928±0.198C16∶031.402±2.83228.009±2.38827.663±0.83828.941±0.38232.206±6.793C16∶11.237±0.2062.850±0.939▲0.581±0.224◆◆0.766±0.052◆0.858±0.129◆C18∶015.844±0.53017.360±0.93716.550±0.48317.134±0.37216.612±2.318C18∶19.463±1.08813.414±0.894▲▲11.371±0.897◆11.308±0.972◆9.805±2.100◆C18∶218.510±2.39619.183±1.59721.247±0.74919.370±1.13717.693±2.149C20∶32.090±0.4272.197±0.6343.896±0.691◆3.912±0.676◆4.138±0.943◆C20∶48.880±1.02512.067±1.93811.358±0.88511.533±0.63211.990±2.745C22∶68.853±0.4084.248±0.289▲▲6.537±1.261◆6.157±0.853◆5.770±0.998◆

(1)▲▲與A組比較有極顯著差異(P<0.01)；(2)▲與A組比較有顯著差異(P<0.05)；(3)◆◆與B組比較有極顯著差異(P<0.01)；(4)◆與B組相比有顯著差異(P<0.05)。

C16∶1，C18∶1和C22∶6三種脂肪酸水平對(duì)比圖見圖1，圖2和圖3。

圖1　各組小鼠C16∶1水平

圖2　各組小鼠C18∶1水平

圖3　各組小鼠C18∶1水平

從以上分析結(jié)果可知，C16∶1、C18∶1、C22∶6三種脂肪酸在各組之間變化具有規(guī)律性，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，功能性油脂具有減小高脂組與基礎(chǔ)組間差別的作用。說明C16∶1、C18∶1、C22∶6這3種脂肪酸與高脂血癥代謝異常有著密切關(guān)系。

3.2.2各組小鼠血清不同類型脂肪酸差異

根據(jù)表3的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，將每組脂肪酸進(jìn)行分類，分析各組小鼠血清不同類型脂肪酸的變化情況，見表4。

(1)B組和A組比較，MUFA、MUFA/UFA、PUFA/UFA含量有極顯著性差異(P<0.01)，SFA、UFA、PUFA、SFA/UFA差異不顯著(P>0.05)。說明B組也即高脂組相對(duì)于A組也即基礎(chǔ)組而言，MUFA、MUFA/UFA、PUFA/UFA變化顯著。

(2)C—E組與B組比較， MUFA含量整體下降，其中C—E組變化均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PUFA/UFA含量上升，C—E組變化都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)；而MUFA/UFA只有E組變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C組、D組變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SFA、UFA、PUFA、SFA/UFA變化不顯著(P>0.05)。綜上可知MUFA、PUFA/UFA、MUFA/UFA在高脂組與配方油干預(yù)組之間的變化較顯著。

不飽和脂肪酸含量在各組之間有顯著性差異，各類不飽和脂肪酸的比例分配在各組之間也具有顯著性差異。得出某一類脂肪酸尤其是不飽和脂肪酸也可能作為研究高脂血癥的一個(gè)關(guān)注點(diǎn)。

表4小鼠血清脂肪酸的分類比較

脂肪酸ABCDESFA(飽和脂肪酸)49.894±2.78146.041±2.44045.009±0.47446.953±0.06149.746±6.944UFA(不飽和脂肪酸)50.106±2.78153.960±2.44054.991±0.47453.047±0.06150.254±6.944MUFA(單不飽和脂肪酸)10.667±1.14616.264±1.206★★11.953±1.106●●12.074±0.982●●10.663±2.208●●PUFA(多不飽和脂肪酸)39.439±1.74837.695±3.21543.038±1.576●40.973±1.04139.591±4.858SFA/UFA1.000±0.1100.856±0.0850.819±0.0160.885±0.0021.018±0.300MUFA/UFA0.213±0.0130.302±0.031★★0.217±0.0220.228±0.0190.211±0.017●●PUFA/UFA0.787±0.0130.698±0.031★★0.783±0.022●●0.772±0.019●0.789±0.017●●

(1)★★與A組比較有極顯著差異(P<0.01)；(2)★與A組比較有顯著差異(P<0.05)；(3)●●與B組比較有極顯著差異(P<0.01)；(4)●與A組比較有顯著差異(P<0.05)。

4結(jié)論

血清中FFAs在健康狀態(tài)下處于相對(duì)平衡狀態(tài)，只有疾病狀態(tài)下導(dǎo)致某個(gè)系統(tǒng)功能紊亂，血清脂肪酸平衡狀態(tài)被打破，其組成才會(huì)發(fā)生改變[12]。胰島素抵抗[13-14]、糖尿病[15-17]等多種代謝疾病都存在血清游離脂肪酸升高的現(xiàn)象。其機(jī)理是，脂肪細(xì)胞增生，脂肪體積增大，腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子表達(dá)增多，脂肪分解速率明顯增加，脂肪代謝紊亂，大量FFA進(jìn)入血清，引起高FFA血癥。血清游離脂肪酸跟其他血脂相比，能更靈敏，更早，更準(zhǔn)確地反映機(jī)體血脂代謝紊亂狀況，不同脂肪酸在脂質(zhì)代謝中所表現(xiàn)作用不同，因此對(duì)血清游離脂肪酸進(jìn)行檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)早期脂質(zhì)代謝異常，起到預(yù)警作用[18]。單不飽和脂肪酸可降低心血管疾病的發(fā)病率， n-3和n-6PUFAs可降低血清甘油三酯水平，預(yù)防心血管疾病[19-21]。

本研究中，高脂組C16∶1、C18∶1、C22∶6相對(duì)于基礎(chǔ)組差異顯著 ，配方油干預(yù)組相對(duì)于高脂組而言，C16∶1、C18∶1、C22∶6三種脂肪酸含量變化也顯著，可得出C16∶1、C18∶1、C22∶6與高脂血癥脂質(zhì)代謝異常有密切關(guān)系。而MUFA、MUFA/UFA、PUFA/UFA變化也較顯著，高脂組MUFA顯著高于基礎(chǔ)組，PUFA/UFA顯著低于基礎(chǔ)組，得出不僅各種血清脂肪酸含量多少對(duì)生理功能有影響，各類脂肪酸占總脂肪酸比例也應(yīng)得到重視，尤其是不飽和脂肪酸。

綜上所述，血清中C16∶1、C18∶1、C22∶6含量隨飲食改變產(chǎn)生的變化顯著，可做為疾病早期血清脂肪酸變化的敏感指標(biāo)物。由于疾病組游離血清脂肪酸譜較正常組發(fā)生改變，為更好地控制疾病的發(fā)生以及更好地進(jìn)行疾病的后期治療，應(yīng)對(duì)血清脂肪酸水平的變化加以關(guān)注，做到早發(fā)現(xiàn)早干預(yù)、早治療。

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