閆一夫，姚志湘，粟暉，劉柳，李張升，呂金星

(1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州 545006)

丹皮酚藥理應用價值廣泛，除用于醫(yī)療制劑原料外，還用于牙膏、護膚、美容等日化品中。丹皮酚的含量測定是各種制劑和產(chǎn)品質(zhì)量控制的主要指標之一，中國藥典(2005年版)規(guī)定以丹皮酚的含量作為檢查牡丹皮、徐長卿及六味地黃丸質(zhì)量的定量指標［1］。2010 年版《中國藥典》收載了牡丹皮中丹皮酚的高效液相色譜(HPLC)含量測定法［2］。文獻報道了HPLC同時測定牡丹皮中丹皮酚和芍藥苷含量的方法［3］，以及近紅外光譜分析方法［4-5］，兩種方法靈敏度高，但分析成本高，操作強度大，大批量樣本的分析效率低，需要建立一種丹皮酚含量快速分析新方法。

光譜組分混合體系定量分析丹皮酚比較困難，一般是通過先分離后定量。姚志湘等［6-7］提出采用“斜投影”作為理論依據(jù)，應用于斜投影-不展開薄層法對混合染液進行測定［8-9］，其分析速度快，測定效果理想。

斜投影方法定量分析是先將被測組分的光譜信號從混合光譜中分離，然后進行定量分析。對不同批次丹皮酚結(jié)晶母液樣品用高效液相色譜-光譜儀聯(lián)用采集各樣品經(jīng)色譜分離后的紫外光譜數(shù)據(jù)，經(jīng)數(shù)據(jù)處理獲得不含被測組分丹皮酚的背景光譜數(shù)據(jù)H，獲得只含有被測組分丹皮酚的光譜數(shù)據(jù)s，計算標準樣品濃度與want值的線性方程［10］，采集紫外光譜數(shù)據(jù)計算want值代入線性方程，分析待測樣本中丹皮酚含量。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津公司；

紫外-可見光纖光譜儀：Maya2000型，美國Ocean Optics公司；

電子分析天平：AL104型，上海梅特勒-托利多公司；

無水乙醇：AR，成都市科龍化工試劑廠；

甲醇、乙腈：色譜純，安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司；

丹皮酚標準樣品：純度99.9%，廣西億康制藥業(yè)有限公司；

丹皮酚結(jié)晶母液：純度60%～80%，廣西億康制藥業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器工作條件

(1)液相色譜條件。色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm)；流動相：0～30 min，乙腈-水體積比為40∶60，30～55 min，乙腈-水體積比為5∶95，55～80 min，乙腈-水體積比為95∶5；流 量：1 mL／min；進樣體積：20 μL；柱溫：20℃；色譜檢測波長：270 nm。

(2)光譜條件。流動比色皿：1 cm；積分時間：15 μs；積分次數(shù)：20次；紫外檢測波長：200～400 nm。

1.2.2 丹皮酚標準樣品紫外光譜采集

精確稱取0.101 0 g丹皮酚標準樣品，用75%乙醇定容到100 mL。依次配制質(zhì)量濃度為2，4，8，12，16，20 mg／L丹皮酚-75%乙醇溶液(編號B1～B6)。采集各溶液200～400 nm紫外光譜(記為a1～a6)。

1.2.3 待測樣本的制備及紫外光譜采集

室溫下，分別取丹皮酚結(jié)晶母液0.15 g左右，上層溶液和下層晶體各一份，用75%乙醇稀釋到一定濃度，得到樣本S1和S2。

取不同生產(chǎn)批次的丹皮酚結(jié)晶母液兩份，分別加熱至50℃成熔融狀態(tài)，分別稱取1.2 g和0.9 g，用75%乙醇稀釋到一定濃度，得到樣本S3和S4。

稱取丹皮酚結(jié)晶產(chǎn)品0.1 g，用75%乙醇稀釋到一定濃度，得到樣本S5。取S1～S5等體積混合得到樣本S6。

在1.2.1(2)儀器條件下，采集S1～S6的紫外光譜數(shù)據(jù)，得到待測樣本數(shù)據(jù)庫，記為D。

1.2.4 數(shù)據(jù)庫的建立

將待測樣品S1～S6和丹皮酚標準樣品樣本B3，通過液相色譜與光譜儀聯(lián)用，采集各樣本經(jīng)過色譜柱完全分離后的多波長光譜數(shù)據(jù)。從待測樣品光譜數(shù)據(jù)中扣除待測組分丹皮酚的光譜數(shù)據(jù)，并經(jīng)數(shù)據(jù)降維［11］，得到背景數(shù)據(jù)庫H，僅保留待測組分丹皮酚的光譜數(shù)據(jù)記為s。

1.2.5 標準樣品與對應want值的計算

將上述光譜數(shù)據(jù)庫H，s以及標準樣品a1～a6光譜數(shù)據(jù)導入計算平臺MATLAB［12-13］，選取200～400 nm波長段，應用斜投影算法分別計算各標準樣品丹皮酚質(zhì)量濃度對應的want值。

1.3 回收試驗

分別取10 mL S2，S4，S5各3份，分別加入8，12，16 mg／L 3個濃度的丹皮酚對照品溶液10 mL，混合均勻后采集其多波長紫外光譜，采用斜投影判據(jù)計算丹皮酚的含量，計算該方法的回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)據(jù)庫的建立

對丹皮酚標準樣品溶液B3和混合樣本S6進行分析，色譜圖見圖1。

圖1 丹皮酚母液和丹皮酚對照品的液相色譜圖

如圖1所示，A為丹皮酚的色譜峰，其出峰時間對應為16.3～17.5 min。從S6的光譜數(shù)據(jù)中扣除與丹皮酚具有相同保留時間的光譜數(shù)據(jù)(如圖1中A峰數(shù)據(jù))，其余數(shù)據(jù)(B峰數(shù)據(jù))則作為測定丹皮酚含量的本底數(shù)據(jù)，記為M6。依次從樣品S1～S5的光譜數(shù)據(jù)中分別扣除16.3～17.5 min時間段的光譜數(shù)據(jù)所對應的列后存入本底數(shù)據(jù)庫中，記為M1～M5。合并M1～M6數(shù)據(jù)構(gòu)成數(shù)據(jù)庫M。

液相色譜-光譜聯(lián)用獲取的初始本底光譜數(shù)據(jù)M數(shù)據(jù)量大，若直接采用，運算時間長，影響了方法的時效性，因此需要對獲取的數(shù)據(jù)進行降維以去除數(shù)據(jù)中的噪聲和冗余的維數(shù)，保留有效性數(shù)據(jù)，提高算法的處理速度。選用主成分分析的方法判斷體系主成分為8個，將M經(jīng)奇異值分解［14］，取降解后U矩陣的前8列，即為降維后的背景數(shù)據(jù)庫H。

從樣品S1～S6的光譜數(shù)據(jù)中分別保留16.3～17.5 min時間段的光譜數(shù)據(jù)所對應的列后存入數(shù)據(jù)庫中，記為s1～s6。合并s1～s6數(shù)據(jù)構(gòu)成數(shù)據(jù)庫s。

2.2 標準樣品質(zhì)量濃度與對應want值的線性關(guān)系

按1.2.5計算每個標準樣品丹皮酚質(zhì)量濃度對應的want值。

對標準樣品丹皮酚質(zhì)量濃度y與want值x進行線性回歸得到的線性方程y=27.654x-34.253，相關(guān)系數(shù)r2=0.997 8。

2.3 樣品中丹皮酚的測定

根據(jù)待測樣品樣本S1～S5的紫外光譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫H，s，按斜投影判據(jù)的算法步驟計算丹皮酚的含量對應的want值，代入線性方程計算含量。同時和高效液相色譜計算出的丹皮酚含量值進行比對。各待測樣本中的丹皮酚的含量及相對誤差列于表1。

表1 兩種不同方法測定結(jié)果

由表1可以看出，采用斜投影判據(jù)計算結(jié)果與采用高效液相色譜計算結(jié)果相接近。相對誤差小于5.0%，說明該方法的準確度較高。

2.4 精密度試驗

按1.3方法對樣品S2，S4，S5進行精密度試驗，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果

由表2可知，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.4%～1.0%，說明該方法具有良好的精密度。

2.5 回收試驗

按1.3進行回收試驗，結(jié)果見表3。由表3可看出，樣品回收率范圍為98.8%～101.3%。用斜投影判據(jù)計算出來的丹皮酚的含量與實際添加量接近，表明該方法的準確度較好。

表3 回收試驗結(jié)果

3 結(jié)論

通過液相色譜-紫外可見光譜儀聯(lián)用，應用斜投影判據(jù)，建立了丹皮酚含量快速分析方法。對于同類樣品的測定，一旦數(shù)據(jù)庫建立好，只需測試待測樣品的UV光譜數(shù)據(jù)即可實現(xiàn)待測樣品中物質(zhì)含量的分析。與高效液相色譜法相比，該方法穩(wěn)定可靠、操作簡便，可以實現(xiàn)丹皮酚樣品的即時測量，為丹皮酚含量快速測定提供了一種比較實用的定量分析技術(shù)，并可推廣應用于其它丹皮酚制品檢測領(lǐng)域。

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