葉伶菊，郭莎，張麗冰，任孟偉，閆正

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002)

含羞草是豆科類植物，豆科含羞草屬植物含羞草Mimosa pudica L.的全草［1］，別名知羞草、怕羞草、望江南等。含羞草主要分布在華東、華南、東南等地，具有清熱利濕、安神鎮(zhèn)靜、止痛消腫之功效。黃酮類物質(zhì)是含羞草中的主要活性物質(zhì)之一，且其具有顯著的生理活性，近年來研究表明，黃酮類物質(zhì)具有維持血管正常滲透壓，降低血管脆性，降低人體膽固醇含量，抗過敏，降血壓，抑制癌變和抗病毒等作用［2］，因此分離純化含羞草中的黃酮類物質(zhì)具有重要意義。目前關(guān)于含羞草黃酮類物質(zhì)的提取工藝已有研究［3］，但是大孔吸附樹脂分離純化含羞草中黃酮類物質(zhì)鮮有研究。

大孔吸附樹脂是近年來發(fā)展起來的新型分離技術(shù)，具有價廉、吸附容量大、可反復(fù)使用等優(yōu)點，因此被廣泛應(yīng)用于中藥有效成分分離純化和天然藥物化學(xué)成分提取分離［4–8］。筆者對Diaion HP–20大孔吸附樹脂分離純化含羞草中的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行研究，優(yōu)化確定最佳工藝條件，為分離純化含羞草中的黃酮類物質(zhì)提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

紫外可見分光光度計：4802型，上海尤尼柯儀器有限公司；

架盤藥物天平：精度0.1 g，上海精科分析儀器廠；

恒溫水浴鍋：B–220型，上海亞榮分析儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE–52型，上海亞榮分析儀器廠；

微型高速萬能試樣粉粹機(jī)：FW80型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

自動雙重純水蒸餾器：SZ–93型，上海亞榮生化儀器廠；

移液槍：1 000～5 000 μL，北京大龍興創(chuàng)儀器廠；

NaNO2，Al(NO3)3，NaOH，無水乙醇：分析純，天津華東試劑廠；

大孔吸附樹脂：Diaion HP–20，日本三菱化學(xué)公司；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：分析純，中國藥品生物制品鑒定所；

含羞草種子樣品：采于海南三亞。

1.2 實驗方法

取預(yù)處理好的樹脂2.0 g，吸干表面水分后放入100 mL具塞磨口錐形瓶中，加入40 mL含羞草提取液，置于25℃恒溫水浴鍋中靜置吸附24 h，過濾，取濾液，測定濾液中黃酮物質(zhì)的含量，按下式計算室溫下大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附容量：

1.2.1 Diaion HP–20大孔吸附樹脂的預(yù)處理

取適量Diaion HP–20大孔吸附樹脂用2.5BV(表示2.5倍柱體積)無水乙醇浸泡24 h，傾倒去上層無水乙醇，將樹脂濕法裝入玻璃柱中，再用95%乙醇洗脫至流出液加去離子水不出現(xiàn)渾濁，并用去離子水沖洗樹脂層至流出液無乙醇味為止。

1.2.2 樣品預(yù)處理

將適量樣品放入粉碎機(jī)中，在10 000 r／min轉(zhuǎn)速下粉碎3 min，然后將粉碎的樣品過0.250 mm篩，將過完篩的樣品置于試樣瓶中備用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，加入70 mL甲醇微熱溶解，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用甲醇定容。然后精密移取15.00 mL于另一100 mL容量瓶中，稀釋定容，即得1 mg／mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

精密移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL于10 mL容量瓶中，各加30%乙醇至5 mL，加5%亞硝酸鈉0.3 mL充分搖勻，放置5 min；再各加入10%硝酸鋁0.3 mL充分搖勻，放置6 min；然后加入1.0 mol／L氫氧化鈉4 mL，用去離子水定容至標(biāo)線，放置20 min后于510 nm處測量吸光度(以試劑空白為參比)，重復(fù)測量3次，取平均值，以蘆丁質(zhì)量濃度c(mg／mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程：A=10.152 38c+0.001 29，r=0.999 3。

1.2.4 含羞草中黃酮類物質(zhì)的提取工藝

采用超聲提取法，取處理好的含羞草種子樣品適量，根據(jù)正交實驗L9(3,4)篩選出最優(yōu)提取工藝，即60%乙醇溶液，含羞草種子質(zhì)量(g)與60%乙醇溶液體積(mL)比為1∶8，超聲溫度40～44℃，超聲時間50 min，制得含羞草黃酮提取液，備用。

1.2.5 黃酮類物質(zhì)含量測定

含羞草中黃酮類物質(zhì)的含量測定采用NaNO2–Al(NO3)3比色法，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線黃酮含量的測定方法，在510 nm處測量吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂吸附容量的測定

式中：Q——靜態(tài)吸附容量，mg／g；

co——提取液中初始的總黃酮質(zhì)量濃度， mg／mL；

c1——吸附24 h后溶液中剩余的總黃酮質(zhì)量濃度，mg／mL；

V1——提取液的體積，mL；

m——樹脂質(zhì)量，g。

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定黃酮類物質(zhì)的含量，含羞草提取液中黃酮類物質(zhì)的初始質(zhì)量濃度為0.145 mg／mL，恒溫水浴24 h后，測定平衡吸附液中剩余黃酮類物質(zhì)的含量，根據(jù)(1)式計算得出大孔吸附樹脂的吸附容量為2 mg／g。

2.2 大孔吸附樹脂解吸率的測定

將預(yù)處理好的大孔吸附樹脂置于100 mL的具塞磨口錐形瓶中，加入40%的乙醇溶液50 mL，于25℃的恒溫水浴鍋中解吸24 h，過濾，取濾液，測濾液中總黃酮的濃度，按下式計算在室溫下大孔吸附樹脂的解吸率：

式中：D——大孔吸附樹脂的解吸率，%；

c2——解吸24 h后解吸溶液中的總黃酮質(zhì)量濃度，mg／mL；

V2——解吸液體積，mL。

根據(jù)式(2)計算得出40%乙醇溶液對大孔吸附樹脂的解吸率是85%。

2.3 上樣速度對大孔吸附樹脂吸附量的影響

將2.0 g預(yù)處理好的樹脂裝入玻璃層析柱中，再將10 mL含羞草黃酮提取液分別以1，2，3，4，5 mL／min的速度上樣，上樣后分別檢測各管中黃酮的濃度，計算不同上樣速度下的吸附容量，比較選擇出最佳的上樣速度。

上樣速度對大孔吸附樹脂吸附黃酮類物質(zhì)有一定影響，結(jié)果見圖1。

圖1 上樣速度對大孔樹脂吸附容量的影響

由圖1可知，隨著上樣速度的增加吸附量先增加后減小，當(dāng)上樣速度為3 mL／min時，大孔吸附樹脂對黃酮的吸附效果最好，所以確定最佳上樣速度為3 mL／min。

2.4 洗脫液濃度對大孔吸附樹脂解吸率的影響

大孔吸附樹脂分離純化植物提取液中的有效成分時常選用乙醇水溶液作為洗脫劑，原因是其毒性小，價格低，吸附效果較好。將2.0 g預(yù)處理好的樹脂裝入玻璃層析柱中，加入10 mL含羞草提取液，以3 mL／min上樣速度上樣，依次用體積分?jǐn)?shù)為20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液以3 mL／min進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中黃酮類物質(zhì)的含量，探討不同體積分?jǐn)?shù)乙醇水溶液對大孔吸附樹脂解吸率的影響。

不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對大孔吸附樹脂解吸率的影響實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)對大孔吸附樹脂解吸率的影響

由圖2可知，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為40%時對樹脂的解吸附效果最好，所以選擇體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液為洗脫液。

2.5 洗脫速率對大孔吸附樹脂解吸率的影響

將2.0 g預(yù)處理好的樹脂裝入玻璃層析柱中，以3 mL／min上樣速度上樣，用體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液分別以0.5，1，2，3，4，5 mL／min的速度洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中黃酮類物質(zhì)的含量，確定最佳的洗脫速率。

不同洗脫速率對大孔吸附樹脂解吸率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 洗脫速率對大孔吸附樹脂解吸率的影響

由圖3可知，當(dāng)洗脫速率為4 mL／min時解吸率最高，因為洗脫速率過低，黃酮類物質(zhì)的死吸附過多，解吸率不高；洗脫速率過高，黃酮類物質(zhì)還未完全吸附就被洗脫下來，致使解吸率低，所以最佳洗脫速率為4 mL／min。

2.6 柱徑比對大孔吸附樹脂解吸率的影響

將預(yù)處理好的樹脂2.0 g分別裝入柱徑比為1∶10，1∶15，1∶20的玻璃層析柱中，以3 mL／min上樣速度上樣，用體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液以4 mL／min洗脫速率進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中黃酮類物質(zhì)的含量，確定最佳柱徑比。

不同柱徑比對大孔吸附樹脂解吸率的影響實驗結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，柱徑比為1∶10時，大孔吸附樹脂對黃酮類物質(zhì)的解吸率最高，所以確定最佳柱徑比是1∶10。

圖4 柱徑比對大孔吸附樹脂解吸率的影響

3 結(jié)論

(1)以含羞草種子中總黃酮吸附量和洗脫率為評價指標(biāo)，研究Diaion HP–20大孔吸附樹脂分離純化含羞草黃酮類物質(zhì)的工藝條件，研究確定最佳的條件為上樣流速3 mL／min、洗脫液為40%乙醇溶液、柱徑比1∶10、洗脫流速4 mL／min。

(2)本實驗建立的Diaion HP–20大孔吸附樹脂分離純化含羞草黃酮類物質(zhì)的方法簡單可行，且大孔吸附樹脂能夠重生，利用率高，消耗樹脂少，再生簡單，該法具有較好的應(yīng)用前景。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1997: 1 771.

［2］丁利君，吳振輝，蔡創(chuàng)海，等.金銀花中黃酮類物質(zhì)最佳提取工藝研究［J］.食品科學(xué)，2002，23(2): 62–65.

［3］喬文濤，張靜，俞凌雁，等.含羞草中總黃酮提取純化工藝研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(8): 1 986–1 987.

［4］吳立軍.天然藥物化學(xué)［M］.5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007: 30–31.

［5］胡志軍，郝利君，王南溪，等. D–101大孔吸附樹脂分離純化橘皮中的黃酮類物質(zhì)［J］.食品科學(xué)，2010，31(8): 65–69.

［6］郁建生，羅顯華.大孔吸附樹脂分離純化桂花總黃酮工藝條件研究［J］.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2012，10(2): 33–35.

［7］袁珂，呂潔麗，殷明文.海南含羞草中黃酮碳苷類化學(xué)成分的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，2006，41(5): 435–438.

［8］向大雄，李煥德，朱葉超，等.大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮的研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2003，38(1): 35.