田 青 ， 王洪榮

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223003；2.揚州大學(xué)，江蘇揚州 225009）

激素受體是激素發(fā)揮其功能的主要途徑。Lee等（2011）發(fā)現(xiàn)胰島素（INS）要發(fā)揮其功能，必須先與α亞單位結(jié)合后，β亞單位中酪氨酸激酶才被激活，進而使受體磷酸化，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)細胞內(nèi)酶系統(tǒng)活性，控制物質(zhì)代謝。李真和李慶章（2010）發(fā)現(xiàn)在奶牛乳腺組織中，胰島素及其受體的變化是有規(guī)律的，INS濃度從妊娠期開始上升至分娩前達到最大，而后開始下降；胰島素受體（INSR）的表達量從青春期到泌乳初期逐漸升高，到泌乳高峰期持續(xù)高水平，隨后開始下降；催乳素也必須先與特定組織（如脾臟、淋巴結(jié)、胸腺、乳腺、卵巢等）催乳素（RPLR）基因結(jié)合才能進入細胞內(nèi)發(fā)揮其功能（王亮，2013）。研究表明，在奶牛乳腺內(nèi)，催乳素首先與其受體結(jié)合，然后激活JAK2激酶，并通過JAK-STAT信號通路刺激乳腺腺泡發(fā)育，并在乳腺組織中刺激乳腺酪蛋白基因的表達進而促進乳的生成與分泌、發(fā)動和維持泌乳（Akers，2006）。在體內(nèi)，糖皮質(zhì)激素與其胞內(nèi)核受體結(jié)合后才能啟動并調(diào)控相關(guān)基因的表達和乳蛋白的合成，并且通過基因組機制實現(xiàn)其生理藥理功能（李敏，2010）。

大量研究表明，激素與激素之間或激素與生長因子之間均存在一定的協(xié)同作用，如催乳素（PRL）能增加胰島素促進乳汁分泌和改善乳品質(zhì)的作用效果，同時添加蛋白質(zhì)前體物氨基酸尤其是必需氨基酸能顯著提高泌乳奶牛的產(chǎn)奶性能等。也有研究表明，INS、PRL和氫化可的松(HYD)對奶牛乳腺上皮細胞生長、相關(guān)基因表達及酪蛋白相對含量的影響均存在著最佳使用劑量，即PRL 50 ng/mL、INS 50 ng/mL 和 HYD 1 ng/mL，且三者協(xié)同作用能促進奶牛乳腺上皮細胞增殖，抑制其凋亡，從而為乳腺的泌乳奠定良好的生理基礎(chǔ)（田青和王洪榮，2014、2013）。由此可以推測，三種激素的協(xié)同作用對其受體有一定的影響作用。因此，本試驗以本試驗室前期凍存的奶牛乳腺上皮細胞為對象，采用L9（34）正交試驗設(shè)計，研究了INS、PRL和HYD的協(xié)同作用對奶牛乳腺上皮細胞激素受體基因表達的影響，旨在得到有利于促進奶牛乳腺上皮細胞三種激素受體基因表達的最佳濃度組合，為后期的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 細胞：揚州大學(xué)草食動物營養(yǎng)實驗室凍存的4代奶牛乳腺上皮細胞。

主要試劑：DMEM/F12 （Gibco）、 胎牛血清（FBS，Gibco）、催乳素（Sigma）、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（Gibco）、表皮生長因子（Sigma）、氫化可的松（Sigma）、胰島素（Sigma）、胰蛋白酶（Gibco）、DMSO（Gibco）、兩性霉素 B（Amresco）、PBS（北京索萊寶）、熒光定量檢測試劑盒（TaKaRa，寶生物）。

儀器與設(shè)備：電熱恒溫CO2培養(yǎng)箱 （美國Thermo）、倒置顯微鏡（CKX41，Olympus）、冷凍離心機 （5415R 型， 德國 Eppendorf）、PCR 儀（ABI 2720型）、NanoDrop ND-1000濃度測定儀 （美國Thermo）、 熒光定量 PCR 儀 （ABI 7500 型）、i-MarkTM 酶標(biāo)儀（168-1130，美國 Bio-Rad）、移液器（德國 Eppendorf）。

1.2 試驗設(shè)計 細胞復(fù)蘇后等密度接種于6孔板，待細胞長滿70%～80%時，先用無血清、無激素但含雙抗、兩性霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基過渡16 h以上，后采用L9（34）正交試驗設(shè)計，即分別用含有不同濃度激素組合的生長培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個試驗獨立重復(fù)3次，具體方案見表1。

1.3 RNA的提取、cDNA的合成與real-time PCR 總RNA的提取：生長培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后收獲細胞， 用 RNAiso Plus （TaKaRa，D9108A）總RNA提取試劑盒提取RNA，所有RNA樣品用紫外分光光度計 （NANODROP-1000）測定其 260/280 nm吸收比率值，用以檢測RNA濃度、純度和完整性。提取的RNA保存于-70℃，待用。

表1 正交試驗因素與水平 ng/mL

反轉(zhuǎn)錄：以提取的RNA為模板，用Prime-Script? RT Master Mix（TaKaRa，DRR036A）反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，其總反應(yīng)體系為80 μL。轉(zhuǎn)錄得到的RT-PCR反應(yīng)液于4℃保存。

real-time PCR：反轉(zhuǎn)錄得到的RT反應(yīng)液用SYBR? Premix Ex TaqTM II（TaKaRa，DRR081A）試劑盒進行real-time PCR，采用20 μL體系。反應(yīng)條件為 95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 個循環(huán)；溶解曲線 95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s。

各基因的相對表達量用2-ΔΔCT值表示。

1.4 奶牛乳腺上皮細胞中激素受體相關(guān)基因表達的檢測 以GAPDH為內(nèi)參，采用Primer3軟件進行引物設(shè)計，引物信息見表2。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 所有原始數(shù)據(jù)先用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用SAS 9.1中ANOVA進行顯著性分析，Tukey法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準差”表示。

2 結(jié)果與分析

表3結(jié)果顯示，各試驗組三種激素受體基因表達量與對照組相比差異均不顯著（P>0.05），各試驗組之間三種激素受體基因表達量差異也不顯著（P>0.05），但各試驗組三種激素受體基因表達量均高于對照。

表2 引物信息

表3 激素協(xié)同作用對奶牛乳腺上皮細胞激素受體基因表達的影響

從三種激素協(xié)同作用對奶牛乳腺上皮細胞影響的最優(yōu)組合和影響程度來看，對s-PRLR基因，三種激素的最優(yōu)組合為A1B2C2（PRL 5 ng/mL、INS 50 ng/mL、HYD 1 ng/mL），三種激素對試驗結(jié)果的影響程度為C＞B＞A；對NR3C1基因，三種激素的最優(yōu)組合為 A2B1C3（PRL 50 ng/mL、INS 5 ng/mL、HYD 10 ng/mL），三種激素對試驗結(jié)果的影響程度為A＞B＞C；對INSR基因而言，三種激素的最優(yōu)組合為 A2B2C1（PRL 50 ng/mL、INS 50 ng/mL、HYD 0.1 ng/mL），三種激素對試驗結(jié)果的影響程度為A＞C＞B。

3 討論

通過對試驗結(jié)果的分析可以看出，受體基因不同，三種激素的最優(yōu)組合和影響程度也各不相同，試驗結(jié)果并未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律，也沒有對三種激素受體均一致的最優(yōu)組合。但可發(fā)現(xiàn)，三種激素的組合中某種激素含量高，對應(yīng)的該種激素受體的表達量就高 （氫化可的松除外，NR3C1的表達量隨著氫化可的松的增加而降低），由此可知，對于泌乳期的奶牛，催乳素的需要量適當(dāng)大一些，胰島素次之，氫化可的松的用量最小。

研究認為胰島素通過與受體結(jié)合，主要通過mTOR信號通路發(fā)揮作用，即胰島素激活I(lǐng)RS-1，IRS-1的磷酸化可活化信號分子PI3K，活化后的PI3K催化其下游靶蛋白Akt磷酸化，磷酸化的Akt抑制TSC2的活性，在TSC1的參與下，mTOR被激活，進而發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝的功能 （Biona和Loor，2011；Sophie 等，2007）；對于催乳素，比較公認的則是催乳素與受體結(jié)合后激活JAK2/STAT5信號通路，也可激活Ras/Raf/MAPK及ERK和PI3K/AKT信號通路，進而促進奶牛乳腺上皮細胞的增殖，維持泌乳和促進乳蛋白的合成（Swaminathan 等，2008；Wagner等，2004；）；關(guān)于氫化可的松參與奶牛乳蛋白合成調(diào)控的研究并不多見，但有研究表明糖皮質(zhì)激素通過調(diào)控E6-P53-miR145信號通路誘導(dǎo)宮頸癌細胞產(chǎn)生耐藥表型 （杜利彬，2011），也有研究表明氫化可的松發(fā)揮作用主要是在機體處于能量負平衡等特殊狀態(tài)下促進乳腺周圍營養(yǎng)物質(zhì)的重分配而維持產(chǎn)奶量和乳蛋白含量的，由此可以推測，動物處于不同生理條件下，氫化可的松的作用信號通路不同，糖皮質(zhì)激素發(fā)揮的作用也不同。在奶牛的乳腺中，前期研究發(fā)現(xiàn)單獨添加氫化可的松的確具有增加奶牛乳腺上皮細胞合成乳蛋白能力的作用（田青和王洪榮，2014）。

從功能上來看，催乳素的主要功能是啟動和維持泌乳，胰島素則主要與能量代謝有關(guān)，而氫化可的松主要與炎癥反應(yīng)（免疫）有關(guān)。催乳素可以通過與其受體結(jié)合先為泌乳的啟動和維持奠定生理基礎(chǔ)（充分發(fā)育的乳腺），胰島素可以通過與其受體結(jié)合為乳腺上皮細胞的生長、泌乳的啟動和維持提供能量保證（充分的能量），而氫化可的松則可以通過與其受體結(jié)合而維持乳腺細胞組織健康。在體外培養(yǎng)的條件下，奶牛乳腺上皮細胞要增殖和生長就需要較多的催乳素和胰島素參與，所以催乳素和胰島素受體的表達量也相對較高；而體外培養(yǎng)主要是在無菌條件下培養(yǎng)得到的具有正常形態(tài)和生物學(xué)功能的健康乳腺上皮細胞，所以不需要更多的氫化可的松發(fā)揮其抗炎癥功能，因此對應(yīng)的氫化可的松受體基因表達量就較低。

4 結(jié)論

4.1 催乳素、胰島素和氫化可的松協(xié)同作用有利于促進PRLR、NR3C1、INSR基因受體的表達。

4.2 催乳素、胰島素和氫化可的松協(xié)同促進s-PRLR、NR3C1和INSR基因表達的最優(yōu)組合分別為催乳素5 ng/mL、胰島素50 ng/mL、氫化可的松1 ng/mL，催乳素50 ng/mL、胰島素5 ng/mL、氫化可的松10 ng/mL和催乳素50 ng/mL、胰島素50 ng/mL、氫化可的松0.1 ng/mL；對s-PRLR、NR3C1和INSR基因表達影響的大小次序分別為：氫化可的松>胰島素>催乳素；催乳素>胰島素>氫化可的松；催乳素>氫化可的松>胰島素。

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