?？←悾?李吉楠， 劉 輝， 潘 龍， 王 建

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京海淀 100193）

飼用微生物又稱益生菌或者競爭性細菌培養(yǎng)物，是一種能夠提高動物生產(chǎn)性能、無毒無殘留的新型飼料添加劑，已成為抗生素的理想替代品。鄧露芳等（2009）認為飼用微生物作為一種微生物飼料添加物，可通過改善宿主體內(nèi)和周邊的微生物區(qū)系，而提高飼料營養(yǎng)價值和動物對飼料的利用率，降低宿主發(fā)病率、死亡率。飼用微生物不僅能改變瘤胃發(fā)酵模式，還能提高動物的生產(chǎn)性能。有研究報道，在反芻動物日糧中添加飼用微生物能夠提高瘤胃和整個消化道干物質（DM）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）和粗蛋白質（CP）的消化率，提高干物質采食量，提高奶牛的產(chǎn)奶量，改善奶品質，提高飼料轉化率，且具有減緩熱應激，改善奶牛體況的作用（黃帥等，2010；欒廣春等，2008）。本試驗旨在通過體外產(chǎn)氣法和體外批次培養(yǎng)法研究不同添加水平的枯草芽孢桿菌、活性酵母粉、瘤胃發(fā)酵增強劑和米曲霉對體外發(fā)酵產(chǎn)氣量及動力學參數(shù)、體外營養(yǎng)物質降解率、瘤胃發(fā)酵模式和瘤胃氮代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 供體動物飼養(yǎng)和瘤胃液的采集 北京中地種畜有限公司試驗基地選取3頭健康且裝有永久性瘤胃瘺管的泌乳期荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體牛。奶牛每天飼喂 3 次（7∶00、13∶00 和 19∶00），自由飲水。于晨飼前1 h通過瘤胃瘺管采集3頭奶牛瘤胃內(nèi)容物，混合后裝于保溫瓶帶回，用4層紗布過濾（過濾同時通入CO2），整個操作于39℃水浴中進行，操作盡量在最短時間內(nèi)完成。

1.2 添加劑和試驗日糧 四種反芻動物飼料添加劑分別為：枯草芽孢桿菌（BS），主要成分為特強產(chǎn)酶菌株、產(chǎn)酸菌株、腸道抗感染菌株，以及有益菌代謝產(chǎn)物，活菌數(shù)大于5×108cfu/g；活性酵母粉（PRO）一種粉料型高濃縮活性酵母，活性酵母數(shù)大于 1.5×1010cfu/g；瘤胃發(fā)酵增強劑（FIB），是一種米曲霉培養(yǎng)物、黑曲霉培養(yǎng)物和乳酸馬科斯克魯維酵母混合發(fā)酵產(chǎn)物；米曲霉（AO）為米曲霉和黑曲霉混合菌株，總孢子數(shù)量大于1.5×1010個/g。

試驗所用飼料與供體動物飼喂的飼料一致，飼料原料粉碎并過2 mm篩，按照配方制成顆粒料，風干后備用。基礎日糧組成和營養(yǎng)水平如表1所示。

表1 基礎日糧組成和營養(yǎng)水平（干物質基礎）

1.3 試驗設計 試驗一：體外產(chǎn)氣試驗，采用完全隨機設計，3個添加水平的4種反芻動物飼料添加劑隨機分為12個組，同時設不添加添加劑的空白對照組，每組4個重復。四種添加劑的添加水平均為 0、1、2、4 g/kg 日糧底物。 試驗期為 72 h，重復發(fā)酵2期。

試驗二：體外批次培養(yǎng)試驗，每種飼料添加劑均采用4×4二因子設計，因子一為4種不同添加劑量，分別為 0、1、2、4 g/kg 日糧底物，因子二為不同發(fā)酵時間 6、12、24、36 h。 試驗期為 36 h，重復發(fā)酵2期。

1.4 體外發(fā)酵 試驗一體外產(chǎn)氣裝置采用AGRS-Ⅲ微生物發(fā)酵微量產(chǎn)氣自動記錄儀（AGRS）（沈英等，2007）。準確稱取約0.5 g飼料樣品于150 mL厭氧發(fā)酵瓶中，每個瓶中分別加入相應種類和劑量的添加劑。接種時迅速向每個瓶中加入50 mL預熱的液體培養(yǎng)基和25 mL經(jīng)4層紗布過濾的新鮮瘤胃液，液體培養(yǎng)基采用Menke和Steingass（1988）的方法配制，并向瓶中持續(xù)通入CO25 s后，立即蓋上瓶塞，并將每個發(fā)酵瓶與產(chǎn)氣裝置的每個傳感器相連接，于39℃下連續(xù)培養(yǎng)72 h。

試驗二體外發(fā)酵裝置采用ANKOM Daisy II體外模擬發(fā)酵培養(yǎng)箱，選擇10～40 μm尼龍布，采用熱封的方法制成3 cm×6 cm的尼龍袋，105℃烘至恒重，并記錄每個尼龍袋重量，向每個已知重量的尼龍袋中準確稱取約0.5 g飼料。尼龍繩封口后放置于DaisyⅡIncubator培養(yǎng)箱消化罐中，每個罐放置26個袋子，平均放在消化罐的分隔板兩側，于 39 ℃下分別培養(yǎng) 6、12、24、36 h。

1.5 樣品采集與制備 試驗一在發(fā)酵72 h的過程實時記錄產(chǎn)氣量，72 h產(chǎn)氣結束后，將發(fā)酵瓶放在冰水中終止發(fā)酵。

試驗二在發(fā)酵 6、12、24、36 h 后分別從每個罐中取出4、6、8、8個尼龍袋和15 mL發(fā)酵液體，取樣時間盡量短，取完后及時向罐中充CO2數(shù)十秒，把罐依次放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。從每個罐中取出的尼龍袋用來測定可消化干物質（DMD）、NDF、ADF和 CP，收集的發(fā)酵液用于氨態(tài)氮（NH3-N）和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測定。

1.6 指標測定及方法

1.6.1 發(fā)酵產(chǎn)氣指標的測定及產(chǎn)氣動力學模型分析 通過AGRS-Ⅲ型64通路微生物發(fā)酵微量產(chǎn)氣全自動記錄裝置與軟件系統(tǒng)記錄產(chǎn)氣量。參照Groot等（1996）指數(shù)模型對不同日糧累積產(chǎn)氣量數(shù)據(jù)進行非線性擬合。

GPt（mL/g DM）=A/[1+（C/t）B]；

式中：GPt為t時間點記錄到的累積產(chǎn)氣量，mL/g；A為發(fā)酵時間無限延長時的理論最大產(chǎn)氣量；B為所形成的產(chǎn)氣曲線的平滑度；C為達到理論產(chǎn)氣量最大值A一半時所需要的時間，h。

最大產(chǎn)氣速率 （RmaxG，mL/h）=[A×CB×B×TRmaxS（-B-1）]/[1+CB×TRmaxS（-B）]2；

達到最大產(chǎn)氣速率所需要的時間（TRmaxG，h）=C×[（B-1）/（B-1）]（1/B）；

底物的最大降解率（RmaxS）=[B×TRmaxS（B-1）]/（CB+TRmaxSB）；

達到底物最大降解率時所需要的時間（TR-maxS，h）=C×（B-1）（1/B）。

1.6.2 發(fā)酵液pH的測定 發(fā)酵結束后立即用pH計測定發(fā)酵液的pH。

1.6.3 發(fā)酵液中菌體蛋白（MCP）濃度的測定 發(fā)酵液中的MCP采用Makkar和Becker（1999）的嘌呤法，使用酵母RNA做標準曲線。

1.6.4 發(fā)酵液中NH3-N濃度的測定 發(fā)酵液中NH3-N濃度利用靛酚比色法測定（王加啟，2011）。

1.6.5 發(fā)酵液中VFA濃度的測定 VFA濃度采用氣相色譜法測定（丁洪濤等，2012）。色譜條件如下：以氮氣作為載氣，色譜柱：DB-FFAP（15 m×0.32 mm×0.25 μm）。柱溫：70℃，3℃/min至125℃，再以30℃/min至180℃，保持5 min。進樣口溫度：250℃。檢測器溫度：280℃。恒壓：25 kPa。分流比為 1∶20。進樣量為 2 μL。

1.6.6 營養(yǎng)物質體外降解率的測定 IVDMD(DNDF、DADF、DCP)%= [樣 品 中 DM （NDF、ADF、CP）量（g） - 降解后殘渣中 DM（NDF、ADF、CP）量(g)]/樣品中 DM（NDF、ADF、CP）量（g）×100；

式中：IVDMD為體外干物質降解率；DNDF為中性洗滌纖維降解率；DADF為酸性洗滌纖維降解率；DCP為粗蛋白質降解率。

本試驗中DM和CP參照AOAC（2000）的方法進行測定；NDF和 ADF采用 Van Soest等（1991）的方法測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理 對數(shù)據(jù)使用Excel 2013進行初步整理后，采用SAS 9.2軟件中的GLM模型進行統(tǒng)計分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 不同添加劑的不同添加水平對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)的影響 由表2可知，隨著枯草芽孢桿菌添加劑量的增加，其GP72（P=0.0787）和A （P=0.0874）有線性增加的趨勢，TRmaxG呈三次方顯著增加（P<0.05），TRmaxS有三次方變化的趨勢（P=0.0585）， 參數(shù) C、RmaxG、RmaxS 未受枯草芽孢桿菌添加劑量的影響（P>0.05）；隨著活性酵母粉添加劑量的增加，GP72有二次方增加的趨勢（P=0.0566），A 呈二次方顯著增加 （P<0.05），但參數(shù) B、C、RmaxG、TRmaxG、RmaxS、TRmaxS 未受活性酵母粉添加劑量的影響（P>0.05）；隨著米曲霉添加劑量的增加，GP72和A呈線性增加 （P<0.05），B 有線性增加的趨勢（P=0.0945），且 4 g/kg劑量組的GP72和A分別比對照組提高了16%和19%，而參數(shù) C、RmaxG、TRmaxG、RmaxS、TRmaxS未受米曲霉添加劑量的影響（P>0.05）；隨著瘤胃發(fā)酵增強劑添加劑量的增加，GP72和A呈線性增加（P<0.05），且 4 g/kg劑量組的 GP72和 A分別比對照組提高了28%和30%，RmaxS有三次方變化趨勢 （P=0.0612）， 但參數(shù) B、C、RmaxG、TR-maxG、TRmaxS未受瘤胃發(fā)酵增強劑添加劑量的影響（P>0.05）。

2.2 不同添加劑的不同添加水平對體外營養(yǎng)物質降解率的影響 由表3可知，1、2、4 g/kg劑量組的枯草芽孢桿菌的IVDMD均顯著高于對照組（P<0.05），但并未影響 DNDF、DADF 和 DCP；活性酵母粉1、2、4 g/kg劑量組的IVDMD顯著高于對照組（P<0.05），隨著活性酵母粉添加劑量的增加，DNDF呈三次方變化的趨勢（P=0.0919），與對照組相比，1、4 g/kg DM添加劑量組的DADF顯著升高 （P<0.05），1、2 g/kg DM 添加劑量組的DCP差異不顯著，4 g/kg DM添加劑量組的DCP顯著降低 （P<0.05）；隨著米曲霉添加劑量的增加，DNDF變化顯著，DADF呈三次方顯著變化（P=0.0124），DCP 有線性降低的趨勢（P=0.0697），1 g/kg DM劑量組的DNDF和DADF均顯著高于其他劑量組（P<0.05）；瘤胃發(fā)酵增強劑各劑量組的IVDMD均顯著高于對照組（P<0.05），隨著其添加劑量的增加，DNDF有線性降低的趨勢 （P=0.0905），DADF呈二次方顯著變化，1 g/kg DM組的DADF顯著低于其他處理組 （P<0.05），DCP未受瘤胃發(fā)酵增強劑的影響（P>0.05）。

表2 不同劑量的枯草芽孢桿菌、活性酵母粉、米曲霉和瘤胃發(fā)酵增強劑對瘤胃發(fā)酵72 h產(chǎn)氣參數(shù)的影響

2.3 不同添加劑的不同添加水平對氨態(tài)氮的影響 由表4可以看出，與對照組相比，枯草芽孢桿菌各劑量組的NH3-N濃度差異不顯著；活性酵母粉1、4 g/kg劑量組NH3-N顯著低于對照組（P<0.05），分別比對照組降低 13%、4%；米曲霉2、4 g/kg劑量組 NH3-N顯著低于對照組 （P<0.05），均比對照組降低8%，而1 g/kg劑量組和對照組差異不顯著；瘤胃發(fā)酵增強劑1、2 g/kg劑量組NH3-N顯著低于對照組（P<0.05），而與4 g/kg劑量組差異不顯著，1、2 g/kg劑量組分別比對照組降低8%、11%。

表3 不同劑量的枯草芽孢桿菌、活性酵母粉、米曲霉和瘤胃發(fā)酵增強劑對體外批次培養(yǎng)36 h營養(yǎng)物質降解率的影響

表4 不同劑量的枯草芽孢桿菌、活性酵母粉、米曲霉、瘤胃發(fā)酵增強劑對體外批次培養(yǎng)36 h氨態(tài)氮的影響

2.4 不同添加劑的不同添加水平對瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸的影響 從表5可以看出，體外批次發(fā)酵24 h后，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸以及乙酸/丙酸均未受枯草芽孢桿菌添加劑量的影響，隨著枯草芽孢桿菌添加劑量的增加，戊酸濃度線性降低（P<0.05），其中 4 g/kg DM添加劑量組的戊酸濃度顯著低于0、1 g/kg DM劑量組（P<0.05），總VFA有線性降低的趨勢 （P=0.0807）；VFA的各組分濃度、總VFA濃度以及乙酸/丙酸未受活性酵母粉添加劑量和米曲霉添加劑量的影響；瘤胃發(fā)酵增強劑并未影響乙酸、丁酸、總VFA以及乙酸/丙酸，隨著瘤胃發(fā)酵增強劑添加劑量的增加，丙酸（P=0.0870）、異丁酸（P=0.0934）、異戊酸（P=0.0766）、戊酸（P=0.0841）呈二次方增加趨勢，其中1.0 g/kg DM劑量組的丙酸、異戊酸、戊酸濃度均顯著高于對照組（P<0.05）。

表5 不同劑量的枯草芽孢桿菌、活性酵母粉、米曲霉、瘤胃發(fā)酵增強劑對體外批次培養(yǎng)24 h瘤胃液中VFA的影響

3 討論

3.1 四種飼料添加劑對體外產(chǎn)氣量的影響 體外產(chǎn)氣量可以反映出瘤胃中微生物的降解活性和飼料降解率（Menke 和 Steingass，1988），能有效預測體內(nèi)干物質的代謝能及降解率，相關系數(shù)達0.98（Menke 等，1979）。 孫華（2012）分別以羊草、苜蓿、玉米青貯作為飼料底物，添加米曲霉培養(yǎng)物通過體外產(chǎn)氣試驗發(fā)酵24 h后發(fā)現(xiàn)，添加米曲霉培養(yǎng)物處理組的產(chǎn)氣量、潛在產(chǎn)氣量和有機物消化率顯著提高。鄧露芳等（2008a）通過添加納豆枯草芽孢桿菌的體外產(chǎn)氣試驗證明，與對照組相比，添加納豆枯草芽孢桿菌處理組的產(chǎn)氣量提高11.89%（P<0.05）。本試驗研究表明，枯草芽孢桿菌對72h總產(chǎn)氣量影響不顯著，4 g/kg劑量的活性酵母粉、米曲菌和瘤胃發(fā)酵增強劑均提高了72 h總產(chǎn)氣量。

3.2 四種飼料添加劑對體外營養(yǎng)物質降解率的影響 干物質降解率是反映飼料被動物所利用程度的重要指標，降解率越高，飼料的可利用程度就越高（趙祥等，2005），其在一定程度上反映了飼料營養(yǎng)成分在動物體內(nèi)的降解情況。Gomez-Alarcon等（1990）研究表明，米曲霉提高了纖維在瘤胃中的降解率。黃帥等（2010）研究表明，日糧中添加0.04%DM和0.08%DM的米曲霉顯著提高了日糧的IVDMD、DCP、DNDF 和DADF。米曲霉培養(yǎng)物具有高纖維素酶活性（Di Francia等，2008），纖維素酶可以增加真菌假根的滲透，促進植物組分與真菌的接觸，從而促進纖維成分的消化（Chang等，1999）。此外，米曲霉培養(yǎng)物能夠增加纖維分解菌的數(shù)量，進而促進纖維物質的降解（Gomez-Alarcon等，1990）。就纖維的降解性而言，真菌型的添加劑比細菌型的添加劑效果更佳。本試驗結果表明，枯草芽孢桿菌、活性酵母粉和瘤胃發(fā)酵增強劑均顯著提高了體外培養(yǎng)36 h的IVDMD，枯草芽孢桿菌對DNDF、DADF和DCP影響不顯著，1 g/kg劑量組的米曲菌顯著提高了DNDF和 DADF；1、4 g/kg的活性酵母粉顯著增加了DADF，1 g/kg的瘤胃發(fā)酵增強劑顯著降低了DADF。

3.3 四種飼料添加劑對瘤胃體外培養(yǎng)發(fā)酵液中NH3-N的影響 瘤胃NH3-N是一個動態(tài)平衡過程，能夠綜合反映瘤胃內(nèi)特定飼糧組成條件下蛋白質降解及微生物對NH3-N利用情況。一方面飼料被瘤胃微生物分解產(chǎn)生NH3-N；另一方面瘤胃中的微生物利用降解產(chǎn)生的NH3-N與酮酸合成微生物蛋白質（劉彩娟等，2011）。NH3-N是維持微生物生長和蛋白質合成的重要氮源。孫華（2012）研究表明，米曲霉培養(yǎng)物顯著降低了精粗料分別為玉米和玉米青貯日糧的瘤胃NH3-N濃度，這與本試驗研究結果一致。本試驗結果表明，1、4 g/kg 的活性酵母粉，2、4 g/kg 的米曲霉，1、2 g/kg的瘤胃發(fā)酵增強劑可顯著降低NH3-N的濃度。瘤胃中NH3-N濃度在6～30 mg/dL最適合瘤胃微生物發(fā)酵（姜旭明等，2009；Ghorbani等，2002），本試驗NH3-N濃度均在此范圍內(nèi)，說明其能滿足瘤胃微生物的生長需要。

3.4 四種飼料添加劑對瘤胃體外培養(yǎng)揮發(fā)性脂肪酸的影響 瘤胃液VFA是反芻動物碳水化合物在瘤胃中降解的產(chǎn)物，其含量和組成是反映瘤胃消化代謝能力的重要指標。乙酸是反芻動物乳腺合成乳脂中脂肪酸的重要底物（馮仰廉，2004），丙酸是糖異生的主要前體物質。Higginbotham等（2004）研究表明，米曲霉培養(yǎng)物的添加并未影響瘤胃液中的VFA，與本試驗中添加米曲霉培養(yǎng)物的研究結果一致。與鄧露芳等 （2008b）、Peng等（2012）、Sun 等（2013）的研究結果不同。 本試驗結果表明，添加枯草芽孢桿菌并未影響瘤胃液中乙酸、丙酸的水平，但隨著添加劑量的增加，戊酸和總VFA的水平有線性降低的趨勢，這可能是不同枯草芽孢桿菌菌種間的差異造成的。本試驗結果表明，活性酵母粉對瘤胃液中VFA的生成無顯著影響；添加1 g/kg的瘤胃發(fā)酵增強劑時，丙酸、異戊酸、戊酸濃度顯著增加。

4 結論

4.1 添加4 g/kg的活性酵母粉、米曲霉和瘤胃發(fā)酵增強劑顯著提高了體外產(chǎn)氣量，在不改變瘤胃發(fā)酵類型且未對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生負面影響的情況下，添加四種反芻動物飼料添加劑均不同程度提高了飼料營養(yǎng)物質降解率。

4.2 除枯草芽孢桿菌對NH3-N濃度無顯著影響外，活性酵母粉、米曲菌和瘤胃發(fā)酵增強劑均不同程度降低了NH3-N濃度。

4.3 活性酵母粉和米曲菌并未對瘤胃VFA產(chǎn)生顯著影響，1 g/kg劑量組的枯草芽孢桿菌顯著增加了戊酸濃度，1 g/kg的瘤胃發(fā)酵增強劑顯著增加了丙酸、異戊酸和戊酸濃度。

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