王曉謙，秦小明，鄭惠娜，章超樺

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東湛江，524088)

超高壓加工技術(shù)是近年來新興起的非熱加工技術(shù)。它是指將食品經(jīng)包裝后放入密封的、施加高強度壓力的容器中，常用水或礦物油等流體作為傳遞壓力的介質(zhì)，在靜高壓(大于100 MPa)一定溫度下處理一段時間，導(dǎo)致食品成分、非共價鍵(氫鍵、離子鍵和疏水鍵等)的破壞或形成，使食品中的蛋白質(zhì)、酶、淀粉等生物大分子物質(zhì)變性、失活和糊化，同時殺死食品中的微生物，進而達到食品滅菌、加工和保藏的目的。與傳統(tǒng)的熱處理相比，對食品的色香味、功能性及營養(yǎng)成分有較好的保護作用。

牡蠣營養(yǎng)價值豐富，味道鮮美。但牡蠣開殼后，由于沒有組織的保護，很容易產(chǎn)生破肚、黃變等傷害，自身的有機體也會發(fā)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng)而直接影響牡蠣的質(zhì)量。加之牡蠣肉質(zhì)柔軟，不耐藏，不耐凍，給新鮮牡蠣的流通造成了一定的難度，進而限制了牡蠣產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

本研究以優(yōu)化的殺菌工藝作為超高壓處理條件，比較分析超高壓處理和熱處理對牡蠣營養(yǎng)成分、肌肉品質(zhì)以及呈味成分含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香港牡蠣(Crassostrea hongkongensis)，選取長度為12～14 cm鮮活牡蠣，購于湛江市霞山東風(fēng)水產(chǎn)批發(fā)市場;海水，取自湛江東海島海水井;真空包裝袋(PE+PET雙層復(fù)合，雙面0.14 mm)，河北新興塑料廠;戊二醛(AR)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;三磷酸腺苷(ATP)、鳥苷酸(GMP)、肌苷酸(IMP)、二磷酸腺苷(ADP)、次黃嘌呤核苷酸(Hx)、磷酸腺苷(AMP)、次黃嘌呤(HxR)、乳酸、琥珀酸甜菜堿(GR)，Sigma公司。

超高壓設(shè)備HPP.L2-600/0.6，天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司;質(zhì)構(gòu)分析儀TMS-PRO，美國FTC公司;色差計CR-10，日本美達能;水浴鍋HHS，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;差示掃描量熱儀DSC204F1，德國NETZSCH公司;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀SHIMADZUQP-2010Plus，日本島津公司;高效液相色譜儀LC-20AD，日本島津儀器有限公司;數(shù)顯pH計PHS-25，上?？祪x儀器有限公司;精密電子天平BL-6205，上海市島津制作所;自動凱氏定氮儀KDN-08C，上海新嘉儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣肉的前處理

牡蠣經(jīng)凈化［1］后，分成3組，即空白組(control)，超高壓組(high pressure，HP)和加熱組(high temperature，HT)?？瞻捉M未經(jīng)任何處理;超高壓處理條件為壓力300 MPa，保壓時間20 min，處理溫度為30℃(升壓速度為30 MPa/s，卸壓速度200 MPa/s);熱處理組條件［2］為75℃水煮加熱8 min。

1.2.2 基本營養(yǎng)成分測定

水分含量的測定:105℃恒溫烘箱干燥法，參考GB/T 5009.3-2010。

粗蛋白含量的測定:凱氏定氮法，參考 GB/T 5009.5-2010。

粗脂肪含量的測定:索氏抽提法，參考 GB/T 5009.5-2003。

總糖含量的測定:分光光度法，參考 GB/T 9695.31-2008。

灰分的測定:高溫灼燒法，參考 GB/T 5009.4-2010。

1.2.3 pH值測定

牡蠣的pH的測定方法參照《水產(chǎn)品衛(wèi)生標準的分析方法》(GB/T 5009.45-2003)。將牡蠣肉絞碎均勻，取10 g肉糜，加入90 mL蒸餾水，攪拌均勻，靜置30 min，用pH計測定其pH值。每組測定3次，取平均值。

1.2.4 質(zhì)構(gòu)的測定

將經(jīng)過超高壓處理的牡蠣肉的閉殼肌取下，根據(jù)要求剪成高4 mm、直徑6 mm的圓柱狀，牡蠣組織(簡稱組織組)的測定則選取背部肌肉腮絲方向5 mm處為佳，每個處理條件4個平行樣。

測定前將樣品放置室溫，選擇直徑50 mm平底柱形探頭P/50，測定條件為:距離6 mm，形變百分量為50%，檢測速度為60 mm/min，起始力0.5 N。測定及計算參數(shù)包括硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼度。各參數(shù)的檢測和計算參照Bourne［3］質(zhì)構(gòu)特性參數(shù)的計算方法。

1.2.5 色差的測定［4］

利用色差計反射法來測定牡蠣表面的顏色，分別測定香港牡蠣背部、腹部和背部肌肉的顏色，用L、a、b值來描述牡蠣顏色的變化。L值表示樣品亮度，+a代表偏紅，-a代表偏綠，+b代表偏黃，-b代表偏藍。由于水產(chǎn)品個體差異性較大，因此每組4只牡蠣，每只牡蠣的不同部位測定10次，取平均值作為樣品色值來源。

1.2.6 差示掃描量熱(DSC)分析

參照趙偉［5］的方法。取剁碎閉殼肌、勻漿牡蠣肉樣品6 mg左右，置于DSC鋁盒中，然后用配套鋁蓋密封，記下樣品的精確質(zhì)量，以空白鋁盒作為對照，以10℃/min的加熱速度使鋁盒溫度從30℃上升到130℃。記錄并計算吸熱曲線上蛋白質(zhì)變性的起始溫度(T0)，峰值溫度(Tp)，終止溫度(Tc)。

1.2.7 光學(xué)顯微鏡

參考黃萬有［6］的方法，略有改動。將牡蠣閉殼肌和背部肌肉腮絲方向5 mm處附近組織樣品切下，用10%甲醛固定，用體積分數(shù)30%、50%、70%、90%、100%乙醇脫水，然后浸泡于50～60℃石蠟中，再進行包埋，使用切片機將已包埋好的蠟塊貼在潔凈的載玻片上，用乙醇進行復(fù)水(體積分數(shù)依次為90%、70%、50%、30%)，采用蘇木精-伊紅(HE)染色法進行染色，烘干，然后至于光學(xué)顯微鏡下進行觀察拍照。

1.2.8 掃描電鏡

參考Nishimura［7］的方法，略有改動。將經(jīng)不同處理后的牡蠣的閉殼肌和組織切成較小的薄片至于4℃下，用體積分數(shù)2.5%戊二醛固定3 d，用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗數(shù)次，每次15 min，于室溫下用30%、50%、70%、90%乙醇梯度脫水，各15 min，再用100%乙醇脫水2次，每次1 h。樣品脫水后，進行冷凍干燥，隨后用離子濺射儀給干燥好的樣品表面鍍一層金屬膜，掃描電子顯微鏡(SEM)在電壓為15.0 kV下放大相應(yīng)倍數(shù)500×，進行掃描電鏡觀察。

1.2.9 呈味成分

1.2.9.1 游離氨基酸的測定

柱前衍生法測定［8］。

1.2.9.2 核苷酸及其關(guān)聯(lián)化合物的測定

參照劉亞［9］的方法，略有改動。

洗脫條件:二元梯度洗脫，梯度洗脫程序為0～14 min為流動相A洗脫，14～18 min時流動相B由0增至25%，18～22 min時流動相B上升至90%，22 min過渡到用100%流動相B進行洗脫，保持B洗脫15 min。

標準溶液的配制:分別準確稱取ATP、GMP、IMP、ADP、Hx、AMP、HxR 標準品0.012 5 g，用超純水溶解并混合定容于25 mL容量瓶中，成為混合標準。再進行稀釋，分別配制成 2、10、20、50、100、500 μg/mL 的混合標液，上機前再用0.22 μm的微孔濾膜過濾。

1.2.9.3 有機酸的測定

有機酸的測定參考GB/T 5009.157-2003及劉亞［10］等的方法。

樣品處理:準確稱取5g左右牡蠣勻漿，用30 mL 2%NH4H2PO4(pH 2.5)混勻，超生振蕩20 min，12 000 r/min離心20 min，取上清液，沉淀重新用10 mL 2%NH4H2PO4提取2次，定容至50 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HPLC條件:色譜柱:Cosmosil 5 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);檢測波長:205 nm;柱溫:25 ℃;進樣量20 μL;流動相:2%NH4H2PO4(pH 2.5)，流速1.0 mL/min。

1.2.9.4 無機離子的測定

陽離子(K+、Na+):采用試劑盒測定。

陰離子:Cl-采用硝酸銀滴定法(GB/T 12457-2008)，P043-用鋁藍比色法(GB/T 5009.87-2003)。

1.2.9.5 甜菜堿的測定

采用雷氏鹽結(jié)晶比色法，參考陳德慰［11］及NY/T 1746-2009。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示;方差分析(ANOVA)用JMP 7.0軟件進行顯著性(P＜0.05)分析，作圖采用origin8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 UHP和熱處理對基本營養(yǎng)成分的影響

牡蠣不同處理方式的基本營養(yǎng)成分見表1。從表1中可以看出，香港牡蠣經(jīng)超高壓處理后，水分含量顯著增多(P＜0.05)，這可能是因為高壓促進了水分的溶出［12］，另外高壓促進了蛋白質(zhì)發(fā)生水合作用，進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)吸收了水分［13］;蛋白質(zhì)含量顯著降低(P＜0.05)，說明超高壓處理會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，導(dǎo)致含量降低，也可能是因為超高壓處理后使牡蠣黏液的粘性增強，使得鹽溶性蛋白質(zhì)和灰分吸出［14］;粗脂肪含量和總糖含量均未發(fā)生顯著變化(P＞0.05);灰分含量顯著減少(P＜0.05)。綜合比較，可以認為超高壓處理能夠較好的保留香港牡蠣的原有營養(yǎng)成分。

表1 不同處理方式對香港牡蠣基本營養(yǎng)成分的影響 %Table 1 Proximate compositions of oysters by different treatment

2.2 UHP和熱處理對pH的影響

圖1所示的是牡蠣經(jīng)不同處理方式處理后對pH值的影響。

圖1 不同處理方式對pH的影響Fig.1 The influence of different treatment on pH

從圖1中可知，超高壓處理比未經(jīng)處理的牡蠣有較大的pH值，壓力增大pH值顯著增大(P＜0.05)。Cruz-Romero［2］的研究也出現(xiàn)了類似的情況，這可能是因為壓力造成某些蛋白質(zhì)變性引起的，使得影響pH值的低分子化合物的氨基增多，導(dǎo)致pH值增大［15］。另一方面，超高壓處理后，由于牡蠣表面殘留的生理鹽水被吸收，而生理鹽水的pH值比牡蠣的pH值高。加熱處理的牡蠣pH值最大，可能是由于加熱造成蛋白質(zhì)中酸性基團減少2/3左右，而堿性基團的數(shù)量幾乎沒有變化［16］。與熱處理相比，超高壓組pH值更接近空白組。

2.3 UHP和熱處理對質(zhì)構(gòu)的影響

圖2是不同處理方式對牡蠣閉殼肌和組織硬度、彈性、咀嚼性和內(nèi)聚性的影響。

圖2 不同處理方式與硬度、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性的關(guān)系Fig.2 The influence of different treatment on hardness，springiness，chewiness，cohesiveness

超高壓處理后閉殼肌硬度顯著增大，這與Ashie［17］的研究結(jié)果相似。發(fā)生這種變化的原因是壓力升高，牡蠣體積被壓縮，進而促進了蛋白質(zhì)之間的相互作用。影響硬度的因素還有很多，如含水量、蛋白質(zhì)含量等。咀嚼性隨壓力的變化與硬度呈正相關(guān)，這種變化是因為高壓引起蛋白質(zhì)變性形成凝膠導(dǎo)致的。超高壓對彈度的影響不顯著(P＞0.05)，影響彈性的主要因素有含水量、pH值等。

超高壓處理后牡蠣組織的硬度、彈性、咀嚼性隨壓力變化顯著降低(P＜0.05)，內(nèi)聚性變化不顯著(P＞0.05)。這是由于牡蠣組織的含水量比閉殼肌要大得多，超高壓作用后使水分吸出，導(dǎo)致硬度、彈性、咀嚼性都降低。但熱處理組質(zhì)構(gòu)各指標的變化比超高壓組更為突出，因為熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生嚴重不可逆變性。

2.4 超高壓處理對色差的影響

圖3為不同方式處理對牡蠣L值、a值、b值的影響。

圖3 不同處理方式對L值、a值、b值的影響Fig.3 The influence of different treatment on L，a，b

比較了牡蠣背部、腹部和背部肌肉的變化，其中背部肌肉的變化最為明顯。超高壓處理后，L值顯著增大，a值、b值顯著降低。超高壓處理后肌肉顏色的變化最為明顯，這是因為肌纖維蛋白質(zhì)和肌漿蛋白質(zhì)的變性導(dǎo)致的。這個結(jié)果與Cruz-Romero［2］的結(jié)果相似。用肉眼觀察(圖4)，HP組與空白組的牡蠣相比，外觀有點微黃，而熱處理后的牡蠣整體發(fā)白。脂肪氧化是顏色改變的一個原因，超高壓處理后脂肪氧化加快的主要原因是游離金屬離子含量增多。牡蠣閉殼肌和組織顏色的改變可能與蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)氧化有關(guān)［18］。整體來看，由于蛋白質(zhì)受熱凝固，熱處理組牡蠣腮絲等部位發(fā)生明顯扭曲變形，因此，與熱處理相比，超高壓在牡蠣外觀更接近空白組。

圖4 不同處理方式對牡蠣色澤的影響Fig.4 The influence of different treatment on colour

2.5 UHP和熱處理對DSC的影響

圖5為不同處理方式對牡蠣閉殼肌和組織DSC的結(jié)果。空白組牡蠣閉殼肌的DSC圖譜中肌球蛋白和肌動蛋白的2個峰未能完全分開，但超高壓組2個吸收峰趨于平緩，表明超高壓處理后牡蠣中蛋白質(zhì)發(fā)生了明顯的變性。主要原因是蛋白質(zhì)在超高壓作用下，其靜電力和疏水相互作用都會受到影響，就會形成少量的氫鍵繼續(xù)維持原有蛋白結(jié)構(gòu)，但是熱處理組則會引起肌球蛋白和肌動蛋白產(chǎn)生不可逆的變性，導(dǎo)致圖中2種蛋白的峰趨于平緩［19］。牡蠣組織 DSC的結(jié)果與閉殼肌的變化相似。

2.6 UHP和熱處理對牡蠣肉的光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡結(jié)果比較

超高壓處理牡蠣后，對牡蠣閉殼肌和組織的光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果如圖6所示。

從圖6和圖7中可以看出，空白組的牡蠣肌肉結(jié)構(gòu)比較疏松，經(jīng)超高壓處理后，結(jié)構(gòu)較為緊密，熱處理組結(jié)構(gòu)最為緊密。原因有以下幾點:超高壓導(dǎo)致水分吸出，使肌肉內(nèi)水分減少，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)緊密，隨著壓力進一步提高，肌纖維受壓力的作用逐漸增大，使得肌纖維之間的空隙明顯因為受到壓力作用而變小，同時DSC分析結(jié)果表明肌動蛋白和肌球蛋白發(fā)生變性，蛋白質(zhì)分子間的非共價鍵斷裂，而蛋白質(zhì)分子間新形成的化學(xué)鍵導(dǎo)致肌肉纖維發(fā)生聚集［20］，另外，蛋白質(zhì)變性使得其內(nèi)部的自由水溶出，使得肌肉組織更為緊密。

2.7 UHP和熱處理對呈味成分的影響

游離氨基酸不僅是水產(chǎn)品鮮味的主要來源，同時還體現(xiàn)出甜味、苦味等多種復(fù)雜的滋味特征，更重要的是他還可以與核苷酸等物質(zhì)一起，起到顯著提升海產(chǎn)品總體滋味品質(zhì)的效果，同時對調(diào)節(jié)貝類體內(nèi)的滲透壓有重要作用。甜菜堿可以提升體系的甜味、鮮味、海產(chǎn)風(fēng)味和總體風(fēng)味。牡蠣的主要能源貯存形式是糖原，糖酵解會產(chǎn)生琥珀酸，影響食品的風(fēng)味。此外，水產(chǎn)品中不可或缺的輔助呈味成分還有無機離子。不同處理方式牡蠣的呈味成分含量見表2。

圖5 牡蠣閉殼肌、組織不同處理方式的DSC圖譜注:A組為閉殼肌組，B組為組織組，1、2、3分別為空白組、HP組、HT組Fig.5 DSC thermograms of oyster muscle and tissue subjected to different treatments

圖6 牡蠣閉殼肌、組織不同處理方式的顯微結(jié)構(gòu)注:放大倍數(shù)為10倍目鏡;A組為閉殼肌組，B組為組織組，1、2、3、分別為空白組、HP組、HT組Fig.6 Microscopic structure of oyster muscle and tissue by different treatments

圖7 牡蠣閉殼肌、組織不同處理方式的掃描電鏡圖注:放大倍數(shù)為500倍;A組為閉殼肌組，B組為組織組，1、2、3分別為空白組、HP組、HT組Fig.7 SEM views of oyster muscle and tissue by different treatments

表2 牡蠣呈味組分、含量及呈味強度值Table 2 The concentrations，taste thresholds and TAVs of taste-active components in oyster

香港牡蠣的游離氨基酸主要有丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸和天冬氨酸。鮮味氨基酸主要是谷氨酸，其刺激閾值較低，使牡蠣有鮮美醇厚的味道。超高壓處理后，游離氨基酸含量有所增加，這表明，牡蠣在經(jīng)超高壓處理的過程中，發(fā)生了一定的生理生化反應(yīng)，使得蛋白質(zhì)的水解程度增強，導(dǎo)致游離氨基酸的含量有所增加。這與趙偉［5］的研究結(jié)果一致。熱處理會造成游離氨基酸大量的流失，可能是處理過程中存在大量的汁液流失。

ATP及其關(guān)聯(lián)化合物是影響牡蠣風(fēng)味的另一類重要的物質(zhì)，尤為突出的是IMP，IMP可以在單獨呈味的同時又與谷氨酸鈉起到相輔的作用，使鮮味增強［21］。在甲殼類動物中，由于AMP脫氨酶有較低的活性，容易積累［21］，因此AMP的含量較高?？瞻捉M可以看出，AMP和IMP對牡蠣的滋味有重要貢獻。高壓處理和熱處理后，ATP及其關(guān)聯(lián)化合物含量除IMP外都顯著增多。

乳酸和琥珀酸是與貝類呈味相關(guān)的主要有機酸［22］。其含量較為豐富的原因是因為牡蠣中含有較為豐富的糖元。與空白組相比，高壓處理和熱處理后，乳酸和琥珀酸的的含量顯著下降(P＜0.05)，但熱處理下降更為嚴重，分別由2.64、8.50下降到了2.39、5.79 mg/100 g，分別損失了9.47%和31.88%。

甜菜堿是一類季銨類化合物，是一種重要的甜味物質(zhì)，超高壓處理對其影響不顯著。無機離子對水產(chǎn)品的滋味也起到增強作用，超高壓處理和熱處理都能使其含量顯著降低，且熱處理降低更為明顯。

3種處理方式整體比較來看，超高壓組比熱處理組更為接近空白組。

3 結(jié)論

以新鮮牡蠣為對照，分析比較了超高壓處理和熱處理對香港牡蠣的營養(yǎng)成分、pH值、色差、肌肉組織品質(zhì)、呈味成分、揮發(fā)性成分等的影響。與新鮮牡蠣相比，超高壓對牡蠣品質(zhì)有不同程度的改變，高壓使牡蠣水分含量增加2.47%，蛋白質(zhì)和灰分含量分別降低1.48%和0.76%，粗脂肪、總糖含量、水解氨基酸和脂肪酸組成未發(fā)生顯著變化。與熱處理相比，超高壓處理更有利于保留牡蠣原有的營養(yǎng)成分。

與新鮮牡蠣相比，超高壓處理能使蛋白質(zhì)發(fā)生輕微變性，致使pH值增大0.14，蛋白酶水解活力和Ca2+-ATP酶活力分別下降了34.26%和7.81%;閉殼肌硬度和咀嚼性顯著增大，組織的硬度、彈性和咀嚼性顯著降低;高壓使L值顯著增大，a、b值顯著降低，且肌肉顏色的變化最為嚴重;同時DSC、光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡結(jié)果也顯示，超高壓會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，并使其結(jié)構(gòu)變得更為緊密。熱處理后的牡蠣蛋白質(zhì)發(fā)生嚴重變性。

與新鮮牡蠣相比，超高壓使游離氨基酸含量、ATP及其關(guān)聯(lián)化合物(IMP除外)及有機酸顯著增加，無機離子的含量顯著降低，甜菜堿變化不顯著。熱處理的變化比超高壓處理的變化更為明顯。

超高壓處理后的牡蠣品質(zhì)雖發(fā)生不同程度改變，但與熱處理相比，超高壓處理的牡蠣更接近新鮮牡蠣，更能保持牡蠣原有的營養(yǎng)和色澤。

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