王涵欣，喬發(fā)東，張春江，張泓，劉孟健，郭昕

1(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州，450001)

2(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室，北京，100193)

豆糝(豆醬團)是河南省東部民間制作的一種傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，其口感醇香、味道鮮美，深受豫東百姓的喜愛。它不僅是一種調(diào)味品，還是餐桌上的佐菜，尤其是春節(jié)等節(jié)假日時，用以解油膩，在人們的日常飲食中占有重要地位。豆糝以大豆為主要原料，經(jīng)微生物作用自然發(fā)酵而成，具有獨特的風味和營養(yǎng)功效。在大豆發(fā)酵制品的制作過程中，由于微生物對原料的分解、微生物的自溶以及代謝產(chǎn)物之間的相互作用，會發(fā)生復(fù)雜的發(fā)酵代謝和生化反應(yīng)(醇發(fā)酵、酸發(fā)酵、酯化反應(yīng)、美拉德反應(yīng)等)形成復(fù)雜的風味物質(zhì)，菌種、工藝不同，產(chǎn)品物質(zhì)變化也有差異［1-4］。

目前，對豆糝這一區(qū)域性特色發(fā)酵豆制品的營養(yǎng)品質(zhì)，尤其對其風味成分的分析比較少。頂空固相微萃取(HS-SPME)是一種新的揮發(fā)性物質(zhì)采樣技術(shù)［3］，通過吸附/脫附技術(shù)，能夠富集樣品中的揮發(fā)和半揮發(fā)性成分，具有靈敏度高、重現(xiàn)性及線性好、操作簡單方便快速的優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于食品風味測定中［5-7］。本文測定了豆糝的理化指標，分離鑒定了其揮發(fā)性風味化合物，分析豆糝的品質(zhì)特征。旨在為該傳統(tǒng)產(chǎn)品的標準化和工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

原料:大豆、面粉、食鹽、香辛料等。

試劑:檢驗分析常用的各種化學(xué)試劑(分析純)。

儀器與設(shè)備:電熱鼓風干燥箱(BGZ-240電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司);水分活度儀(AQUA，美國Aqua Lab公司);pH計(PB-10);磁力攪拌器(78-1，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);全自動凱氏定氮儀(KJELTEC 2300，丹麥FOSS公司);索氏提取器(SER148型脂肪測定儀);SPME萃取裝置(50/30 μm DVB/CAR/PDMS，美國 Supelco公司);氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(QP2010日本島津公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程及操作要點

原料篩選→浸泡→蒸煮→裹面→制曲→拌料→發(fā)酵成熟

選擇顆粒飽滿、均勻、新鮮、無霉爛、無蟲蛀的大豆，并且進行清洗、除雜及上浮物。然后放入容器中加水浸泡(20～25℃，10 h)，以豆內(nèi)無白心，用手捏容易成2瓣為宜。采用常壓煮制法(大火40 min，小火20 min)使大豆全部均勻熟透，既軟又不爛，保持整粒又無夾心。以豆面質(zhì)量比3∶2的比例進行裹面，并保持裹面后呈松散的顆粒狀;按傳統(tǒng)工藝方法制曲(25～35℃，3～4 d，每天翻曲1次)，至豆粒表面生長出濃密的黃綠色的菌絲及孢子后，移至陽光下晾曬1～2 d，去除表面多余的浮曲。

根據(jù)個人口感和喜好，加入適量的食鹽水(14% ～15%)、辣椒、十三香等(也可加入其它的調(diào)味料)進行拌料。然后，在自然陽光下曝曬，每4～5 d攪拌1次，持續(xù)一個月后將豆糝團成圓形，繼續(xù)晾曬至表面微干后，在室溫條件下儲存，完成后熟過程。

取樣:分別選取3月份、5月份制作的豆糝為樣品1和樣品2進行理化和揮發(fā)性化合物分析。

1.2.2 理化指標與分析方法

水分含量(GB 5009.3-2010);水分活度(GB/T 23490-2009);食鹽含量(GB/T 9695.8-2008);總酸含量(GB/T 5009.39-2003);氨基態(tài)氮含量(GB/T 5009.39-2003);蛋白質(zhì)含量(GB 5009.5-2010);脂肪含量(索氏提取法);還原糖含量(DNS法)。

1.2.3 揮發(fā)性化合物分析

1.2.3.1 頂空固相微萃取條件

萃取頭老化:初次使用時，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在氣相色譜進樣口270℃老化1 h。

將豆糝樣品搗碎，稱取1 g至15 mL萃取瓶中，放入SPME裝置，60℃下平衡15 min，采用上述萃取頭于60℃頂空萃取30 min，隨即插入GC-MS進樣器中，每個樣品進樣3次。

1.2.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

氣相色譜進樣與程序升溫條件:色譜柱(60 m×0.32 mm × 1.8 μm)，解吸 5.0 min(解析溫度為260℃)，以不分流模式進樣［8］。柱子初溫 40 ℃，等溫保持10 min，以5℃/min升溫至200℃，然后以20℃/min升溫至250℃，保持5 min，載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件:電離方式為電子轟擊(EI)源，電子能量70eV，電子倍增電壓1 753 V;質(zhì)量掃描范圍30～550 amu;掃描速率1 scan/s。

定性、定量方法:通過計算機檢索并根據(jù)Wiley710和NISTDEMO標準譜庫進行數(shù)據(jù)對比，以匹配度＞800的才保留，確定化合物的名稱［9］。揮發(fā)性化合物的相對百分含量按峰面積歸一法進行計算［10］。

1.2.4 試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

運用SPSS(18.0)軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)豆糝的理化分析

以大豆原料為參照，對傳統(tǒng)豆糝的主要理化指標進行了分析，測定結(jié)果見表1。

表1 傳統(tǒng)豆糝和大豆原料的理化指標Table 1 Physical and chemical indicators of traditional Doushen and Soybean

傳統(tǒng)豆糝的制作與當?shù)氐臍夂驐l件和制作工藝密切相關(guān)。從表1看出，豆糝產(chǎn)品的水分含量為31.36%～39.18%，產(chǎn)品的最終水分含量由水分活度(aw)決定。由于水分活度(aw)與環(huán)境的相對濕度等值，在豆糝發(fā)酵成熟過程中，使豆糝從表面蒸發(fā)與吸收的水分處于平衡狀態(tài)。豆糝中的食鹽含量(濕基)為7.39% ～9.83%，由于豆糝中食鹽與水分形成的鹽水濃度為15.87%～23.86%，食鹽在水中離解，能夠減少游離水分，降低游離水分含量，水分活度為0.79～0.82，從而抑制微生物的生長，達到防腐目的。

豆糝在發(fā)酵成熟過程中受環(huán)境微生物及溫、濕度變化的影響，導(dǎo)致酶活性變化進而發(fā)生一系列生物化學(xué)反應(yīng)，使蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等被微生物產(chǎn)生的酶降解，降解產(chǎn)物之間又發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)［11］。從表1中明顯看出，經(jīng)過豆糝的加工、發(fā)酵與成熟過程，蛋白質(zhì)含量顯著降低，氨基態(tài)氮含量的增加(1.68～1.77g/100g DM)，說明在低水分活度環(huán)境下，雖然具有顯著的抑菌防腐效果，但是，發(fā)酵過程的生物化學(xué)反應(yīng)仍可進行，對于形成豆糝的良好風味品質(zhì)具有重要意義。

2.2 傳統(tǒng)豆糝自然發(fā)酵過程中理化變化

從發(fā)酵過程開始，每間隔5 d取1次樣，分別測定豆糝自然發(fā)酵過程中總酸度、pH值、還原糖和氨基態(tài)氮的變化，結(jié)果如圖1和圖2所示。

由圖1可以看出，發(fā)酵開始時pH為6.6左右，總酸度只有0.12 g/100 g(DM)，在發(fā)酵初期，總酸度快速升高，pH快速下降，到第10天后變化趨于平緩，15～20 d變化很小，到發(fā)酵的第25天時，pH和總酸度分別為5.31和4.57 g/100 g(DM)。發(fā)酵前期，豆糝中的微生物大量繁殖進而導(dǎo)致碳水化合物、脂肪等的分解，產(chǎn)生乳酸、乙酸等小分子有機酸，在降低蛋白含量的同時增加了游離氨基酸的含量，使得豆糝的總酸度增加和pH下降［12］。

圖1 豆糝自然發(fā)酵過程中pH值和總酸度的變化Fig.1 Changes of pH and total acids during the natural fermentation of Doushen

由圖2看出，還原糖含量在發(fā)酵前期(10 d)也急劇增加，達到19.81 g/100 g(DM)，主要是霉菌產(chǎn)生的淀粉酶和糖化酶將原料中的淀粉快速水解產(chǎn)生還原糖［13］，使得還原糖總量增加。隨著發(fā)酵過程的進行，還原糖含量逐漸減少，主要是微生物的快速利用和消耗，一方面，還原糖為微生物的生長提供碳源，如乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、乙酸、琥珀酸等小分子有機酸，另一方面，美拉德反應(yīng)也消耗還原糖［14］。在發(fā)酵后期，還原糖含量下降趨于平緩，表明微生物代謝活動減弱，可能是由于aw、pH及總酸度的變化構(gòu)成反饋抑制作用，抑制了微生物及酶的生化代謝活性。

氨基態(tài)氮的含量反映大豆蛋白在發(fā)酵過程中的水解程度，是發(fā)酵型豆制品的一項主要指標，其含量隨著發(fā)酵過程的進行逐漸增加(圖2)，前期增加較快，20 d后趨于平緩。這是由于發(fā)酵前期蛋白酶活力較高，有利于促進蛋白質(zhì)的水解，從而氨基態(tài)氮含量增加較快，隨著發(fā)酵過程的進行蛋白酶活力下降或受到抑制，氨基態(tài)氮的含量增速變緩［15］，但是隨著后熟及貯藏過程的延續(xù)，蛋白質(zhì)仍能發(fā)生緩慢的水解，氨基態(tài)氮的含量仍有積累。

圖2 豆糝自然發(fā)酵過程中還原糖和氨基態(tài)氮的變化Fig.2 Changes of reducing sugar and amino-nitrogen during the natural fermentation of Doushen

2.3 傳統(tǒng)豆糝揮發(fā)性化合物的分離鑒定

應(yīng)用頂空固相微萃取法結(jié)合GC-MS對傳統(tǒng)豆糝產(chǎn)品(樣品1、樣品2)中的揮發(fā)性化合物進行分離鑒定，每個樣品進樣3次，根據(jù)每個色譜峰的重現(xiàn)性，確定需要定性的揮發(fā)性化合物。然后，將其質(zhì)譜信息與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中標準化合物的質(zhì)譜信息進行對比，以匹配度(＞800)確定化合物的名稱，用歸一化法比較揮發(fā)性化合物的相對含量。結(jié)果分別見圖3和表2。

圖3 傳統(tǒng)豆糝揮發(fā)性化合物的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatograms of volatile compounds of the traditional Doushen

從表2看出，樣品1和樣品2共有75種揮發(fā)性化合物得到鑒定，其中烴類21種，醇類8種，醛類4種，酮類7種，酸類7種，酯類13種，其他類15種。在樣品之間，揮發(fā)性化合物的種類及相對含量存在較大的變異性，可以反映出發(fā)酵過程的復(fù)雜性(表3)。

表2 傳統(tǒng)豆糝中的揮發(fā)性化合物Table 2 Volatile components of the traditional Doushen

從表3看出，在2個樣品中揮發(fā)性化合物的種類差異明顯，樣品1中其他類(雜環(huán))化合物和酯類化合物種類較多，而樣品2中則為烴類和其他類(雜環(huán))化合物較多。2樣品中僅有17種相同的揮發(fā)性化合物，分別為正十二烷、2，3-丁二醇、2，7-二甲基-4，5-辛二醇、1-辛烯-3-醇、1-癸醛、3-羥基-2-丁酮、異戊酸、環(huán)氧乙烷-2-羧酸乙酯、2，5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、3-羥基-2-甲基-4-吡喃酮、4-烯丙基苯甲醚和對丙烯基茴香醚(茴香腦)。

表3 傳統(tǒng)豆糝中的揮發(fā)性化合物的種類和相對含量Table 3 Types and contents of the volatile components of the traditional Doushen

從揮發(fā)性化合物的相對含量比較，2種樣品之間也存在明顯的差異。樣品1中其他類(雜環(huán))化合物含量最高(73.49%)，酯類次之(13.39%)，酸類第三(4.48%)。含量最高的揮發(fā)性化合物分別是:2，5-二甲 基 吡 嗪 (33.07%)、2，3，5，6-四 甲 基 吡 嗪(18.14%)、2，3，5-三甲基吡嗪(16.94%)、異丁酸丙酯(6.1%)、環(huán)氧乙烷-2-羧酸乙酯(5.81%)。而樣品2中醇類化合物含量最高(31.59%)、酮類次之(23.79%)、其他類(雜環(huán))第三(22.02%)。含量最高的揮發(fā)性化合物分別是:2，3-丁二醇(30.01%)、3-羥 基-2-丁 酮 (22.8%)、2，3，5，6-四 甲 基 吡 嗪(7.54%)、2，3，5-三甲基吡嗪(6.53%)。

根據(jù)前人研究［1-2］，大豆發(fā)酵調(diào)味品滋味和香味化合物的形成，除受原材料和熱處理工藝的影響外，最重要的是豆曲培養(yǎng)或毛坯發(fā)酵時所形成的大量菌絲體在鹽腌過程中借鹽溶作用釋放出多種水解酶系(如蛋白酶、肽酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶、低聚糖酶等)，將原料中的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等分解成肽、氨基酸、脂肪酸和糖類，從而構(gòu)成了一個豐富的“風味物質(zhì)前體庫”，在后熟期間再經(jīng)過一系列復(fù)雜的發(fā)酵代謝和生化反應(yīng)，如酸發(fā)酵、醇發(fā)酵、酯化反應(yīng)、氨基酸降解、美拉德反應(yīng)等，從而形成了大量的風味化合物［16］。

醇類物質(zhì)主要是由酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生，一般閾值較高，含量低時對風味的貢獻較小，在樣品1中檢測到5種，樣品2中檢測到6種，其中，2，3-丁二醇在樣品2中相對含量最高(30.01%)，是檢測到的主要醇類化合物。1-辛烯-3-醇在2種樣品中均檢測到，相對含量分別為0.36%和0.91%，由二十四碳四烯酸的氫過氧化物的降解產(chǎn)生，具有類似蘑菇的香氣［17］。

醛類化合物主要來源于脂肪的氧化降解，一般閾值很低，具有較強的揮發(fā)性［17］，對發(fā)酵豆制品香味成分的貢獻較大。本實驗檢測到的醛類有4種，苯乙醛只在樣品2中檢測到，相對含量為0.04%，具有類似風信子的香氣，稀釋后具有水果的甜香氣。

酮類化合物大多是不飽和脂肪酸受熱氧化和降解的產(chǎn)物，其閾值較低，產(chǎn)物伴有淡淡的花香和果香［18］，2樣品中均檢測到3-羥基-2-丁酮，相對含量分別為0.94%和23.79%，且相對含量差異明顯。

酯類物質(zhì)則是發(fā)酵豆制品香氣的主體成分，賦予食品甜香、果香，其形成途徑有2種，一是在發(fā)酵過程中由酵母酶催化生成，二是由有機酸和醇通過非酶催化的酯化反應(yīng)生成。實驗結(jié)果顯示:樣品1中酯類相對含量高于樣品2，2樣品中均檢測到的酯類化合物為環(huán)氧乙烷-2-羧酸乙酯。

酚類物質(zhì)雖然相對含量極微，只有0.52%和0.33%，但作為香氣成分作用仍十分明顯。

吡嗪類化合物主要是由蛋白質(zhì)、氨基酸熱分解、糖與蛋白質(zhì)或氨基酸的美拉德反應(yīng)所形成，是構(gòu)成焙烤香味的主體物質(zhì)［19］。吡嗪類物質(zhì)在2樣品中檢測到的種類都相同，相對含量也都很高，分別為70.5%和15.97%。其形成過程可能與豆糝的自然曬露工藝有關(guān)，對豆糝的特征性風味起重要作用。

3 結(jié)論

在特定地域的氣候條件下制備的傳統(tǒng)豆糝，其水分含量為31.36% ～39.18%，水分活度為0.79～0.82，具有良好的抑菌防腐功效。在發(fā)酵過程中，總酸度、還原糖和氨基態(tài)氮含量的變化，說明仍有生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)生，并且發(fā)酵前期反應(yīng)強度高于發(fā)酵后期，對豆糝風味品質(zhì)的形成有重要貢獻。

應(yīng)用固相微萃取法，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，從2個豆糝樣品中共鑒定出75種揮發(fā)性化合物，其中烴類21種，醇類8種，醛類4種，酮類7種，酸類7種，酯類13種，其他類15種。在樣品之間，揮發(fā)性化合物的種類及相對含量存在較大的變異性。在2樣品中僅鑒定出17種相同的揮發(fā)性化合物。具有代表性的風味化合物為:2，3-丁二醇、1-辛烯-3-醇、1-癸醛、3-羥基-2-丁酮、2，5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、3-羥基-2-甲基-4-吡喃酮等。

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