馬悅，吳謙，吳希陽，李小龍，唐書澤

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一種常見的食品污染菌和食源性條件致病菌，在細(xì)菌性食物中毒中，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒在發(fā)生起數(shù)和發(fā)病人數(shù)方面均居前三位［1］。蠟樣芽孢桿菌通過產(chǎn)生催吐毒素及腹瀉毒素引起食物中毒［2］，我國發(fā)生的蠟樣芽孢桿菌食物中毒主要是由致吐型腸毒素引起的。引發(fā)致吐型蠟樣芽孢桿菌食物中毒的食品由70%是糧食加工制品［3］，尤其是大米制品。我國是世界上大米的最大生產(chǎn)國和消費(fèi)國，研究蠟樣芽孢桿菌污染的控制技術(shù)對于我國大米消費(fèi)地區(qū)的食品安全具有重要意義。

生物被膜是微生物在生長過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而形成的一種與浮游菌相對應(yīng)的菌細(xì)胞群體，它附著于活力組織或無活力組織表面，由其產(chǎn)生的細(xì)胞外多聚基質(zhì)包裹的菌體細(xì)胞構(gòu)成［4］，環(huán)境因素如溫度、pH、碳源、無機(jī)鹽、培養(yǎng)時間等對其影響很大［5］。細(xì)菌生物被膜一旦形成，很難從食品加工設(shè)備及其接觸面上徹底清除。形成的生物被膜對抗生素的耐受性比浮游菌增強(qiáng)10～1 000倍，給食品安全帶來嚴(yán)重的潛在隱患［6］。生物被膜還會帶來如降低流徑，阻礙傳熱等問題［7］。蠟樣芽孢桿菌在食品加工、包裝、儲存等過程中容易黏附于不銹鋼、有機(jī)玻璃、聚氯乙烯及玻璃等非生物表面并形成生物菌膜［8］，增加了滅菌難度。

目前，國內(nèi)外有關(guān)生物被膜的報道主要集中于單增李斯特菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌等，對能產(chǎn)生芽孢的菌類生物被膜研究較少，關(guān)于接觸材料表面對生物被膜的影響鮮見報道［9］。本文通過平板計(jì)數(shù)法比較蠟樣芽孢桿菌在接觸過煮熟大米的不銹鋼材料(Rice-SS)與潔凈的不銹鋼(Clean-SS)材料上形成生物被膜的總量，并為進(jìn)一步研究生物被膜形成規(guī)律及其致病性奠定基礎(chǔ)，為大米制品生物危害安全防控技術(shù)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

蠟樣芽孢桿菌菌株，分離自大米。

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器試劑

蠟樣芽孢桿菌生化鑒定盒071800，廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司;蓋玻片(玻璃材質(zhì)，20 mm×20 mm，)，廣州健陽生物技術(shù)有限公司;不銹鋼片(SS，304型，20 mm×20 mm)，上海鳳庭機(jī)械設(shè)備有限公司;有機(jī)玻璃(PMMA，20 mm×20 mm)、聚氯乙烯(PVC，20 mm×20 mm)，上海艾紐斯敦塑料科技有限公司;酶標(biāo)儀(PMT-49984)，寶生物工程(大連)有限公司;渦旋振蕩儀(QL-901)，其林貝爾儀器制造公司;離心機(jī)(KDC-1042)，科大創(chuàng)新股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離鑒定及培養(yǎng)

用電子天平準(zhǔn)確稱取市售國產(chǎn)大米100 g，放入搖擺式高速粉碎機(jī)中，粉碎1 min左右，至粒徑約1 mm;室溫下(25～30℃)，按照米水比14∶15的質(zhì)量比，用玻璃棒攪拌約20～30 min調(diào)成糊狀，以無菌操作稱取10 g上述糊狀米粉，轉(zhuǎn)入90 mL無菌生理鹽水中，取1 mL涂布于TSA平板上，37℃培養(yǎng)24～40 h。

菌種鑒定:進(jìn)行生理生化鑒定(蠟樣芽孢桿菌生化鑒定盒071800);后采用試劑盒法(青島海博生物有限公司)提取芽孢桿菌的DNA，用細(xì)菌16S rDNA的通用引物，即上游引物27 F:5＇-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物 1492 R:5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇進(jìn)行 16S rDNA的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:94℃，5 min;94℃，30 s;60℃，30 s;72℃，25 s，20 cycle，72℃，1 min。PCR反應(yīng)體系見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系表Table 1 PCR reaction system

凝膠電泳條件為:電壓90 V，溫度60℃，電泳時間3 h，將膠條放置于質(zhì)量濃度為0.5μg/mL的EB染色液中染色15 min，再于TAE脫色液中脫色10 min;之后委托上海生工公司進(jìn)行基因測序。

培養(yǎng):將蠟樣芽孢桿菌接種于5 mL TSB中，37℃以100 r/min振蕩培養(yǎng)16 h至生長穩(wěn)定期［8］;4 500 r/min離心10 min，棄去上清液，用1 mL pH 7.4的無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌 2次［10］，7～10 mL PBS調(diào)整其OD600值為0.1左右(約108CFU/mL)。

1.3.2 載體處理

蓋玻片、6孔板、96孔板在體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中浸泡24 h后在無菌條件下晾干，紫外殺菌30 min。

PMMA、PVC片在45 Hz條件下超聲30 min后PMMA片在甲醇中浸泡30 min，PVC在甲醇溶液中浸泡3次，每次10 s。在無菌條件下晾干，紫外殺菌30 min。

SS的處理參照Peng［9］等的方法:將SS片浸泡在體積比為1∶1的甲醇丙酮混合溶液中超聲1 h除去表面油脂，浸泡于反滲透(RO)水中，取出后在75℃條件下放置于0.2 g/mL的NaOH溶液中，5 min后取出再次于 RO水中浸泡，在75℃將其浸泡在1%的HNO3溶液中，之后最后1次于RO水中浸泡，121℃高壓滅菌15 min。

Rice-SS的處理:將潔凈的SS片包埋于米水質(zhì)量比為1∶1.5時蒸出的米飯中，放置24 h后取出自然風(fēng)干，121℃高壓滅菌 15 min［9］。

1.3.3 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對B.cereus生物被膜形成的影響

在置有蓋玻片的6孔平底板中加入200 μL按1.3.1制備的菌懸液，加入5 mL TSB培養(yǎng)基，分別在4，25，37 ℃培養(yǎng) 4，8，12，24，48，72 及 96 h。小心取出蓋玻片，用無菌PBS溶液洗3次除去浮游菌;200 μL 10%甲醇固定10 min，200 μL 1%結(jié)晶紫染色5 min后用PBS洗至無紫色脫出，60℃干燥30 min，加1 mL 33%乙酸，浸沒蓋玻片，小心振蕩使結(jié)晶紫溶解，用酶標(biāo)儀于波長600 nm處測其光密度。同時做空白對照。每組設(shè)置6個平行，重復(fù)3次，取平均值。通過OD600值反映生物量的大小。

1.3.4 培養(yǎng)基成分對B.cereus生物被膜形成的影響

將按1.3.1制備的菌液與添加不同成分的新鮮的TSB培養(yǎng)基按照1∶100的體積比混合均勻，以每孔200 μL接入96孔板，各組分別以不添加葡萄糖、蔗糖、MgCl2、CaCl2、NaCl、pH 為 7.0 的 TSB 培養(yǎng)基為陰性對照，設(shè)陰性對照組測得的相對OD600值為1，方便其他各組與之比較。37℃培養(yǎng)48 h，之后同1.3.2操作。

碳源對B.cereus生物被膜的影響:分別配制含葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.50%，1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，6.0%，8.0%和 10.0%的 TSB，121 ℃高壓滅菌15 min后進(jìn)行上述操作。

無機(jī)鹽對B.cereus生物被膜的影響:分別配制含 CaCl2、MgCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.010%，0.02%，0.05%，0.10%，0.25%和0.50%的TSB，121℃高壓滅菌15 min后進(jìn)行上述操作。

培養(yǎng)基初始pH對B.cereus生物被膜的影響:配制 pH 值分別為 2.0，5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，9.0，12.0的TSB，121℃高壓滅菌15 min后按1.3.3操作。

1.3.5 接觸材料對B.cereus生物被膜形成的影響

將經(jīng)處理的PVC、PMMA、SS片分別置于6孔板中加入 200 μL 1.3.1制備的菌懸液，后加入 5 mL TSB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h。取出長有生物被膜的薄片后參照Dourou等［5］的操作并略作修改:將長有生物被膜的片放入裝有10 mL PBS及10顆玻璃珠的50 mL無菌離心管中，4 000 r/min渦旋振蕩2 min(移除效果通過將渦旋處理后的各載體經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢確定)，取100 μL該菌液梯度稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

潔凈的SS與Rice-SS表面成膜總量比較:將經(jīng)處理的潔凈SS與Rice-SS片分別置于6孔板中，加入200 μL 1.3.1制備的菌懸液，后加入5 mL TSB培養(yǎng)基，分別于 37 ℃下培養(yǎng) 12，24，36，48，72 h。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差分析，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種分離鑒定

對國產(chǎn)大米中的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，大米中菌落總數(shù)約為2.49×103CFU/g，其中有2～3種菌落形態(tài)，經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)多數(shù)為G+的芽孢桿菌，少數(shù)為G-的腸桿菌。本實(shí)驗(yàn)分離出1株芽孢桿菌，暫命名為菌株B。經(jīng)生理生化鑒定后可初步確定菌株B是蠟樣芽孢桿菌。對菌株B的16S rDNA序列進(jìn)行blast比對，與GenBank中4株蠟樣芽孢桿菌的16S rDNA序列相似性均達(dá)到99%以上，可以確認(rèn)菌株B為蠟樣芽孢桿菌。

由上述結(jié)果可知檢測的國產(chǎn)大米中微生物污染情況較嚴(yán)重，其中包括了食源性病原菌B.cereus，將對大米產(chǎn)品加工帶來危害，進(jìn)一步說明了本研究的必要性。

2.2 培養(yǎng)溫度及時間對B.cereus生物被膜形成的影響

培養(yǎng)溫度和時間與B.cereus生物被膜有著極為密切的關(guān)系。如圖1所示，在不同溫度條件下，B.cereus生物被膜生長的大致趨勢一致:培養(yǎng)初期B.cereus所形成的生物被膜OD600值隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，約24 h達(dá)到峰值;繼續(xù)培養(yǎng)至48 h生物被膜OD600值有所下降，48 h后趨于穩(wěn)定。

圖1 不同溫度條件下B.cereus生物被膜培養(yǎng)光密度值隨時間的變化Fig.1 Optical density value of B.cereus biofilms during 96 h incubation in different temperature

生物被膜形成大致可分為幾步:(1)菌體黏附至合適的底物;(2)形成微菌落，微菌落融合并形成生物被膜的基底層;(3)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，逐漸成熟形成三維立體結(jié)構(gòu);(4)生物被膜子代細(xì)胞的播散。李麗娟［11］等研究了煙曲霉生物被膜的形成過程和結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)煙曲霉生物被膜的形成過程為孢子黏附(4 h)，孢子萌芽(8 h)，菌絲延長相互連接形成單細(xì)胞層(10～12 h)，菌絲纏繞形成多層立體結(jié)構(gòu)(16～20 h)，最后形成菌絲有序排列、具有復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)特征的多細(xì)胞菌落。本研究結(jié)果顯示B.cereus的生物被膜形成情況:0～12 h為早期黏附階段，主要是培養(yǎng)液中的菌體及孢子黏附于96孔板表面，孢子萌發(fā)，96孔板表面微生物的生物量逐步增加;12～24 h B.cereus生物被膜OD600值快速增加，生物被膜內(nèi)菌體迅速增值;24～48 h生物被膜形成量呈短暫的降低趨勢，可能是菌體大量繁殖導(dǎo)致營養(yǎng)受到限制;48～72 h為生物被膜成熟階段，OD600值趨于穩(wěn)定。

37℃時生物被膜生長狀況明顯優(yōu)于4及25℃。本實(shí)驗(yàn)證明在4，25，37℃均可長出B.cereus生物被膜，但形成生物被膜量有所不同。不僅室溫(25℃)條件下可以生成B.cereus生物被膜，甚至在冷藏溫度(4℃)都可生成，證明了生產(chǎn)過程中及時清潔和有效除菌的必要性。37℃生物被膜生長狀況明顯優(yōu)于其他溫度，這與B.cereus最適生長溫度為28～35℃［3］基本相符。

2.3 培養(yǎng)基成分對B.cereus生物被膜形成的影響

碳源與B.cereus生物被膜的形成關(guān)系密切(圖2):葡萄糖添加量在0～3.0%時隨著添加量增加B.cereus生物被膜形成總量整體呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢，在添加量為3.0%時B.cereus生物被膜形成量最大，為不添加葡萄糖時的1.67倍，此后隨著葡萄糖添加量增加，B.cereus生物被膜總量逐漸減少(圖2a)。

圖2 碳源對B.cereus生物被膜形成量的影響Fig.2 Effects of concentration of carbon sources on B.cereus biofilm formation

B.cereus生物被膜形成總量隨蔗糖添加量增多先增后減，總體都促進(jìn)了其生物被膜形成，在添加量為3.0%到達(dá)峰值，為不添加蔗糖時的1.33倍(圖2b)。

葡萄糖、蔗糖作為微生物生長的碳源，為微生物生命活動提供所需要的碳架和能量，然而一旦超過一定的限度，高濃度的葡萄糖或蔗糖產(chǎn)生高滲透壓，抑制B.cereus生物被膜的形成。

圖3為無機(jī)鹽對B.cereus生物被膜形成量的影響結(jié)果，添加MgCl2總體均促進(jìn)了生物被膜的形成，隨著添加量的增加，B.cereus生物被膜形成量先增后減，在添加量為0.1%時最強(qiáng)，為不添加時的1.64倍(圖3a)。鎂是起廣泛調(diào)節(jié)作用的無機(jī)元素。它的主要功用是可使正常代謝和生長所需要的酶活化。在研究Mg2+對黏液性銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、嗜水氣單胞菌生物被膜的形成作用時，發(fā)現(xiàn)Mg2+通過對負(fù)電荷(細(xì)菌多糖及載體)的吸引既增加菌落間的聚集，又增加了菌落與載體間的黏附［12］。本研究表明:MgCl2總體促進(jìn)了生物被膜的形成，且促進(jìn)作用在MgCl2添加量為0.1%時最強(qiáng)。

圖3 無機(jī)鹽對B.cereus生物被膜形成量的影響Fig.3 Effects of inorganic salts on B.cereus biofilm formation

Ca2+可使許多微生物的生長和繁殖速度加快［12］，CaCl2添加量在0.01%時促進(jìn) B.cereus生物被膜的形成，此時其生物被膜形成總量是不添加CaCl2時的1.21倍 ;此后隨著CaCl2濃度增加，B.cereus生物被膜總量逐漸減少(圖3b)，可能是由于較高濃度Ca2+能通過抑制細(xì)菌的生長繁殖而到抑制生物被膜的形成。

圖4為不同培養(yǎng)基初始pH對B.cereus生物被膜形成的影響，初始pH為2.0和12.0時，B.cereus基本不形成生物被膜，pH為3.0～7.0時，B.cereus生物被膜形成量隨之增加，且pH為7.0時B.cereus生物被膜形成量最大，pH為7.5～12.0時，B.cereus生物被膜形成量明顯減少。B.cereus生物被膜形成最適pH為7，這與李南薇［13］等的報道基本一致。

圖4 不同培養(yǎng)基初始pH對B.cereus生物被膜形成的影響Fig.4 Effects of medium initial pH on B.cereus biofilm formation

2.4 接觸材料對B.cereus生物被膜形成的影響

通過圖5可以看出:3種材料表面B.cereus生物被膜的生長趨勢大致一致，在3種測試材料中不銹鋼表面生物被膜形成總量最大;對培養(yǎng)72 h后形成B.cereus生物被膜的Clean-SS及Rice-SS渦旋處理使其生物被膜剝落后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，24 h內(nèi)2種表面分離出的活菌量沒有明顯差別。但隨著時間延長，表面污染過大米的SS材料分離出的活B.cereus菌體明顯多于潔凈的材料。

Dourou等［5］研究證明大腸桿菌 O157∶H7 在接觸材料表面形成生物被膜的總量與接觸表面材料和接觸表面污染物有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證明在不銹鋼、有機(jī)玻璃以及聚氯乙烯3種材料中，不銹鋼表面形成B.cereus生物被膜的總量最大，家庭及工廠生產(chǎn)過程中經(jīng)常用到不銹鋼材料，其潛在的食品安全隱患不容忽視。

圖5 材料對B.cereus生物被膜形成量的影響Fig.5 Effects of surface on B.cereus biofilm formation

表面污染過大米的不銹鋼材料比清潔的不銹鋼表面生成B.cereus生物被膜的總量更大，生物被膜內(nèi)菌體維持活性時間更長，原因可能是由于污染過大米的不銹鋼表面粗糙程度增加，表面自由能發(fā)生變化，同時大米還為B.cereus生物被膜生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。這就更加突出了及時清潔(clean-in-place，CIP)的重要性。

3 結(jié)論

蠟樣芽孢桿菌可在玻璃、聚氯乙烯、有機(jī)玻璃、不銹鋼表面形成生物被膜，其形成量與培養(yǎng)時間、溫度、培養(yǎng)基中碳源、無機(jī)鹽、pH、滲透壓以及生長的材料有密切的關(guān)系。B.cereus生物被膜的OD600值在培養(yǎng)24 h達(dá)到峰值，48 h后趨于穩(wěn)定。形成B.cereus生物被膜最適溫度為37℃，最適pH為7.0。在培養(yǎng)基中加入10.0%以內(nèi)的葡萄糖、蔗糖、MgCl2(葡萄糖添加量在3.0% ～6.0%時，蔗糖在3.0%，MgCl2為1.0%分別達(dá)到最明顯的促進(jìn)效果);0.01%的CaCl2具有促進(jìn)生物被膜形成的作用;不銹鋼材料與有機(jī)玻璃、聚氯乙烯相比生成B.cereus生物被膜的量最大，接觸過大米的不銹鋼表面比潔凈的不銹鋼表面B.cereus生物被膜形成總量更大，生物被膜內(nèi)菌體維持活性時間更長。

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