韓瑨烜，田洪磊，詹萍，程衛(wèi)東

(新疆石河子大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆石河子，832000)

海棠果果醋是以海棠果為原料，經(jīng)過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵，制成一種具有輕微酒精度的果醋飲料，具有促進(jìn)新陳代謝，調(diào)節(jié)酸堿平衡，消除疲勞，降低膽固醇和血壓，增強(qiáng)肌體免疫力，防癌、抗菌消炎、美容護(hù)膚、延緩衰老、減肥等作用［1］。海棠果果醋的特點(diǎn)為呈現(xiàn)明顯的海棠果果香，營養(yǎng)豐富并具備果醋產(chǎn)品的一貫優(yōu)點(diǎn)。

本文在前期海棠果果醋加工技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，所用的樣本為不同醋酸菌發(fā)酵制得的海棠果果醋，采用模糊數(shù)學(xué)法對果醋樣本進(jìn)行細(xì)致客觀的感官評定［2］，再采用固相微萃取的方法對海棠果果醋的香氣成分分別進(jìn)行提取，通過氣相色譜質(zhì)譜法(GC/MS)對其分析研究，得出海棠果果醋香氣中主要特征物質(zhì)的成分，結(jié)合果醋感官評定的結(jié)果，嘗試揭示不同菌種發(fā)酵對海棠果果醋風(fēng)味品質(zhì)的影響，同時也為我國建立海棠果果醋香氣指紋圖譜提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 原料

實驗所用的果醋樣本為經(jīng)過工藝優(yōu)化的實驗室自釀果醋，菌種選用醋酸菌屬中具有代表性的兩大類醋酸菌，氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)和巴氏醋酸桿菌(Acetobacter pasteurium)，其中，巴氏醋酸桿菌適合高溫發(fā)酵(30℃以上)，能氧化酒精產(chǎn)生醋酸［3］;氧化葡萄糖酸桿菌適合低溫發(fā)酵(30℃以下)，能將葡萄糖氧化為葡萄糖酸并可少量產(chǎn)生醋酸［4］，采用兩種醋酸菌單菌發(fā)酵和混合發(fā)酵的方式制得3支果醋作為樣本，對應(yīng)的編號分別為A氧化、B巴氏、C混合。所用的醋酸菌均由石河子大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室提供。

1.2 儀器和設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(6890GC/5973MS型)，美國Agilent公司，SPME萃取裝置，美國Supelco公司，75 μmCAR/PDMS。

1.3 果醋樣品品質(zhì)分析

1.3.1 果醋樣本香氣SPME-GC/MS分析

樣品的制備:利用頂空固相微萃取(HS-SPME)裝置富集海棠果果醋香氣，操作方法為:取5 g(5 mL)左右樣品置于15 mL頂空瓶中，將老化后的75 μm Car/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于50℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口，于250℃解吸7 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。選用2-辛醇為內(nèi)標(biāo)，添加量為5 μL。

GC-MS分析條件:分流方式為不分流，色譜柱為(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序為40℃，保持3 min，以5℃/min的升溫速度升至230℃，保持7 min。載氣為He，體積流量為0.9 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測器溫度為280℃。

質(zhì)譜條件:連接桿溫度280℃，升溫程序同上，柱頭壓10 psi，電離方式EI源，電離電壓70 eV，倍增器電壓1 000 V。掃描范圍為33～450 amu。

1.3.2 果醋樣本感官分析

果醋樣本的感官分析采取模糊數(shù)學(xué)感官分析法，由10名專業(yè)評定人員組成評定小組，通過對3支果醋樣本觀察發(fā)現(xiàn)，3支樣本在外觀方面沒有明顯差異，測得色差和透光率的數(shù)據(jù)也幾乎一樣，所以在做感官評定時，不考慮果醋的色澤和品相，只對3支果醋的香氣和滋味這兩個屬性進(jìn)行感官評定，并對香氣和滋味這兩個屬性進(jìn)行細(xì)分，將香氣分為水果型香氣和發(fā)酵型香氣，將滋味分為具有海棠果原果汁風(fēng)味和具有刺激性酸味。以優(yōu)、好、良、差為評語集(評定標(biāo)準(zhǔn)見表1)，采用模糊數(shù)學(xué)評價方法對其進(jìn)行分析，模糊關(guān)系綜合評判集Y=X·R，其中X為權(quán)重集，R為模糊矩陣。具體操作如下:

1.3.2.1 海棠果果醋因素集和評語集

因素集 U={u1，u2，u3，u4}={水果型香氣，發(fā)酵型香氣，海棠果原果汁風(fēng)味，刺激性酸味};

評語集={優(yōu)秀，較好，良，差};其中，優(yōu)秀(91～100分)，較好(81～90分)，良(71～80分)，差(≤60分)。

1.3.2.2 權(quán)重確定

采用感官評定法確定果醋各感官指標(biāo)權(quán)重分配，由10名專業(yè)評定人員對果醋中水果型香氣，發(fā)酵型香氣，海棠果原果汁風(fēng)味，刺激性酸味4個指標(biāo)的重要性打分，4個指標(biāo)評分總和為100。評定結(jié)果見表2。

表1 海棠果果醋感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Crabapple fruit vinegar sensory evaluation criteria

表2 權(quán)重感官評定結(jié)果Table 2 Weights sensory evaluation results

計算4個感官指標(biāo)的權(quán)重，以水果型香氣為例，權(quán)重為:19/100=0.19;

同理，發(fā)酵型香氣權(quán)重:27/100=0.27;海棠果原果汁權(quán)重:17/100=0.17;刺激性酸味權(quán)重:38/100=0.38。即權(quán)重集 X={0.19，0.27，0.17，0.38}，歸一化后得權(quán)重集 X={0.20，0.30，0.15，0.35}，總和為1。

1.3.3 果醋樣本理化及微生物指標(biāo)測定

總酸:堿液滴定法;總糖:斐林試劑法;pH:高精度pH計;酒精度:蒸餾法;總酯含量:蒸餾皂化法;菌落總數(shù):≤100 CFU/mL;大腸桿菌:≤5 MPN/dL;致病微生物:不得檢出。果醋樣本理化及微生物指標(biāo)見表3。

1.3.4 果醋理化及微生物指標(biāo)檢測結(jié)果

表3 海棠果果醋理化及微生物指標(biāo)檢測結(jié)果Table 3 Crabapple fruit vinegar physical，chemical and microbiological indicators test results

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用隨機(jī)Xcalibue工作站NIST 2005譜圖庫標(biāo)準(zhǔn)譜庫自動檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，按照內(nèi)標(biāo)添加量計算出各組分的相對含量(μg/mL)。只報道正反匹配均大于800的鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評定結(jié)果分析

按照評價規(guī)則和標(biāo)準(zhǔn)，10位感官評定員對采用不同菌種發(fā)酵的3份果醋樣品進(jìn)行細(xì)致的對比和客觀的評定，結(jié)果見表4。

根據(jù)表4中的數(shù)據(jù)可以得到3個樣品各自的模糊矩陣為 R1，R2，R3。

表4 不同菌種發(fā)酵果醋樣品的感官評定結(jié)果Table 4 Different strains fermented vinegar samples sensory evaluation results

2.2 確定模糊關(guān)系綜合評判集

同理得 Y12=0.3，Y13=0.35，Y14=0.2，得 Y1=(0.15，0.3，0.35，0.2)，從中可以得到模糊數(shù)學(xué)關(guān)系綜合評判的峰值為0.35，與原假設(shè)相比，可知A氧化的綜合評定級別為良(71～80分)。

同理可得 Y2=(0.3，0.35，0.2，0.1)，歸一化后得 Y2=(0.32，0.37，0.21，0.1)

得到模糊數(shù)學(xué)關(guān)系綜合評判的峰值為0.37，與原假設(shè)相比，可知B巴氏的綜合評定級別為好(81～90分)。

同理可得 Y3=(0.35，0.3，0.2，0)，歸一化得 Y3=(0.41，0.35，0.24，0)得到模糊數(shù)學(xué)關(guān)系綜合評判的峰值為0.41，與原假設(shè)相比，可知C混合的綜合評定級別為優(yōu)秀(91～100分)。

通過模糊數(shù)學(xué)法感官評定，對比3支果醋樣本的模糊數(shù)學(xué)關(guān)系綜合評判峰值可以看出，峰值大小關(guān)系為R3＞R1＞R2，說明在感官評定中，混合發(fā)酵果醋的綜合評價最高，其次是巴氏醋酸桿菌果醋，最后是氧化葡萄糖酸桿菌果醋。從感官評定的結(jié)果看出果醋在感官品質(zhì)上的區(qū)別主要體現(xiàn)在由發(fā)酵而產(chǎn)生的香氣特征方面，這些香氣特征則由香氣成分的組成、數(shù)量、感官閾值以及香氣物質(zhì)之間相互協(xié)調(diào)作用決定［5］，因此僅從感官評定的結(jié)果并不能有效地體現(xiàn)出不同菌種發(fā)酵對果醋風(fēng)味品質(zhì)具體的影響，需要借助頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)分析海棠果果醋香氣成分，進(jìn)一步討論果醋香氣成分之間的內(nèi)部聯(lián)系。

2.3 CG-MS氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析結(jié)果

用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對3支海棠果果醋樣本的香氣成分進(jìn)行分析，總離子流色譜圖見圖1，從3支果醋總離子流色譜圖可以看出，3支香氣成分保留時間和相對含量均存在差異，各組分質(zhì)譜經(jīng)計算機(jī)譜庫檢索及資料分析得出的香氣成分，結(jié)果見表5。

圖1 三支果醋樣本總離子流色譜圖Fig.1 Three vinegar sample total ion chromatogram

表5 三支果醋樣本GC/MS分析結(jié)果表Table 5 Three vinegar sample GC/MS analysis of the results

2.4 海棠果果醋香氣組成及主要香氣成分特點(diǎn)分析

通過表5看出，在3支果醋樣本的香氣成分中，主要以酯類、醇類、酸類、烴類、酚類和醛酮類為主，氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵的果醋中共鑒定出75種香氣成分，確認(rèn)匹配有32種，其中酯類(22.059 μg/mL)、醇類(22.755 μg/mL)、有機(jī)酸(8.155 μg/mL)、烴類(0.016 μg/mL)、酚類(0.137 μg/mL)、醛酮類(0.066 μg/mL);巴氏醋酸桿菌發(fā)酵的海棠果果醋中共鑒定出84種香氣成分，確認(rèn)匹配有44種，其中酯類(35.66 μg/mL)、醇類(30.616 μg/mL)、有機(jī)酸(12.33 μg/mL)、烴類(0.191 μg/mL)、酚 類 (0.159 μg/mL)、醛 酮 類(0.085 3 μg/mL);采用混合發(fā)酵的果醋中鑒定出92種香氣成分，確認(rèn)匹配有45種，其中以酯類(40.808 μg/mL)、醇類(31.908 μg/mL)、有機(jī)酸(18.008 μg/mL)、醛酮類(0.207 μg/mL)、烴類(0.061 μg/mL)、酚類(0.252 μg/mL)。在所有檢測出的香氣成分中，含量最為豐富的成分是酯類、醇類和酸類，其中相對含量較高的成分(＞1 μg/mg)有9種，分別是乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙醇、異戊醇、苯乙醇、乙酸，這幾個成分在 A氧化、B巴氏、C混合中均含有，分別為6、8、7種，只是含量上有差異，總相對含量分別為 48.72 μg/mg g、74.16 μg/mg、86.12 μg/mg，分別占3支果醋樣本總香氣成分的91.6%、93.8%、93.9%，其中乙酸乙酯、乙醇、異戊醇、苯乙醇、乙酸在3支果醋樣本中含量均＞1 μg/mg，乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯在 B巴氏、C混合中含量 ＞1 μg/mg，B巴氏中癸酸乙酯含量＞1 μg/mg，A氧化中辛酸乙酯含量＞1 μg/mg。這些含量較高的成分很有可能決定著果醋的主要風(fēng)味特征，其中，乙酸乙酯含量高且具有濃烈的水果香氣，容易揮發(fā)，故乙酸乙酯很有可能主導(dǎo)海棠果果醋的香氣特征;乙醇是酒精發(fā)酵階段的主要產(chǎn)物，乙醇本身的香氣柔和、甜潤，但是閾值較大［6］，可能對果醋的呈香起一定作用;乙酸又名醋酸，含量在3支果醋樣本中排第3，乙酸具有酸味，乙酸是果醋中酸味和刺激性口感的主要來源;少量的異戊醇具有類似于水果香和花香的氣味;苯乙醇是一種芳香烴的衍生物，具有濃郁花香味;乙酸異戊酯具有較強(qiáng)的類似蘋果的香味;乙酸異戊酯對海棠果果醋原果香味有一定的提升作用;乙酸苯乙酯可用于配制玫瑰香精;辛酸乙酯具有白蘭地香型香氣，用于配制食用香精;癸酸乙酯在B巴氏中含量遠(yuǎn)高于其他兩支果醋樣品，其具有椰子香型香氣，在一定程度上可以有效提升B巴氏的果香味。由于這9種物質(zhì)含量高且具有各自獨(dú)特的香氣特征，所以很可能是海棠果果醋中的主要香氣成分。

2.5 海棠果果醋香氣成分分類分析

2.5.1 酯類

酯類化合物的形成過程主要是在發(fā)酵和陳釀過程中果醋中有機(jī)酸與醇發(fā)生酯化反應(yīng)形成的，在這3支果醋樣本中，除了之前提到的5種含量較高的酯類物質(zhì)，3支海棠果果醋中還分別有5、10、10種酯類物質(zhì)，其中，乙酸異丁酯具有柔和水果酯香味，正己酸乙酯是無色液體，有香氣，在3支果醋樣本中均含有，并在B巴氏、C混合中含量較多;肉豆蔻酸乙酯可用于食用香精、酒用香精中，壬酸乙酯具有強(qiáng)烈的葡萄香氣，還有果香和酒香，均只在A氧化中存在，但含量很少，對果醋香氣提升作用可能不明顯;苯乙酸乙酯有濃烈而甜的蜂蜜香氣、玫瑰花香和果香香氣，只在B巴氏、C混合中含有，含量不高，對香氣的提升作用有限;乙酸糠酯用于配制帶果香的食用香精，如飲料、糖果等，只在C混合中存在，含量較低，對香氣提升的幫助不大。總體上來看，酯類化合物在果醋中的相對含量很高，并且酯類化合物本身屬于揮發(fā)性強(qiáng)、氣味強(qiáng)烈的物質(zhì)，因此酯類化合物很有可能是構(gòu)成果醋香氣特征風(fēng)味的主導(dǎo)成分。

2.5.2 醇類

醇類物質(zhì)的含量在3支果醋樣本中僅次于酯類，除乙醇、異戊醇和苯乙醇外，3支果醋樣本還分別含有8、9、8種醇類物質(zhì)，其中具有代表性的香氣成分有:香茅醇是最常用的香料，最適用于玫瑰香，也可作柑橘香的香精和許多香茅醇酯類的原料，在3支果醋樣本中都存在且含量相似，可以起到給果醋增香的作用;金合歡醇只在 B巴氏、C混合中含有，其主要用作丁香、玫瑰等花香韻香精的調(diào)合料，也有一定增香的功能。雖然醇類在果醋中含量很高，但真正具有香氣特征的成分并不多，由于醇類都是果醋酒精階段發(fā)酵或者蛋白質(zhì)水解過程中氨基酸脫羧而形成的產(chǎn)物［7］，故醇類物質(zhì)的存在除了提供給果醋一個圓潤的口感外，在香氣特征方面的影響較酯類物質(zhì)要小。

2.5.3 酸類

酸類物質(zhì)含量在果醋中排第3，其中醋酸的生成是果醋生產(chǎn)的主要環(huán)節(jié)。從乙醇氧化為醋酸分為兩個階段:由乙醇在乙醇脫氫酶的催化下氧化成乙醛，再由乙醛吸水形成乙醛水化物，接著由醛脫羧酶氧化成醋酸，由于樣品果醋未經(jīng)過后熟，各種反應(yīng)并不發(fā)生完全，經(jīng)過后熟之后，酸類物質(zhì)的含量可能還會有所上升。其他酸類物質(zhì)如9-癸烯酸、異丁酸、辛酸，在3支果醋樣本中均存在，9-癸烯酸呈顯著脂肪酸和蠟香，略有果香和乳香;異丁酸具有香味，可用作食用香料;辛酸具有香味，是允許使用的食用香料。另外在B巴氏、C混合中還含有月桂酸，具有月桂油香味。酸類物質(zhì)一般都具有較為強(qiáng)烈的刺激性口感，果醋中酸類成分對香氣的提升遠(yuǎn)不如其對果醋口感的影響。

2.5.4 醛酮類及烴類

醛酮類在3支果醋樣本中分別只有2、6、5種，總含量也分別只有 0.066 μg/mL、0.085 3μg/mL、0.207 μg/mL，其中3-羥基-2-丁酮和5-甲基呋喃醛在 B巴氏、C混合中均含有，前者呈現(xiàn)甜樣的焦糖氣味并帶有果甜味，后者可作為煙用香精;壬醛在含量較低的情況下呈現(xiàn)濃郁的花香味，在3支果醋樣本中都含有，但在C混合中較多;突厥酮和香葉基丙酮只在C混合中含有，前者具有甜的果香、青香、花香、木香和漿果香氣，后者可用于食品香精;仲辛酮、糠醛和十八醛只在B巴氏中含有少量，其中仲辛酮可作為食品香料，糠醛具有焦香氣味和甜樣焦糖氣味，十八醛具有椰子型香氣，略有茴香音韻，稀釋后有杏、李子香氣;烴類只有三氯甲烷這1種物質(zhì)，三氯甲烷易揮發(fā)，味辛甜并有特殊芳香氣味，在3支果醋樣本中均含有，可以看出，醛酮類及烴類物質(zhì)雖然含量不高，種類較少，但是這些物質(zhì)卻極具香氣特征，它們可能在一定程度上會增加或者輔助海棠果果醋的主體香氣［8］。

2.5.5 酚類

3支果醋樣本中檢測出并符合條件的酚類物質(zhì)只有兩種，分別為丁香酚和對乙烯基愈瘡木酚，其中丁香酚有強(qiáng)烈的丁香香氣，可用于香水香精以及各種化妝品香精和皂用香精配方中，還可以用于食用香精的調(diào)配;對乙烯基愈瘡木酚有特殊芳香氣味，可用作生產(chǎn)香料，3支果醋樣本中均含有這兩種物質(zhì)，C混合中含量較多，可以看出，這兩種物質(zhì)雖然含量較少，但是香氣特征明顯，很可能對果醋的主體香氣具有輔助作用。

3 結(jié)論

(1)采用模糊數(shù)學(xué)法對不同菌種發(fā)酵的海棠果果醋進(jìn)行感官評定，其中模糊數(shù)學(xué)綜合評定峰值大小為:R3＞R1＞R2;最后的感官評定結(jié)果為:A氧化的綜合評定級別為良(71～80分)，B巴氏的綜合評定級別為好(81～90分)，C混合的綜合評定級別為優(yōu)秀(91～100分)。

(2)采用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析了3種海棠果果醋的香氣成分，發(fā)現(xiàn)海棠果果醋中香氣成分種類非常豐富，主要有醇類、酯類、有機(jī)酸類、雜環(huán)類化合物、烴類以及酚類等，通過對3種果醋中的有效香氣成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，相對含量較高(＞μg/mg)的成分均為酯類、醇類或者酸類，總含量均占3支果醋樣本香氣成分總含量的90%以上，可以推斷，這些物質(zhì)可以看作是海棠果果醋的主要香氣成分，這些物質(zhì)共同構(gòu)成了海棠果果醋的主體香氣，其他含量較少的物質(zhì)也在一定程度上增加或輔助了海棠果果醋的香氣特征，正是由于這些物質(zhì)之間協(xié)同作用、共同協(xié)調(diào)，才形成了海棠果果醋獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)。

(3)不同菌種發(fā)酵對海棠果果醋的風(fēng)味品質(zhì)確實有明顯的影響，通過GC/MS分析，知其原因很可能與不同醋酸菌發(fā)酵過程中形成的產(chǎn)物在種類和含量上不同有關(guān)，其中有些物質(zhì)通常具有獨(dú)特的香味或者可以輔助其他物質(zhì)發(fā)揮出香氣，這從根本上決定了不同菌種發(fā)酵的海棠果果醋在風(fēng)味品質(zhì)上的差別，巴氏醋酸桿菌由于醋酸和酯類的轉(zhuǎn)化率高，所以制得的果醋在感官上要好于采用氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵的果醋，而這兩種醋酸菌混合發(fā)酵制取的海棠果果醋無論是理化檢驗指標(biāo)和感官評定結(jié)果，還是物質(zhì)利用率、產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率以及發(fā)酵效率，相比單菌發(fā)酵都有明顯提高，與同類的市售果醋飲料相比也具有一定的優(yōu)勢。

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