蘭 西，吳松權(quán)，金美玉，全雪麗

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

基于SRAP的松茸特異性分子標(biāo)記*

蘭 西，吳松權(quán)，金美玉，全雪麗**

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

為了準(zhǔn)確鑒定松茸，確保消費(fèi)者品嘗到貨真價實(shí)的松茸，該研究基于SRAP（sequence-related amplified polymorphism分子標(biāo)記，從300對引物組合中分別篩選出1對松茸特異性引物（ME10、EM6），并將這對引物擴(kuò)增的特異條帶進(jìn)行克隆、測序和設(shè)計(jì)引物后，成功地構(gòu)建了松茸特異性分子標(biāo)記（304 bp）。松茸在特異性分子標(biāo)記（304 bp）均能擴(kuò)增出條帶，該標(biāo)記在分子水平上可準(zhǔn)確、快速地鑒定出松茸，并可有效地保證松茸的品質(zhì)。

松茸；假松茸；SRAP；特異性分子標(biāo)記；特異引物

松茸（Tricholoma matsutake） 屬于口蘑屬 (Tricholoma)真菌[1-2]，菌株與針葉樹根部形成外生菌根[3]。被譽(yù)為“菌中之王”[4]。除了可食用外，松茸還具有很高的藥用價值。由于難以合成具有樹木根系活力的營養(yǎng)條件和生物環(huán)境，馴化、栽培十分困難，目前還不能實(shí)現(xiàn)人工栽培[5-6]。松茸營養(yǎng)豐富，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明松茸可治療糖尿病，并具有抗癌作用[7]。現(xiàn)已經(jīng)被列為國家重點(diǎn)二級保護(hù)物種[8]。

假松茸 (Tricholoma bakamatsutake)即假松口蘑，因其外觀、香味、口感與松茸相似[9]，常被拿來冒充松茸銷售。常規(guī)鑒別松茸與假松茸的方法主要通過目測和顯微鏡觀察子實(shí)體形態(tài)特點(diǎn)，但這些常規(guī)方法仍存在較大誤差，易出現(xiàn)判斷失誤的情況。

前人對該領(lǐng)域的研究大多數(shù)是針對多態(tài)性條帶加以分析，該方法具有不穩(wěn)定、差異性大等特點(diǎn)，隨著人們對松茸的不懈探索，近幾年更多分子水平上的不同方法陸續(xù)應(yīng)用于鑒別松茸和假松茸，如：基于 ITS（internal transcribed spacers）[10]、基于RAPD（polymerase chain reaction） 的 SCAR（sequence characterized amplified regions） 標(biāo)記[11]。但還沒有基于SRAP（sequence-related amplified polymorphism）的方法區(qū)分松茸和假松茸的報道。SRAP是一種新型的分子技術(shù)，具有更高的共顯性、高重復(fù)性、多態(tài)性、信息量。除此之外，其引物設(shè)計(jì)簡單，具有在基因組中分布均勻的特點(diǎn)。因此，SRAP廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源遺傳評價、遺傳圖譜構(gòu)建、繪制基因轉(zhuǎn)錄圖譜[12-14]。本研究將基于SRAP分子標(biāo)記構(gòu)建松茸的特異性分子標(biāo)記，以探索出一種準(zhǔn)確、快速鑒定松茸的方法。

1　材料與方法

1.1材料

分別從黑龍江省牡丹江、吉林省安圖縣、吉林省龍井縣采集松茸子實(shí)體，經(jīng)過專家傅偉杰教授鑒定以后，在-75℃的超低溫冰箱中保存。

1.2基因組總DNA提取

采用改進(jìn)的CTAB（chexadecyltrimethylammonium bromide）法提取松茸與假松茸的DNA[15]。

1.3SRAP分析

松茸、假松茸基因池的建立采用了BSA（bovine serum albumin）方法[16]，選取5個松茸子實(shí)體和5個假松茸子實(shí)體。每個松茸子實(shí)體各取500 ng混合組成松茸池；每個假松茸子實(shí)體各取500 ng混合組成假松茸基因池。松茸與假松茸來源見表1。

表1　松茸、假松茸的來源Tab.1　Source of T.matsutake and T.bakamatsutake in this study

1.3.1反應(yīng)體系

總體積為20 μL，包括模版5 ng·μL-1DNA 2 μL，2 μmol·L-1上游、下游引物各2 μL，2 mmol·L-1dNTP 2 μL，2.5 U·μL-1B Taq DNA聚合酶0.4 μL（Toyobo公司），10×B Taq buffer 2 μL，剩余使用雙重蒸餾水補(bǔ)足。

1.3.2PCR擴(kuò)增程序

94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，36個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.3.3PCR產(chǎn)物檢測

PCR產(chǎn)物放在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，用0.5 μg·mL-1的溴化乙錠染色。電泳緩沖液為1×TAE（pH 8.0），在85 V恒壓下電泳約40 min左右，用Dolphin凝膠成像儀拍照保存。

1.3.4特異性片段的回收、克隆和測序

將目的DNA片段切下后，裝進(jìn)1.5 mL的離心管中，按照康為世紀(jì)公司膠回收試劑盒說明書將目的片段回收。將回收的片段與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109上，轉(zhuǎn)化后的片段經(jīng)克隆過夜搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA后，采用M13引物進(jìn)行鑒定，其鑒定體系總體積為20 μL，包括質(zhì)粒5 ng·μL-1DNA 2 μL，2 μmol·L-1上游、下游引物各2 μL，2 mmol·L-1dNTP 2 μL，2.5 U·μL-1B Taq DNA聚合酶0.4 μL（Toyobo公司），10×B Taq buffer 2 μL，剩余用雙重蒸餾水補(bǔ)足。鑒定的陽性克隆委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。

1.4松茸特異引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)測序結(jié)果和引物設(shè)計(jì)原則用Primer primer 5設(shè)計(jì)松茸特異性上游引物Tm-1（ACGGAGGGAG GAGGATAACG） 和下游引物Tm-2（ATCTTGCC CTTTGTCCAGCC）；引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，除上游、下游引物（2 μmol·L-1）各2 μL，其余成分同1.3.2 PCR反應(yīng)體系相同。

松茸特異性PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，循環(huán)30次；最后72℃延伸5 min。

2　結(jié)果與分析

2.1SRAP標(biāo)記

以松茸、假松茸基因池DNA為模板，從300對引物組合中（ME1～ME10和EM1～EM30），篩選出1對松茸具有特異性的引物ME10（TGGGGACAACC CGGCTT）和EM6（GACTGCGTACGAATTGCA）。采用這對引物對構(gòu)成松茸基因池每個單株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增（圖1），在松茸單株中均能夠擴(kuò)增出一條650 bp的條帶，而在假松茸單株中則沒有出現(xiàn)650 bp的條帶。

圖1　引物ME10、EM6對松茸、假松茸的單株P(guān)CR擴(kuò)增圖譜Fig.1　PCR results of individuals of T.matsutake and T. bakamatsutake with primers of ME10 and EM6

圖2　松茸目的片段的堿基序列Fig.2　Sequence of target fragment of T.matsutake

2.2松茸特異引物性標(biāo)記的建立

根據(jù)測序的結(jié)果，設(shè)計(jì)了1對松茸特異引物Tm-1和Tm-2（圖2雙下滑線部分），對松茸和假松茸基因池DNA的每個單株重新擴(kuò)增。在Tm-1和 Tm-2的引物擴(kuò)增中，松茸均能擴(kuò)增出304 bp的特征帶，但是假松茸未能擴(kuò)增出任何條帶，結(jié)果與預(yù)測的相似，見圖3。結(jié)果表現(xiàn)出特異標(biāo)記的準(zhǔn)確性和高效。

圖3 引物Tm-1和Tm-2對松茸、假松茸基因池DNA每個單株的PCR擴(kuò)增圖譜Fig.3　PCR results of individuals of T.matsutake and T. bakamatsutake with primers of Tm-1 andTm-2

2.3對SRAP特異分子標(biāo)記的驗(yàn)證結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證松茸標(biāo)記的準(zhǔn)確性，用松茸特異性引物（Tm-1、Tm-2）對源自吉林省龍井市、云南省昆明市、日本、云南省寶山鎮(zhèn)等不同地區(qū)松茸和源自云南省麗江市、吉林省安圖縣、吉林省龍井市等不同地區(qū)的假松茸進(jìn)行了PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

圖4 引物Tm-1和Tm-2對松茸和假松茸PCR擴(kuò)增圖譜Fig.4　PCR results of T.matsutake and T.bakamatsutake with primers of Tm-1 and Tm-2

圖4表明在來源不同的松茸中，松茸特異性引物均擴(kuò)增出304 bp特異條帶，假松茸中則未擴(kuò)增出任何條帶。

2.4結(jié)論

本研究基于SRAP建立松茸特異性分子標(biāo)記即304 bp，通過該標(biāo)記可以在分子水平上快速準(zhǔn)確地鑒定出松茸與假松茸?；谒扇滋禺愋蛄袠?gòu)建的分子標(biāo)記可確保消費(fèi)者購買和品嘗到貨真價實(shí)的松茸。

3　討論

假松茸目前也屬于中國珍稀的食用菌，因其肉嫩味美，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，而深受人們喜愛。從形態(tài)上很難鑒定出松茸和假松茸，即使是松茸方面專家有時也不能區(qū)分開來。松茸與假松茸相比，其營養(yǎng)價值更高。加之松茸由于種種原因不能人工栽培，目前出售的松茸均為野生松茸，其價格是假松茸價格的10倍以上。因此常有不法商販將假松茸混入松茸中出售，嚴(yán)重影響了松茸品質(zhì)。基于SRAP建立松茸特異性分子標(biāo)記可以快速、準(zhǔn)確地鑒別出松茸與假松茸，不但維護(hù)消費(fèi)者利益，同時也為以采摘松茸為生的菇農(nóng)創(chuàng)造更加公平的條件。

鑒定物種的真?zhèn)纬Ｓ梅肿訕?biāo)記方法，該方法是在生物DNA層面進(jìn)行鑒定，可準(zhǔn)確反應(yīng)出該個體或種群的本質(zhì)特征[17]，其鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，而且成本低，實(shí)驗(yàn)操作方便，可以在實(shí)驗(yàn)室操作而不需要等待生物生長周期，也不受外界環(huán)境條件的影響[18-19]。目前分子標(biāo)記方法很多，如RAPD、ITS、SRAP、SCAR等。吳松權(quán)等[11]在RAPD分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上建立松茸特異性SCAR標(biāo)記。SRAP分子標(biāo)記方法相對RAPD能擴(kuò)增出更多的條帶，可更加準(zhǔn)確地鑒定出松茸與假松茸。沙濤等[10]利用松茸與假松茸存在的核糖體基因間隔區(qū)（ITS）長度大小不一，而將松茸與假松茸區(qū)別開。而本實(shí)驗(yàn)是基于特異基因序列的有無來鑒別松茸，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠。本研究在SRAP的分子標(biāo)記基礎(chǔ)上，根據(jù)基因序列的有無，分別發(fā)現(xiàn)了松茸與假松茸的特異序列；同時根據(jù)其特異序列分別設(shè)計(jì)了1對特異引物，經(jīng)PCR建立了松茸的特異性的分子標(biāo)記，此分子標(biāo)記具有高效、準(zhǔn)確、可重復(fù)等特點(diǎn)，進(jìn)一步表明了SRAP分子標(biāo)記在物種真?zhèn)舞b別中的實(shí)用性。之前我們曾在SRAP分子標(biāo)記基礎(chǔ)上克隆了松茸特異性序列（422 bp） 并建立了其特異性分子標(biāo)記（243 bp）[20]。但該標(biāo)記仍然不能滿足開發(fā)松茸特異性試劑盒所需的DNA序列及其分子標(biāo)記的要求。本研究所克隆的松茸特異性DNA序列長度為650 bp，與之前422 bp DNA序列的相似性僅為50.6%，屬于不同的基因或DNA片段；同時所構(gòu)建的松茸特異性分子標(biāo)記長度（304 bp）與之前也不同，這些松茸特異性分子標(biāo)記的建立，為松茸特異試劑盒的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

將本實(shí)驗(yàn)所得的序列在NCBI上比對分析未發(fā)現(xiàn)任何結(jié)果，原因可能是已報到松茸和假松茸基因序列太少，也可能是所得的序列只是基因標(biāo)記序列，其驗(yàn)證工作正在進(jìn)行中。

[1]李長田，刁盈盈,毛欣欣，等.松茸液態(tài)發(fā)酵菌絲生長量因子的研究[J].菌物學(xué)報，2012，31（2）：229-234.

[2]方明，李玉，姚方杰，等.松茸研究概況[J].中國食用菌，2005，24（6）：12-15.

[3]Takashi Yamanaka,Miki Konno,Masataka Kawai,et al.The host ranges of conifer-associated Tricholoma matsutake,Fagaceae-associated Tricholoma bakamatsutake and Tricholoma fulvocastaneum are wider in vitro than in nature[J].Mycologia, 2014,106(3):397-406.

[4]張微思，羅孝坤，張麗英，等.松茸菌絲體的純培養(yǎng)及其鑒定[J].中國食用菌，2010，29（3）：34-36.

[5]吳松權(quán)，全雪麗，傅偉杰，等.RAPD標(biāo)記在松口蘑菌絲體鑒定中的應(yīng)用[J].中國食用菌，2006，25（4）：41-43.

[6]Yamada Akiyoshi,Endo Naoki,Murata Hitoshi,et al.Tricholoma matsutake Y1 strain associated with Pinus densiflora shows a gradient of in vitro ectomycorrhizal specificity with Pinaceae and oak hosts[J].Mycoscience,2014,55(1):27-34.

[7]傅偉杰，許廣波，梁運(yùn)江，等.松茸、姬松茸生產(chǎn)關(guān)鍵技百問百答[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：1-8.

[8]劉培貴，袁明生，王向華，等.松茸群生物資源及其合理利用與有效保護(hù)[J].自然資源學(xué)報，1999，14（3）：245-252.

[9]史剛榮.姬松茸研究的現(xiàn)狀和展望[J].江蘇食用菌，1995，16（4）：21-22.

[10]沙濤，丁驊孫，李覓，等.松口蘑與假松口蘑ITS序列測定和分析比較[J].菌物學(xué)報，2005，24（1）：48-52.

[11]吳松權(quán)，管清杰，全雪麗，等.松茸SCAR標(biāo)記的建立[J].林業(yè)科學(xué)，2007，43（10）：150-153.

[12]徐操，趙寶華.SRAP分子標(biāo)記的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].生命科學(xué)儀器，2009，7（4）：24-27.

[13]應(yīng)正河，吳小平，謝寶貴，等.香菇SRAP反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].食用菌學(xué)報，2006，13（4）：1-5.

[14]許美燕，唐傳紅，張勁松，等.利用SRAP和ISSR建立快速鑒定靈芝屬菌株的SCAR標(biāo)記[J].菌物學(xué)報，2008，27（5）：707-717.

[15]曾東方，羅信昌，傅偉杰.松口蘑菌絲體的分離和RAPD-PCR分析[J].微生物報，2001，41（3）：278-286.

[16]鄒喻蘋，葛頌，王曉東.系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記[J].北京：科學(xué)出版社，2001：30-51.

[17]方宣鈞，劉思衡，江樹業(yè).品種純度和真?zhèn)蔚腄NA分子標(biāo)定及其用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2000，8（2）：106-110.

[18]張婷，王元忠，張曉東，等.分子標(biāo)記在食（藥）用真菌遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J].生命科學(xué)，2013，25（10）：1000-1007.

[19]曹輝，劉玉萍.分子標(biāo)記技術(shù)在藥品種鑒別中的應(yīng)用[J].中國藥學(xué)雜志，1998，33（5）：269-273.

[20]蘭西，全雪麗，金美玉，等.基于SRAP的松茸與假松茸特異性分子標(biāo)記[J].食用菌學(xué)報，2015，22（1）：21-25.

Specific Molecular Markers of Tricholoma matsutake Based on SRAP

LAN Xi,WU Song-quan,JIN Mei-yu,QUAN Xue-li
(College of Agriculture,Yanbian University,Yanji 133000,China)

In order to accurately identify between Tricholoma matsutake and T.bakamatsutake,and to ensure that consumers enjoy real T.matsutake,we screened a pair of primer that was specific for T.matsutake from 300 pairs of primers based on SRAP（sequence-related amplified polymorphism molecular markers.Then a SCAR（sequence characterized amplified regionsmarker(304 bp)for T.matsutake was successfully developed with cloning,sequencing and designing specific primers.This SCAR marker only presented in the individuals of T.matsutake,and the marker might be used quickly and accurately identify T.matsutake on the molecular level and effectively guaranteed the quality of the T.matsutake.

Tricholoma matsutake;Tricholoma bakamatsutake;SRAP;molecular markers of specific;specific primer

S646.9A1003-8310（2015）05-0041-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.05.011

吉林省自然科學(xué)基金（20130101146JC）。

蘭西（1989-），女，在讀碩士研究生，主要從事生物技術(shù)方面研究。E-mail:1006322610@qq.com

**通信作者：全雪麗（1973-），女，博士，教授，主要從事植物學(xué)方面研究。E-mail:quanxueli2000@yahoo.com.cn

2015-06-28