程林兵龔雁王金勝繆曉青

(1福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院；2福建蜂療醫(yī)院；3天然生物毒素國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，福州，350002)

蜂毒制劑“神蜂精”對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血管表皮生長因子及其受體的影響

程林兵1,2，3龔雁1,3王金勝1,3繆曉青1,2,3

(1福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院；2福建蜂療醫(yī)院；3天然生物毒素國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，福州，350002)

目的：探討“神蜂精”對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療的可能機(jī)制。方法：60只SD雄性大鼠進(jìn)行隨機(jī)性分組，分為正常組、模型組、“神蜂精”高劑量組(1.0mL/kg/d)、“神蜂精”中劑量組(0.5mL/kg/d)、“神蜂精”低劑量組(0.25 mL/kg/d)、陽性組(復(fù)方醋酸地塞米松乳膏給藥組，1.0g/kg/d)，每組10只。除正常組外，其余組大鼠右后足跖皮下注射完全弗氏佐劑誘導(dǎo)產(chǎn)生佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)。造模14 d后連續(xù)給藥28 d。測量注射足足腫脹體積，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測定大鼠血清中血管表皮生長因子(VEGF)、血管表皮生長因子受體-1(VEGFR-1)及血管表皮生長因子受體-2(VEGFR-2)的含量。結(jié)果：(1)與模型組相比，“神蜂精”治療組均能顯著降低大鼠注射足足爪腫脹度(p＜0.01)；(2)與模型組相比，“神蜂精”高劑量組、中劑量組大鼠血清中VEGF和VEGFR-1含量，極顯著降低（p＜0.01，p＜0.05）；(3)各組大鼠血清中VEGFR-2的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。結(jié)論：“神蜂精”明顯的抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足部炎癥，降低血清VEGF及VEGFR-1的表達(dá)，從而減輕關(guān)節(jié)病理性血管新生。

“神蜂精”；佐劑性關(guān)節(jié)炎；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；VEGF，VEGFR-1，VEGFR-2

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病，其主要病癥是慢性炎癥，進(jìn)一步產(chǎn)生滑膜增生、血管翳生成，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)和軟骨破壞[1]。血管表皮生長因子是一種能特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、維持血管內(nèi)皮細(xì)胞分化狀態(tài)、提高微血管通透性的蛋白質(zhì)[2]。它能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，從而促進(jìn)新生血管的形成；增強(qiáng)血管通透性，促使血管內(nèi)物質(zhì)的滲出，從而刺激炎癥的形成和發(fā)展[3]。VEGF結(jié)合到血管表皮生長因子受體上發(fā)揮血管生成調(diào)節(jié)作用，血管表皮生長因子受體主要有VEGFR-1和VEGFR-2[4]。“神蜂精”是一種蜂毒、蜂膠及乳香、九里香、穿山龍等中藥制成中藥外用制劑。研究證明“神蜂精”消炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、祛風(fēng)除濕、通經(jīng)散寒、行氣活血、促進(jìn)損傷組織修復(fù)等作用[5,6]。前期實(shí)驗(yàn)證明“神蜂精”可緩解大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)炎癥，減輕免疫器官病變，影響AA大鼠血清中各種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的表達(dá)。本研究通過觀察“神蜂精”對AA大鼠血清中血管表皮生長因子(MMP-2)、血管表皮生長因子受體-1(VEGFR-1)及血管表皮生長因子受體-2(VEGFR-2)含量的影響，旨在進(jìn)一步探討該藥治療RA作用機(jī)理。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量130±20 g，由上海斯萊特實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境：動(dòng)物分別飼養(yǎng)在籠中，室溫為23±1℃，濕度為55±5%，白天與黑夜交替各12 h。動(dòng)物自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1.2 藥物與試劑

卡介苗(50 mg/支)：上海市生物制品研究所；不完全弗氏佐劑(10 ml/瓶)：美國sigma公司；復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(20 g/支，含地塞米松15 mg)：華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：1203007H；“神蜂精”(10 ml/瓶)：福建省神蜂科技有限公司，生產(chǎn)批號：SF000204130401，閩藥制字Z20100001。VEGF酶聯(lián)免疫吸附試劑盒：南京建成生物研究所提供。VEGFR-1酶聯(lián)免疫吸附試劑盒：南京建成生物研究所提供。VEGFR-2酶聯(lián)免疫吸附試劑盒：南京建成生物研究所提供。

1.3 主要儀器

YLS-足腫脹測量儀；電子天平；電熱恒溫水浴箱；漩渦混合儀；離心機(jī)；酶標(biāo)儀等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

60只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、陽性組（復(fù)方醋酸地塞米松給藥組）、“神蜂精”高劑量組、“神蜂精”中低劑量組、“神蜂精”低劑量組，每組10只。

2.2 AA大鼠模型的建立和給藥

取卡介苗50 mg，80℃水浴滅活1 h后，加入不完全弗氏佐劑10 ml，混勻，充分乳化，直至將其滴在水面上不散開為止，即為完全弗氏佐劑(Complement Freund's Adjuvant,CFA)，濃度為10 mg/mL。

取用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，對大鼠的右后足進(jìn)行消毒。除正常組之外，其余組的大鼠每只右后足跖皮下注射0.1 mL CFA。正常組的大鼠則注射等量的生理鹽水。設(shè)定注射當(dāng)天為第1 d。

造模14 d后，正常組大鼠不做任何處理，而對其余各組大鼠注射足進(jìn)行外部涂抹給藥。其中模型組每只大鼠涂抹0.5 mL/kg/d生理鹽水；“神蜂精”高、中、低劑量組每只大鼠分別涂抹1.0 mL/kg/d、0.5 mL/kg/d和0.25 mL/kg/d“神蜂精”；陽性組每只大鼠涂抹1.0 g/kg/d復(fù)方醋酸地塞米松乳膏。各組均連續(xù)給藥28 d。

2.3 大鼠體重及足跖體積的測量

各組大鼠分別于造模前、造模后d6，d12，d18，d24，d30測量大鼠體重。各組大鼠分別于致炎前、致炎后d15，d21，d27，d33，d39用足趾腫脹測量儀測量大鼠足跖體積，求出足腫脹度(公式如下)。

2.4 大鼠外周血的采集和處理

所有大鼠于末日給藥24 h后，稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg·kg－1麻醉，眼眶取血約3 mL，靜置30 min后，3000 rpm離心15 min，分離血清，-20℃保存。

2.5 大鼠血清中VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2含量測定

大鼠血清中VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2含量分別采用VEGF酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、VEGFR-1酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、VEGFR-2酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用單因素方差分析。p＜0.05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 “神蜂精”對AA大鼠足腫脹度的影響

“神蜂精”對AA大鼠足腫脹度的影響實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：給藥前(d15)，與模型組相比，各組大鼠足腫脹度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。給藥后(d21)時(shí)，與模型組相比，“神蜂精”高劑量組足爪腫脹度降低(p＜0.05)，陽性組大鼠足腫脹度顯著降低(p＜0.01)，其余組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)；給藥后d27、d33、d37時(shí)，“神蜂精”高、中、低劑量組和陽性組均可明顯抑制AA大鼠足腫脹，與模型組比較，有極顯著性差異(p＜0.01)。這說明“神蜂精”對AA大鼠有抗炎作用。

3.2 “神蜂精”對AA大鼠血清中VEGF含量的影響

“神蜂精”對AA大鼠血清中VEGF的影響實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組大鼠血清VEGF含量極顯著增加（p＜0.01）?！吧穹渚备邉┝拷M大鼠血清中VEGF含量，與模型組比較極顯著降低（p＜0.01），“神蜂精”中劑量組和陽性組大鼠血清中VEGF含量，與模型組比較有顯著性差異（p＜0.05）。

3.3 “神蜂精”對AA大鼠血清中VEGFR-1含量影響

“神蜂精”對AA大鼠血清中VEGFR-1的影響實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組大鼠血清VEGFR-1含量極顯著增加（p＜0.01）?！吧穹渚备邉┝拷M大鼠血清中VEGFR-1含量，與模型組比較極顯著降低（p＜0.01），“神蜂精”中劑量組和陽性組大鼠血清中VEGFR-1含量，與模型組比較有顯著性差異（p＜0.05）。

3.4 “神蜂精”對AA大鼠血清中VEGFR-2含量影響

“神蜂精”對AA大鼠血清中VEGFR-2的影響實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：各組大鼠血清中VEGFR-2含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。

表1 “神蜂精”對AA大鼠足腫脹度(mL)的影響

表1 “神蜂精”對AA大鼠足腫脹度(mL)的影響

注：與模型組相比Ap＜0.01，a p＜0.05

組別給藥后(d21)給藥后(d27)給藥后(d33)給藥后(d39)給藥前(d15)正常組0.1811±0.02150.2122±0.01840.2400±.02270.2755±0.02250.3233±0.0177模型組1.8113±0.08811.8114±0.12331.7985±0.12231.7475±0.10441.7744±.1053陽性組1.7767±0.08801.4677±0.0466A1.3088±0.0832 A1.1566±.0329 A0.9910±0.0216 A高劑量組1.7711±0.09081.5578±0.0356 a1.3877±0.0475 A1.1411±.0345 A0.9540±0.0691 A中劑量組1.7555±0.04111.6066±0.04661.4060±0.0289 A1.2822±.0692 A1.0133±0.0311 A低劑量組1.7600±0.05571.6677±0.03921.4100±0.0671 A1.2060±.0514 A1.0550±0.0696 A

表2 “神蜂精”對AA大鼠血清中VEGF含量的影響

表2 “神蜂精”對AA大鼠血清中VEGF含量的影響

注：與正常組相比A p＜0.01，a p＜0.05，與模型組相比B p＜0. 01，b p＜0.05

組別劑量（mg/kg）動(dòng)物只數(shù)VEGF(pg/mL)正常組-1079.8906±5.1328 B模型組-10124.4910±7.3557 A陽性組1.0mg/kg1091.3243±6.44658b“神蜂精”1.0mL/kg1084.1213±3.1558 B“神蜂精”0.5mL/kg1099.2471±11.5752 b“神蜂精”0.25mL/kg10106.6180±3.9813

表3 “神蜂精”對AA大鼠血清中VEGFR-1含量的影響

表3 “神蜂精”對AA大鼠血清中VEGFR-1含量的影響

注：與正常組相比A p＜0.01，a p＜0.05，與模型組相比B p＜0. 01，b p＜0.05

組別劑量（mg/kg）動(dòng)物只數(shù)VEGF-1(pg/mL)正常組-10195.9191±13.7342B模型組-10318.7605±10.1967A陽性組1.0mg/kg10236.8791±12.5753b“神蜂精”1.0mL/kg10200.1531±15.2766B“神蜂精”0.5mL/kg10240.0264±9.6647b“神蜂精”0.25mL/kg10265.7083±12.5643

4 討論

大鼠足腫脹度是反映AA大鼠炎癥程度的主要指標(biāo)[7,8]，可以評價(jià)“神蜂精”對AA大鼠是否具有抗炎作用。在本研究造模期間，AA大鼠的足爪腫脹出現(xiàn)了兩次高峰，與文獻(xiàn)[9,10]所報(bào)道的AA大鼠經(jīng)歷的幾個(gè)階段性變化基本相似，模型組大鼠足腫脹度明顯高于正常對照組，表明AA大鼠模型復(fù)制成功。AA大鼠的足腫脹度結(jié)果顯示，給藥初期，高劑量“神蜂精”和陽性藥物的治療效果更為明顯。但是隨著給藥周期變長，“神蜂精”各組和陽性組消腫效果無顯著差異性。根據(jù)以上研究結(jié)果表明“神蜂精”具有抗炎作用。

RA是一種自身免疫性疾病，該病變呈持續(xù)性和反復(fù)性，損害大，致殘率高。血管翳形成是RA主要病理特征，而血管翳產(chǎn)生和維持的必要條件是血管新生[11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)內(nèi)血管新生的程度與患者炎癥、關(guān)節(jié)損壞程度呈正比[12]。藥物在治療RA的過程中，除了控制炎癥外，還要起到緩解關(guān)節(jié)骨和軟骨的腐蝕的作用，從而保護(hù)患者的關(guān)節(jié)病變。因此血管新生抑制作用就成為開發(fā)RA藥物的新思路之一。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體、血管生成素及其受體、金屬蛋白酶類等多肽類生長因子相互作用，共同參與RA血管新生過程[13]。VEGF在關(guān)節(jié)炎的形成及病理進(jìn)展過程中有極其重要的作用。VEGF的主要靶細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)新生血管形成，通過增強(qiáng)血管的通透性，促進(jìn)炎性滲出，進(jìn)而促進(jìn)炎癥的形成和發(fā)展[13]。VEGF通過和血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，具有強(qiáng)大的促內(nèi)皮增殖、促血管生成作用[14]。董文娟等[15]研究了穿山龍總皂苷對實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎滑膜血管新生的影響，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠滑膜新生血管增多，VEGF及其受體表達(dá)升高，穿山龍總皂苷治療后可能通過抑制VEGF及其受體表達(dá)來發(fā)揮血管新生抑制作用。史永博等[16]研究仙龍顆粒對AA大鼠的治療作用及其機(jī)制，結(jié)果表明仙濃顆粒可能通過降低AA大鼠血清中VEGF含量，抑制血管新生，降低血管通透性，而起到治療作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中VEGF和VEGFR-1含量顯著增加，一定劑量“神蜂精”治療之后，大鼠血清中VEGF和VEGFR-1含量顯著降低。而各組大鼠血清中VEGFR-2含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，本研究提示“神蜂精”明顯的抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足部炎癥，降低血清VEGF及VEGFR-1的表達(dá)。其作用機(jī)制可能與通過抑制VEGF/VEGFR-1途徑，抑制血管新生有關(guān)。

表4 “神蜂精”對AA大鼠血清中VEGF－2含量的影響

表4 “神蜂精”對AA大鼠血清中VEGF－2含量的影響

注：與正常組相比A p＜0.01，a p＜0.05，與模型組相比B p＜0.01，b p＜0.05

組別劑量（mg/kg）動(dòng)物只數(shù)VEGF-2(pg/mL)正常組-10153.6230±14.0809模型組-10187.3858±8.5986陽性組1.0mg/kg10163.2723±7.0281“神蜂精”1.0mL/kg10167.2454±9.7800“神蜂精”0.5mL/kg10171.1977±10.7803“神蜂精”0.25mL/kg10162.0283±13.3868

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Effects of Bee Venom Preparation Shen Fengjing on Inflammatory Mediators in Adjuvant Arthritic Rats

Cheng Linbing1,2Gong Yan1Wang Jingsheng1Miao Xiaoqing1,2,3
(1 College of Bee Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,350002;2 Fujian Apitherapy Hospital,Fuzhou,350002;3 State and local Joint Engineering Laboratory of Natural Biotoxin,Fuzhou,350002)

Objective：To investigate the mechanism of Shen Fengjing(SFJ)for adjuvant arthritic(AA)rats．Methods: Complete Freund's adjuvant(CFA)was injected to induce experimental arthritis in rats.60 SD male rats were randomly divided into the normal group,model group,SFJ high-dose group,SFJ middle-dose group,SFJ low-dose group, Compound Dexamethaso(CD)group with 10 rats in each.A model of experimental adjuvant-induced arthritic rats(AA rats)was established in the latter five groups.After 14 days,the six groups were treated with normal saline,1.0mL/kg SFJ and 0.5,0.25mL/kg SFJ,1.0g/kg CD by local treatment for 28 days.Paw swelling degree of AA rats was measured. The content of vascular endothelial growth factor,vascular endothelial growth factor receptor-1 and vascular endothelial growth factor receptor-2(VEGF,VEGFR-1,VEGFR-2)in serum were measured by Enzyme-linked Immunosorbent Assay(ELISA)kits.Results:(1)Compare with the model group,all SFJ-treated groups significantly decreased the paw swelling degree(p＜0.01);(2)Compare with the model group,High SFJ-treated group and middle SFJ-treated group significantly decreased the content of VEGF and VEGFR-1 in the serum of rats(p＜0.01,p＜0.05);(3)Compare with the model group,the content of VEGFR-2 in the serum of all groups had no significant difference(p＞0.05).Conclusions:SFJ could significantly inhibit the inflammation of the AA rats,and decreased the content of VEGF and VEGFR-1 of AA rats,then reduced joint pathological?angiogenesis.

Shen Fengjing;rheumatoid arthritis;adjuvant arthritis;paw swelling degree;VEGF;VEGFR-1; VEGFR-2

福建省科技廳資助(No 2012D078)

程林兵，男，副研究員，研究方向：蜂療。

繆曉青，男，教授，博士生導(dǎo)師，福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所所長，E-mail:mxqsf88@126.com。