陳洋洋， 張曉鋒， 侯英敏， 孫玉梅

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

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發(fā)酵性絲孢酵母酯酶的穩(wěn)定性研究

陳洋洋， 張曉鋒， 侯英敏， 孫玉梅*

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

以發(fā)酵性絲孢酵母胞壁酯酶為研究對(duì)象，研究了其在不同理化條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：0 ℃保存24 h，酯酶仍保持81.5%原酶活；在40 ℃完全失活；5 mmol/L K+、Mn2+和Fe2+提高酶活力6.9%以下，5 mmol/L Ca2+、Cu2+分別降低酶活力90.7%和73.3%；1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同) Tween-40和TritonX-100保持77%以上原酶活，1%Tween-80提高酶活力23.3%，1% 十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)和十六烷基三甲基溴化銨 (Cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)完全抑制酶活；5%甘油、阿拉伯膠和糊精分別提高酶活力57%、29.6% 和2%，5%可溶性淀粉和牛血清蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)分別降低酶活力20.4%和71.5%。發(fā)酵性絲孢酵母酯酶熱穩(wěn)定性差，宜10 ℃以下貯存，甘油對(duì)其保護(hù)作用良好，BSA強(qiáng)烈抑制該酶活性。該酯酶對(duì)處理含油脂廢水和增強(qiáng)洗滌劑洗滌效果有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)酵性絲孢酵母；酯酶；穩(wěn)定性

微生物酯酶作為重要的工業(yè)酶類，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品等行業(yè)[1]。自然界中產(chǎn)酯酶的微生物主要有酵母菌、紅曲霉、青霉和細(xì)菌等[2]。關(guān)于酵母菌產(chǎn)酯酶的研究主要集中在高產(chǎn)酯酶酵母菌株的選育、產(chǎn)酶影響因素及酶學(xué)性質(zhì)等方面[3-4]。發(fā)酵性絲孢酵母產(chǎn)油脂能力強(qiáng)，且具有較高的脂肪酶活性[5]，目前產(chǎn)酯酶方面的研究較少。研究酯酶的穩(wěn)定性有助于擴(kuò)大其應(yīng)用范圍并提高使用效率，目前對(duì)酯酶穩(wěn)定性的研究多集中在溫度、金屬離子、表面活性劑和有機(jī)溶劑對(duì)酯酶的影響等方面[6-8]。本研究以發(fā)酵性絲孢酵母所產(chǎn)胞壁酯酶為研究對(duì)象，探討了粗酶液中酯酶的熱穩(wěn)定性及貯存溫度、金屬離子、表面活性劑、有機(jī)化合物對(duì)粗酶液中酯酶穩(wěn)定性的影響，以期為開(kāi)發(fā)該菌的工業(yè)潛力提供相應(yīng)的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporonfermentans)CICC1368，購(gòu)自中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①固體斜面培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，蛋白胨1 g，瓊脂2 g，去離子水100 mL，pH自然；②液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨0.53 g，酵母膏0.2 g，尿素0.2 g，MgSO40.05 g，去離子水100 mL,pH自然；③發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨0.8 g，酵母膏0.5 g，KH2PO40.2 g，植物油1 mL，Tween-80 0.5 mL，去離子水100 mL，pH自然。以上培養(yǎng)基滅菌條件均為121 ℃，15 min。

1.1.3 主要試劑 葡萄糖，食用級(jí)；酵母浸粉、蛋白胨、牛血清蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)，生化試劑；尿素、固藍(lán)B鹽、甘油、糊精、阿拉伯膠粉，分析純；乙酸-α-萘酯、十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、Tween-40、Tween-80、TritonX-100、十六烷基三甲基溴化銨(Cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)、可溶性淀粉，化學(xué)純。

1.1.4 主要儀器 722S 分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，Eppendorf Centrifuge 5417R 高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf生物技術(shù)公司)，恒溫水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)，SK-1型快速混勻器(金壇市金城教學(xué)儀器廠)，超聲波細(xì)胞破碎儀JY99-2(寧波新芝科器研究所)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 ①菌種活化：將4 ℃冰箱保存的發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporonfermentans)CICC1368 菌種接于斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)48 h；②種子液培養(yǎng)：取2環(huán)活化菌株接入種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h；③發(fā)酵液培養(yǎng)：將種子液按10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)60 h。

1.2.2 粗酶液制備 發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min,收集菌體沉淀。用0.067 mol/L、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體，離心收集菌體沉淀，重復(fù)3次。取1 g濕菌體與25 mL磷酸鹽緩沖液(0.067 mol/L，pH 6.8)的混合液于冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎(超聲波功率400 W，總時(shí)間5 min，工作時(shí)間6 s，間隔5 s)，細(xì)胞破碎液離心后所得上清液即為粗酶液。

1.2.3 酯酶活力測(cè)定 采用乙酸-α-萘酯測(cè)定酯酶總活力[9]。1 g濕菌體破碎所得粗酶液在40 ℃、pH 6.8的條件下水解4%固藍(lán)B鹽溶液5 min，以每分鐘釋放1 mmol乙酸-α-萘酯為一個(gè)酶活力單位。

1.2.4 貯存溫度對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響 20 mL新鮮粗酶液分別置于0、4、10 ℃，24、48、60 h 后分別取樣測(cè)定殘余酶活力。以新鮮粗酶液作對(duì)照，酶活設(shè)為100%。

1.2.5 熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 20 mL新鮮粗酶液分別置于0～60 ℃(間隔10 ℃)水浴中保溫30 min，取樣測(cè)定殘余酶活力。以新鮮粗酶液作對(duì)照，酶活設(shè)為100%。

1.2.6 金屬離子對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響 將ZnSO4、CaSO4、MnSO4、CuSO4等金屬硫酸鹽溶液分別置于20 mL新鮮粗酶液中，使各金屬離子最終濃度為5 mmol/L。在4 ℃放置20 h后測(cè)定殘余酶活力。以新鮮粗酶液作對(duì)照，酶活設(shè)為100%。

1.2.7 表面活性劑對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響 將Tween-40、Tween-80、TritonX-100、SDS和CTAB 分別置于20 mL新鮮粗酶液中，使各表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%，于4 ℃放置20 h后測(cè)定殘余酶活力。以新鮮粗酶液作對(duì)照，酶活設(shè)為100%。

1.2.8 有機(jī)化合物對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響 將甘油、可溶性淀粉、糊精、牛血清蛋白、阿拉伯膠分別加入到20 mL粗酶液中，使各有機(jī)化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，于4 ℃放置20 h后測(cè)定殘余酶活力。以新鮮粗酶液作對(duì)照，酶活設(shè)為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯存溫度對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響

不同貯存條件下酯酶的相對(duì)活力見(jiàn)表1。由表1可知，相同溫度下，貯存時(shí)間越長(zhǎng)，酯酶相對(duì)活力越低；相同的貯存時(shí)間，溫度越高，酶相對(duì)活力越低。酯酶在0 ℃貯存24 h，相對(duì)活力仍可達(dá)到81.5%。該酶在10 ℃以下可短時(shí)間內(nèi)貯存。

表1 貯存溫度對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響

2.2 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

酯酶熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。發(fā)酵性絲孢酵母酯酶活力隨保存溫度的升高而降低，在0 ～10 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，能保持80%以上原酶活力。在20 ℃及以上酶活損失較多。有研究表明，酵母菌S9菌株的酯酶在30～40 ℃仍能保持較高的活性[3-4]，而本研究中發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporonfermentans) CICC1368的酯酶在40 ℃時(shí)便完全失活，熱穩(wěn)定性較差。

圖1 酯酶的熱穩(wěn)定性Fig.1 Thermal stability of esterase

2.3 金屬離子對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響

金屬離子作用酯酶的結(jié)果如圖2所示。金屬離子濃度為5 mmol/L時(shí)，Zn2+、Na+、Mg2+、Pb2+能使酯酶活力保持在原酶活力的70%以上，K+、Mn2+和Fe2+分別使酶活提高6.9%、1.4%、1.8%，Ca2+和Cu2+對(duì)酯酶抑制作用強(qiáng)烈，分別使酶活力降低90.7%和74.3%。有研究表明，5 mmol/L的Mg2+、Ca2+和Zn2+能有效促進(jìn)1株海洋細(xì)菌Est B酯酶的活性[7]，與本研究結(jié)果不一致，說(shuō)明酶活性中心對(duì)金屬離子促進(jìn)劑有選擇性。工業(yè)廢水中常含金屬離子，發(fā)酵性絲孢酵母的酯酶在濃度高達(dá)5 mmol/L的多種金屬離子溶液中穩(wěn)定性較好，而且該酵母可利用豆制品等工業(yè)廢水生長(zhǎng)[10]。因此，可進(jìn)一步研究將發(fā)酵性絲孢酵母及其酯酶應(yīng)用于工業(yè)廢水處理。

圖2 金屬離子對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of metal ions on esterase stability

2.4 表面活性劑對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響

表面活性劑作用酯酶的結(jié)果如圖3所示。質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的Tween-40和TritonX-100使酯酶活力保持在原酶活力的77%以上；1%的 Tween-80將酶活力提高了23.3%；1%的SDS和CTAB溶液使酯酶完全失去活性?？梢?jiàn)，酯酶在幾種非離子型表面活性劑中的穩(wěn)定性較好，其中Tween-80可顯著促進(jìn)酶活；而在兩種離子型表面活性劑中則完全失去活性。有研究表明，離子型表面活性劑對(duì)酯酶的活性影響較大，非離子型表面活性劑對(duì)酯酶影響較小[11]，本研究結(jié)果符合這一結(jié)論。酶在表面活性劑水溶液中具有較好的穩(wěn)定性是其能夠在洗滌劑領(lǐng)域中應(yīng)用的前提，發(fā)酵性絲孢酵母的酯酶在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的非離子型表面活性劑中穩(wěn)定性較好，特別是在Tween-80中酶活力明顯提高，可進(jìn)一步探討將這幾種表面活性劑與酯酶配合使用，以達(dá)到更好的去污效果。

圖3 表面活性劑對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of surfactants on esterase stability

2.5 有機(jī)化合物對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響

有機(jī)化合物作用酯酶的結(jié)果如圖4所示。質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的甘油、阿拉伯膠和糊精分別提高57%、29.6%和2%的酯酶活力；5%的可溶性淀粉和BSA抑制酶活，分別使酯酶活力降低20.4%和71.5%。甘油、阿拉伯膠和糊精均能提高溶液的黏度，增加酶蛋白表面的水化層，從而減少肽鏈之間的碰撞，避免酶分子聚集，起到提高酶穩(wěn)定性的作用[12-13]?？扇苄缘矸墼诶渌胁蝗芙猓置敢褐械牡矸垲w粒與酯酶蛋白分子相互碰撞，使酶空間構(gòu)象改變，酶活力降低[14]。BSA極大地破壞了粗酶液中酯酶的穩(wěn)定性，可作為酯酶抑制劑。甘油對(duì)酯酶穩(wěn)定性的保護(hù)作用顯著，且價(jià)格低廉，可用作保護(hù)劑保護(hù)酯酶的穩(wěn)定性。

圖4 有機(jī)化合物對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of organic compounds on esterase stability

3 討 論

本研究結(jié)果表明，貯藏條件為0 ℃、24 h時(shí)，發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporonfermentans) CICC1368酯酶的穩(wěn)定性較好。在40 ℃時(shí)完全失活，熱穩(wěn)定性較差。該酶宜在10 ℃以下短時(shí)保存。金屬離子濃度為5 mmol/L 時(shí)，在Ca2+和Cu2+溶液中酯酶活性受到強(qiáng)烈抑制，在K+、Mg2+和Fe2+等金屬離子溶液中穩(wěn)定性較好，可進(jìn)一步研究該酵母及其酯酶在污水治理方面的作用。在非離子型表面活性劑Tween-80、Tween-40和TritonX-100中酯酶的穩(wěn)定性較好，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% Tween-80中酶活明顯提高，說(shuō)明該酶在洗滌劑領(lǐng)域中具有應(yīng)用潛力；質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%甘油、阿拉伯膠和糊精可提高酶活，甘油的作用最顯著，是良好的酯酶保護(hù)劑；質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%可溶性淀粉和BSA顯著降低酶活力，BSA可作為酯酶抑制劑。

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Stabilities of Esterase from Fermentable Filamentous Spore Yeast (Trichosporon fermentans)

CHEN Yang-yang, ZHANG Xiao-feng, HOU Ying-min, SUN Yu-mei

(Coll.ofBio-Engin.,DalianPolytech.Uni.,Dalian116034)

The stabilities of esterase from cell wall of filamentous spore yeast (FSY) (Trichosporonfermentans) were studied in different physical and chemical conditions. The results showed that the esterase remained 81.5% of its initial activity after being stored at 0 ℃ for 24 h and became totally inactive at 40 ℃. K+, Mn2+and Fe2+at 5 mmol/L increased esterase activity by fewer than 6.9%. While Ca2+and Cu2+at 5 mmol/L reduced esterase activities by respectively 90.7% and 73.3%. The residual activity of esterase was kept at more than 77% of original activity in 1% (w/w) Tween-40 and TritonX-100, and increased by 23.3% in 1% (w/w) Tween-80. While in 1% (w/w) SDS (sodium dodecyl sulfate) and CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) totally inhibited the esterase activity. 5% (w/w) glycerol, Arabic gum, and dextrin could enhance esterase activity, and enhanced the esterase activity by respectively 57%, 29.6%, and 2%. 5% soluble starch and BSA (albumin from bovine serum) decreased esterase activity by respectively 20.43% and 71.5%. The FSY esterase should be stored below 10 ℃ due to its poor thermal stability. Glycerol had good protection effect on the esterase, while BSA had strong inhibition against the esterase. The esterase had potential application values to treat oleo-waste-water and to enhance washing effects of detergent.

Trichosporonfermentans; esterase; stability

遼寧省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目?jī)?yōu)秀人才培育專題 (2014026013)

陳洋洋 女，碩士研究生。研究方向?yàn)槲⑸锎x控制發(fā)酵。E-mail:sweetyznxm@sina.com

* 通訊作者。女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)槲⑸锎x控制發(fā)酵。Tel: 0411-86318692,E-mail:sunyumei62@163.com

2015-01-08；

2015-03-16

Q814.9

A

1005-7021(2015)05-0019-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.004