陳 娟， 史 輝， 王 瓊， 唐俊妮

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

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細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的類(lèi)型、檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用

陳 娟， 史 輝， 王 瓊， 唐俊妮*

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物是細(xì)菌代謝產(chǎn)物的重要組成部分，與細(xì)菌生命活動(dòng)和細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)量密切關(guān)聯(lián)，是細(xì)菌與周?chē)鞣N生物進(jìn)行交流的重要信息物質(zhì)。細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物類(lèi)型和特征表現(xiàn)復(fù)雜，其濃度低、種類(lèi)多，從極性到非極性跨度大，需要依賴(lài)特殊檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行分析測(cè)定。歸納了常見(jiàn)細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的類(lèi)型，介紹了氣相色譜-質(zhì)譜和電子鼻兩種檢測(cè)揮發(fā)性有機(jī)化合物的方法，例舉了細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物檢測(cè)在醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，并提出了細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物檢測(cè)研究中的幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。

細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物；類(lèi)型；檢測(cè)

細(xì)菌能夠利用周?chē)h(huán)境中的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)和脂肪等營(yíng)養(yǎng)成分，在不同酶的作用下生成葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等。這些物質(zhì)一方面進(jìn)行同化作用，合成細(xì)菌的結(jié)構(gòu)成分，另一方面則通過(guò)異化作用產(chǎn)生能量，同時(shí)生成一系列復(fù)雜的代謝產(chǎn)物，其中就包括醇類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)和酮類(lèi)等細(xì)菌揮發(fā)性有機(jī)化合物(bacterial volatile metabolites, BVMs)。相比其他生物如植物和真菌釋放的揮發(fā)性有機(jī)成分而言，BVMs具有更加復(fù)雜的特征，成為新天然成分的重要來(lái)源。BVMs是發(fā)散出的氣體，因此能夠被直接且快速地檢測(cè)到，為許多領(lǐng)域提供了一種理想的檢測(cè)手段。分析BVMs的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜、電子鼻、質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜和選擇離子流動(dòng)管質(zhì)譜等技術(shù)。本文針對(duì)BVMs的類(lèi)型、檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用和存在的問(wèn)題等方面進(jìn)行了綜述。

1 細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的類(lèi)型

很早以前，微生物學(xué)家就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到細(xì)菌能釋放特征性的揮發(fā)性產(chǎn)物。許多氣味早已被人們所熟知，并被視作干酪、泡菜、酸乳酪和酒類(lèi)等發(fā)酵食品的香氣成分。另外，許多腐敗有機(jī)質(zhì)的不良?xì)馕兑灿杉?xì)菌釋放。許多研究揭示了細(xì)菌具有產(chǎn)生大量揮發(fā)性物質(zhì)的強(qiáng)大能力[1-3]。例如，鏈霉菌就能產(chǎn)生多達(dá)80種不同的揮發(fā)性成分[4]。近年來(lái)，隨著分析測(cè)試技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)微生物揮發(fā)性物質(zhì)的定性和定量分析已取得了很大進(jìn)展。Schulz和Dickschat經(jīng)過(guò)巨大努力和對(duì)公開(kāi)數(shù)據(jù)的嚴(yán)格評(píng)判，總結(jié)了迄今為止所有已知的細(xì)菌揮發(fā)性成分：各種細(xì)菌共釋放346種可檢測(cè)成分，包括75種脂肪酸衍生物、50種芳香族化合物、74種含氮化合物、30種含硫化合物、96種萜類(lèi)化合物和18種鹵代物、硒、碲和其他非金屬化合物[2]。但是，大多數(shù)的揮發(fā)性成分還不能通過(guò)NIST-GC-MS譜庫(kù)或其他譜庫(kù)被準(zhǔn)確確認(rèn)，其結(jié)構(gòu)仍然有待進(jìn)一步被闡明。表1歸納了常見(jiàn)細(xì)菌揮發(fā)性代謝成分的類(lèi)型，一些化合物廣泛存在于各類(lèi)細(xì)菌釋放物中。盡管某些種或?qū)俚募?xì)菌被發(fā)現(xiàn)存在著交迭的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物類(lèi)型，但每個(gè)種或?qū)俚募?xì)菌都有著獨(dú)特的代謝方式，典型的揮發(fā)性成分和揮發(fā)性特征必定是種或?qū)偎赜械?，可以視為鑒別的生物標(biāo)志。目前，細(xì)菌揮發(fā)性成分已被匯編入公共數(shù)據(jù)庫(kù)http://bioinformatics.charite.de/mvoc[5]。

表1 常見(jiàn)細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物(BVMs)的類(lèi)型

續(xù)表1

注：SA:Staphylococcusaureus(金黃色葡萄球菌)； SP:Streptococcuspneumoniae(肺炎鏈球菌)； EF:Enterococcusfaecalis(糞腸球菌)；PA:Pseudomonasaeruginosa(綠膿桿菌或銅綠假單胞菌)； KP:Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯菌或克雷白氏桿菌)； EC:Escherichiacoli(大腸埃希菌)； MAP:Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis(鳥(niǎo)分枝桿菌副結(jié)核亞種)；Pseudomonas: 假單胞菌屬；Shewanella: 希瓦氏菌屬；Enterobacter: 腸桿菌屬；Klebsiella: 克雷伯菌屬；Staphylococcus: 葡萄球菌屬；Streptomyces: 鏈霉菌屬；Bacillus: 芽胞桿菌屬

2 細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的檢測(cè)技術(shù)

分析BVMs的方法目前主要有氣相色譜-質(zhì)譜、電子鼻、質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜、選擇離子流動(dòng)管質(zhì)譜和氣相色譜-嗅覺(jué)測(cè)量法等，但以氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)和電子鼻技術(shù)最常用。氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(Gas chromatography-Mass spectrum)集成了分離和檢測(cè)程序，能獲得細(xì)菌揮發(fā)性有機(jī)化合物的具體分析結(jié)果。電子鼻技術(shù)(Electronic nose)主要反映細(xì)菌揮發(fā)性有機(jī)化合物的整體特征。

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)

氣相色譜是一種優(yōu)異的分離技術(shù)，能出色的分離復(fù)雜混合物，尤其適合于低極性熱穩(wěn)定物質(zhì)的分析。離子化質(zhì)譜是一種能產(chǎn)生帶電荷的分子碎片并獲得其質(zhì)荷比的方式，有機(jī)小分子物質(zhì)經(jīng)離子化后形成復(fù)雜的具有重復(fù)性的質(zhì)荷比類(lèi)型，可以表征母體分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點(diǎn)[17]。氣相色譜與離子化質(zhì)譜的有機(jī)結(jié)合是一種分析揮發(fā)性化合物的傳統(tǒng)且經(jīng)典的技術(shù)，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和環(huán)境等研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。然而，氣相色譜-質(zhì)譜獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有時(shí)存在無(wú)規(guī)律性且不理想，在數(shù)據(jù)處理與分析時(shí)，如何從共流出圖譜中提取純物質(zhì)以及如何準(zhǔn)確定量化合物的強(qiáng)度是面臨的困難。目前，AMDIS是一種被廣泛采用和公開(kāi)討論的色譜峰解卷積方式，能在一定程度上解決這些難題[18]。另外，多維氣相色譜的發(fā)展大大改善了復(fù)雜細(xì)菌揮發(fā)性化合物的分離效果，使得從相應(yīng)揮發(fā)性特征提取潛在生物信息變得更加容易[19]。

2.2 電子鼻技術(shù)

除了經(jīng)典的化學(xué)分析方法以外，基于仿生學(xué)和電子學(xué)原理形成的電子鼻技術(shù)也成為了一種分析生物揮發(fā)性化合物的新方法。電子鼻是以一系列非特異性的氣敏性化學(xué)傳感器作為人造氣體感應(yīng)器，感應(yīng)器的類(lèi)型包括金屬氧化物、半導(dǎo)體聚合物、導(dǎo)體電活化聚合物、表面聲波和電化學(xué)氣體傳感器等。完整的電子鼻系統(tǒng)是由復(fù)合傳感器陣列、信息處理單元、類(lèi)型辨識(shí)運(yùn)算軟件和參考圖譜庫(kù)幾大要素構(gòu)成[20]。作為一種生物鼻的電子模擬系統(tǒng)，電子鼻在近幾年內(nèi)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種生物樣品揮發(fā)性特征的分析[21]。對(duì)于樣品的分析，電子鼻是以“香氣類(lèi)型”而不是“化學(xué)類(lèi)型”作為輸出結(jié)果，也就是說(shuō)電子鼻能對(duì)整體的生物揮發(fā)性特征作出響應(yīng)，但卻不能對(duì)每一個(gè)單獨(dú)的揮發(fā)性成分作出響應(yīng)。目前，電子鼻僅用于辨識(shí)或檢測(cè)一種揮發(fā)性成分或少數(shù)幾種揮發(fā)性成分的混合物。對(duì)于典型揮發(fā)性成分的確定或者復(fù)雜的實(shí)際生物揮發(fā)性成分體系的分析而言，GC-MS仍然是優(yōu)選方法。

3 細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用

鑒于細(xì)菌揮發(fā)性成分能被實(shí)時(shí)快速檢測(cè)的特點(diǎn)，為許多領(lǐng)域提供了無(wú)損檢測(cè)手段。如在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，細(xì)菌揮發(fā)性成分可以作為病原菌感染導(dǎo)致的疾病的前期診斷指標(biāo)。Khalid等以存在于口腔舌頭生物被膜微生物群中代表性的2種革蘭陽(yáng)性菌和2種革蘭陰性菌為對(duì)象，采用頂空固相微萃取方式富集目的細(xì)菌培養(yǎng)物產(chǎn)生的揮發(fā)性成分，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)。結(jié)果表明，口腔中厭氧微生物產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)十分重要，可以將呼出氣體作為身體系統(tǒng)疾病或代謝紊亂的判斷標(biāo)記[22]。Goeminne等以28位支氣管擴(kuò)張病人的口痰細(xì)菌培養(yǎng)物(銅綠假單胞菌)為對(duì)象，采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜(HS-SPME-GC-MS)測(cè)定其揮發(fā)性成分，通過(guò)建立模型對(duì)陽(yáng)性樣本和陰性樣本的預(yù)測(cè)值分別達(dá)到86%和100%，說(shuō)明對(duì)病人口痰細(xì)菌培養(yǎng)物揮發(fā)性成分的測(cè)定方式可以作為一種慢性肺部感染的快速且早期的篩選方法[23]。然而，這些研究都還處于實(shí)驗(yàn)探索階段，將揮發(fā)性成分檢測(cè)技術(shù)直接應(yīng)用于人體疾病的診斷還有許多方面需要考慮，例如由于炎癥反應(yīng)造成的病人主體與感染細(xì)菌之間的相互作用必然會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)性代謝產(chǎn)物的改變；在人體器官自然定殖的細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生相似的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物以干擾目標(biāo)致病菌的檢測(cè)[6]。在食品研究領(lǐng)域，食品營(yíng)養(yǎng)成分豐富，容易受到微生物污染，從而引起腐敗變質(zhì)和食用不安全性。污染微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生特定的揮發(fā)性氣味物質(zhì)，基于此可利用氣味特征來(lái)檢測(cè)食品中的污染微生物。Horváth等[24]利用電子鼻分析了不同溫度下豬肉排骨的細(xì)菌數(shù)量。Balasubramanian等[25]運(yùn)用電子鼻檢測(cè)了20 ℃接種鼠傷寒沙門(mén)氏菌后的牛肉氣味變化。Abdallah 等[26]采用電子鼻對(duì)新鮮牛肉和臘腸的細(xì)菌數(shù)量以及分別接種大腸埃希菌O157∶H7、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的新鮮牛肉和臘腸的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行了分析。通過(guò)將電子鼻檢測(cè)到的氣味物質(zhì)濃度與細(xì)菌數(shù)量相關(guān)聯(lián)，可以預(yù)測(cè)食品基質(zhì)上細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。另一方面，金偉平等[27]運(yùn)用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)單增李斯特菌不同污染程度的冷藏牛肉所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了分析。Jaffrès等[28]采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)污染了熱殺索絲菌和肉桿菌的煮熟去皮蝦仁的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了分析。Holm等[29]也采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)污染了熱殺索絲菌和肉桿菌的干臘腸的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了分析。但目前這些研究并沒(méi)有將檢測(cè)到的污染細(xì)菌的氣味物質(zhì)與細(xì)菌數(shù)量相關(guān)聯(lián)。探索污染細(xì)菌的氣味標(biāo)記物和氣味特征，并建立與細(xì)菌生長(zhǎng)的關(guān)系是今后工作的重點(diǎn)。氣體感應(yīng)技術(shù)能有效地用于食品質(zhì)量控制，但目前該方法還是不能完全替代參考方法——感官評(píng)價(jià)法。隨著技術(shù)設(shè)計(jì)和操作的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展，氣體感應(yīng)技術(shù)將在食品污染監(jiān)測(cè)和控制領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

4 細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物檢測(cè)存在的問(wèn)題

通過(guò)文獻(xiàn)分析，認(rèn)為目前BVMs檢測(cè)技術(shù)研究中有以下3個(gè)核心但又棘手的問(wèn)題需要解決：①同種但不同分離源的菌株之間BVMs信號(hào)的種類(lèi)和強(qiáng)度是否存在差異？Kunze等以大腸埃希菌和銅綠假單胞桿菌臨床隨機(jī)分離菌株為研究對(duì)象，表明同種但不同分離源的菌株之間，BVMs信號(hào)種類(lèi)和強(qiáng)度變化沒(méi)有差異[30]，但對(duì)于其他分離源的細(xì)菌菌株而言，是否具有相似的結(jié)論有待進(jìn)一步研究。目前，正在針對(duì)已分離得到不同食品源的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌菌株，通過(guò)檢測(cè)這些菌株的BVMs以探索同種但不同分離源的菌株之間BVMs的變化。②能否實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌固體培養(yǎng)物VOCs的檢測(cè)？相比液體培養(yǎng)基而言，微生物在固體培養(yǎng)基中呈現(xiàn)的生長(zhǎng)階段和代謝特征不明顯，更難獲取。Jünger等[31]分析了大腸埃希菌在內(nèi)的15種病原菌在哥倫比亞血瓊脂平板上的VOCs類(lèi)型，根據(jù)檢測(cè)的VOCs類(lèi)型可以成功區(qū)分15種目標(biāo)菌。那么，在食品科學(xué)領(lǐng)域，能否通過(guò)檢測(cè)實(shí)際固態(tài)樣品的揮發(fā)性產(chǎn)物來(lái)判斷樣品受到何種微生物污染以及受污染程度？結(jié)合我們的研究，通過(guò)采用頂空固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)豬肉樣品上生長(zhǎng)的大腸埃希菌O157∶H7的BVMs進(jìn)行直接檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮、3-甲基-1-丁醇和吲哚等大腸埃希菌穩(wěn)定的揮發(fā)性成分，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了三十碳六烯和三甲胺等獨(dú)特的揮發(fā)性成分，推測(cè)這些成分可以作為大腸埃希菌O157∶H7在豬肉中生長(zhǎng)的氣味標(biāo)記物，未來(lái)還需要做更深入的研究。③細(xì)菌產(chǎn)生的BVMs與基質(zhì)中細(xì)菌數(shù)量的關(guān)系如何？Bunge 等[3]通過(guò)對(duì)大腸埃希菌和腸炎沙門(mén)氏菌各自釋放的特異揮發(fā)性產(chǎn)物進(jìn)行了在線(xiàn)檢測(cè)，闡明了2種細(xì)菌各自特征的揮發(fā)性釋放類(lèi)型。Maddula等[32]分析了大腸埃希菌在培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)特征，建立了大腸埃希菌的生物量與頂空代謝物濃度之間的動(dòng)態(tài)相關(guān)性。Kunze等[30]對(duì)大腸埃希菌的培養(yǎng)物進(jìn)行了代謝產(chǎn)物隨生長(zhǎng)的變化研究。采用頂空固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)物不同生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)取樣分析，可初步揭示揮發(fā)性代謝成分產(chǎn)生的時(shí)序特征，為進(jìn)一步回答這個(gè)問(wèn)題奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，在今后的研究中應(yīng)該圍繞上述3個(gè)問(wèn)題進(jìn)行全面且系統(tǒng)的探索，這些問(wèn)題的解決將進(jìn)一步揭示細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的釋放信息以及與細(xì)菌生長(zhǎng)的相關(guān)性，使得細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物檢測(cè)技術(shù)成為一種實(shí)際有效的無(wú)損檢測(cè)方法。同時(shí)，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的新的微生物源性揮發(fā)性化合物。

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Categories, Detection Techniques and Applications of Bacterial Volatile Metabolites

CHEN Juan, SHI Hui, WANG Qiong, TANG Jun-ni

(Coll.ofLifeSci. &Technol.,SWUni.forNationalities,Chengdu610041)

Bacterial volatile metabolites (BVMs) are important components of metabolites of bacteria, and closely associate with bacterial life activities and their growing amount, they are important information substances for bacteria to communicate with the surrounding various organisms. Categories and characteristic features of BVMs are complicated, it needs and depends special techniques to analyze and test them, because they are in low concentration, large categories, and having great span from polarity to non-polarity. In this paper the category of common BVMs was summed up, and introduced gas chromatography-mass spectrum and electronic nose these two methods for determining volatile organic compounds, exemplified the potential applications of BVMs detection in medical and food research fields, and proposed some crucial problems in BVMs detection study.

bacterial volatile metabolites (BVMs)；category； detection

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371781)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET-11-0847)

陳娟 女，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師。主要從事食品微生物與食品安全方面研究。E-mail：chenj1221@126.com

* 通訊作者。女，博士(后)，副研究員。研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail:Junneytang@aliyun.com

2014-05-30；

2014-06-25

Q935

A

1005-7021(2015)01-0089-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.017