陳 羽， 徐 威

(沈陽藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

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苯扎溴銨與艾葉水提物的協(xié)同殺菌效果

陳 羽， 徐 威*

(沈陽藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

采用懸液定量殺菌試驗，對苯扎溴銨與艾葉水提物的協(xié)同殺菌效果進行了實驗室研究。研究發(fā)現(xiàn)，0.1%苯扎溴銨與艾葉水提物混合溶液對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、白假絲酵母菌和黑曲霉均呈現(xiàn)出顯著的協(xié)同殺菌作用。結(jié)果表明，苯扎溴銨與艾葉水提物具有良好的協(xié)同殺菌效果。

苯扎溴銨；艾葉；懸液定量殺菌試驗；協(xié)同殺菌

苯扎溴銨(商品名:新潔爾滅)是一種季胺鹽類陽離子表面活性劑，其溶液無色、無臭，有輕微刺激性，能吸附于細(xì)菌表面，改變胞壁通透性，使菌體內(nèi)的酶、輔酶和代謝中間產(chǎn)物逸出，呈現(xiàn)殺菌作用。苯扎溴銨對許多芽胞型致病菌、革蘭陽性菌及霉菌具有很強的廣譜殺菌作用，但對革蘭陰性桿菌及腸道病毒作用卻較弱[1]。艾葉系菊科植物艾(ArtemisiaargyiLevl. et Vant)的干燥葉，外用具有治療皮膚瘙癢的功效。文獻報道[2], 艾葉水煎液具有抗細(xì)菌和真菌作用, 尤其是對引起婦科陰道炎癥的葡萄球菌、銅綠假單胞菌等具有顯著的抑制作用。本文對苯扎溴銨與艾葉水提物的協(xié)同殺菌效果進行了實驗室研究，為藥廠合理開發(fā)新型中藥與化學(xué)藥復(fù)配消毒劑新產(chǎn)品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)、大腸埃希菌(EscherichiacoliATCC 8099)、枯草芽胞桿菌(BacillussubtilisATCC 9372)、白假絲酵母菌(CanidiaalbicansATCC 10231)和黑曲霉(AspergilliusnigerATCC 16404)由沈陽藥科大學(xué)微生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)教研室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，氯化鈉5.0；營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基：在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入瓊脂粉14.0；沙堡瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖40.0，蛋白胨10.0，瓊脂粉14.0。

1.1.3 緩沖液(g/L) 磷酸鹽緩沖液：無水磷酸氫二鈉2.83，磷酸二氫鉀1.36，pH 7.2；中和劑：硫代硫酸鈉2.0，溶解于磷酸鹽緩沖液中，起中和消毒劑的殺菌作用。

1.1.4 消毒液的制備 取0.1 g苯扎溴銨(沈陽紅旗制藥有限公司)，用無菌蒸餾水定容至100 mL，即0.1%苯扎溴銨消毒液。取艾葉(安徽亳州華夏藥業(yè)有限公司)200 g, 加適量水煎煮3次, 煎煮時間分別為60、40和20 min，用8層紗布過濾, 合并濾液, 濃縮至500 mL，即艾葉水提液。取0.1 g苯扎溴銨，用艾葉水提液定容至100 mL，即復(fù)合消毒劑。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 試驗菌為S.aureusATCC 6538、E.coliATCC 8099和C.albicansATCC 10231。取磷酸鹽緩沖液5.0 mL加入新鮮斜面培養(yǎng)物試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。用移液管將洗液移至另一無菌試管中，用渦旋混合器振蕩20 s，使菌體懸浮均勻。初步制成的菌懸液，先用比濁測定法測其含菌量，然后用磷酸鹽緩沖液稀釋至1×1011～5×1011cfu/L。菌懸液在使用時，應(yīng)先進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。

實際澆筑過程中采用分層澆筑的方式，采用機械震搗手段完成，震搗過程中震搗儀的移動間距要適宜，搗震的過程中不得觸碰相關(guān)的設(shè)備，如預(yù)埋件、鋼筋等，采用不同的振搗方法，混凝土的澆筑厚度有所不同，具體如下：采用插入式震動，澆筑層厚度為振搗器作用部分長度的1.25倍；如果是表面震動，無筋或配筋稀疏結(jié)構(gòu)的澆筑層厚度為25cm，配筋較密結(jié)構(gòu)的澆筑層厚度為15cm；附著式震動的澆筑層厚度為30cm；入工搗固的澆筑層厚度為20cm

1.2.2 中和劑的考察試驗 以S.aureusATCC 6538為試驗菌，按懸液定量殺菌試驗程序進行[3]。設(shè)平行6組試驗，即：a組為消毒液+菌懸液；b組為(消毒液+菌懸液)+中和劑；c組為中和劑+菌懸液； d組為(消毒液+中和劑)+菌懸液；e組為磷酸鹽緩沖液+菌懸液(正常菌對照)；f組為磷酸鹽緩沖液+中和劑+培養(yǎng)基(陰性對照)。中和劑及其濃度的判定標(biāo)準(zhǔn)：a組不長菌或僅有極少數(shù)菌落生長；b組有菌落生長，較a組為多，但較c、d、e組為少；c、d、e組菌落數(shù)分別在1×108～5×109cfu/L內(nèi)，且組間菌落數(shù)誤差率不應(yīng)超過15%；f組無菌生長。借此可判定所選中和劑及其濃度是否適宜。

1.2.3 芽胞懸液的制備 取已經(jīng)活化3代的B.subtilisATCC 9372營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物3 mL，接種于羅氏瓶中營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)8 d。采用孔雀綠法進行芽胞染色鏡檢。當(dāng)芽胞形成率達95%以上時，即可進行懸液的制備。用無菌水30 mL輕輕推刮下菌苔，集中于一含玻璃珠的無菌三角瓶中，振搖30 min，分散培養(yǎng)物，使成均勻的懸液。將盛裝上述懸液的三角瓶置于45 ℃水浴中24 h，使菌自溶斷鏈，分散成單個芽胞。最后，將三角瓶放于80 ℃水浴中10 min，以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體，待冷至室溫后，即為芽胞懸液。

1.2.4 黑曲霉孢子懸液的制備 用接種環(huán)劃線接種A.nigerATCC 16404于沙堡斜面培養(yǎng)基上，置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。吸取0.05%吐溫-80水溶液4 mL置于斜面表面, 刮洗分生孢子，將孢子懸液移入裝有玻璃珠的三角瓶中，輕輕振搖30 min后，用脫脂棉花濾過除去菌絲體即為孢子懸液。

1.2.5 懸液定量殺菌試驗 將裝有5 mL消毒液的試管置于20 ℃水浴中5 min，再加入0.1 mL菌懸液，混勻，作用至規(guī)定時間(2、5、10、20 min)。取混和液0.5 mL，移入含有4.5 mL中和劑溶液的試管中，混勻，中和作用10 min。取0.1 mL涂平板，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，活菌計數(shù)。以內(nèi)裝5 mL標(biāo)準(zhǔn)硬水的試管同步操作所得活菌數(shù)為基準(zhǔn)，計算殺菌率。

1.2.6 評價指標(biāo) 協(xié)同系數(shù)(T/E)=各因子單獨作用時微生物存活百分率乘積/多因子共同作用實測微生物存活百分率(其中，存活率為0時，按0.000 1%計算)。

T/E值為判斷復(fù)合增效作用強弱的標(biāo)準(zhǔn)。T/E值小于1為拮抗作用，等于1為相加作用，大于1為增效作用，其值越大，增效作用越強[4]。

1.2.7 模擬現(xiàn)場試驗 選擇木質(zhì)桌面，在桌面上劃定5 cm×5 cm范圍的4個不同區(qū)域，分別標(biāo)記為基準(zhǔn)區(qū)、苯扎溴銨區(qū)、艾葉提取物區(qū)和復(fù)合消毒劑區(qū)。以涂抹法污染E.coliATCC 8099懸液(菌數(shù)為1×107cfu/L)，待自然干燥后進行試驗。消毒前，將無菌棉拭于5 mL磷酸鹽緩沖液試管中沾濕，以涂抹法在基準(zhǔn)區(qū)采樣作基準(zhǔn)；將0.1%苯扎溴銨、艾葉提取物及復(fù)合消毒劑分別均勻噴涂在各自所屬區(qū)域，作用10 min，以同樣方法消毒后采樣。分別將消毒前后采樣棉拭采樣端剪入5 mL中和劑試管內(nèi),活菌計數(shù)，觀察殺菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 中和劑的考察

表1 消毒劑的中和劑試驗結(jié)果

2.2 對金黃色葡萄球菌的協(xié)同殺菌作用

復(fù)合消毒劑對S.aureusATCC 6538的協(xié)同殺菌能力較苯扎溴銨和艾葉單獨作用時強(表2)。經(jīng)計算，復(fù)合消毒劑作用2 min時，T/E值為327.04，起到了顯著的增效作用。

表2 對金黃色葡萄球菌的殺滅效果

2.3 對大腸埃希菌的協(xié)同殺菌作用

復(fù)合消毒劑對E.coliATCC 8099的協(xié)同殺菌能力較苯扎溴銨和艾葉單獨作用時強(表3)。經(jīng)計算，復(fù)合消毒劑作用2 min時，T/E值為11 307.44，起到了顯著的增效作用。

表3 對大腸埃希菌的殺滅效果

2.4 對枯草芽胞桿菌的協(xié)同殺菌作用

復(fù)合消毒劑對B.subtilisATCC 9372的協(xié)同殺菌能力較苯扎溴銨和艾葉單獨作用時強(表4)。經(jīng)計算，復(fù)合消毒劑作用2 min時，T/E值為4.23，起到了顯著的增效作用。

表4 對枯草芽胞桿菌的殺滅效果

2.5 對白假絲酵母菌的協(xié)同殺菌作用

復(fù)合消毒劑對C.albicansATCC 10231的協(xié)同殺菌能力較苯扎溴銨和艾葉單獨作用時強(表5)。經(jīng)計算，復(fù)合消毒劑作用2 min時，T/E值為3 723.85，起到了顯著的增效作用。

表5 對白假絲酵母菌的殺滅效果

2.6 對黑曲霉的協(xié)同殺菌作用

復(fù)合消毒劑對A.nigerATCC 16404的協(xié)同殺菌能力較苯扎溴銨和艾葉單獨作用時強(表6)。經(jīng)計算，復(fù)合消毒劑作用2 min時，T/E值為3 436.4，起到了顯著的增效作用。

表6 對黑曲霉的殺滅效果

2.7 模擬現(xiàn)場試驗

用苯扎溴銨、艾葉水提物以及復(fù)合消毒劑進行模擬現(xiàn)場試驗。試驗結(jié)果表明：苯扎溴銨、艾葉水提物及復(fù)合消毒劑對E.coli8099懸液作用10 min，殺菌率分別為95.44%、91.46%和100%。說明該復(fù)合消毒劑具有明顯的協(xié)同殺菌優(yōu)勢，為藥廠開發(fā)新型艾葉復(fù)配消毒劑提供理論依據(jù)。

3 討 論

目前生產(chǎn)、生活中使用的消毒劑主要是化學(xué)消毒劑，因其不同程度地存在藥物殘留、污染環(huán)境、產(chǎn)生抗藥性等副作用，從而限制了它們的應(yīng)用。從消毒劑發(fā)展趨勢看，研制殺菌力強，抗菌譜廣，對人毒副作用小，腐蝕性小，價格低廉的新型消毒劑仍然是今后的主攻方向。中草藥消毒劑對環(huán)境無污染、無刺激性、無副作用，氣味芳香，用來部分替代化學(xué)消毒劑，符合研制和開發(fā)環(huán)保新型消毒劑的發(fā)展趨勢[5]。

本研究采用懸液定量殺菌試驗，以協(xié)同系數(shù)T/E值作為評價指標(biāo)，對苯扎溴銨與艾葉水提物的協(xié)同殺菌效果進行了實驗室研究。結(jié)果表明，0.1%苯扎溴銨+艾葉水提物復(fù)合消毒劑協(xié)同作用可以克服單一消毒劑存在的不足，對某些細(xì)菌(S.aureusATCC 6538、E.coliATCC 8099和B.subtilisATCC 9372)、某些酵母菌和曲霉菌(C.albicansATCC 10231、A.nigerATCC 16404)均起到了顯著的協(xié)同殺菌效果，為將來合理開發(fā)新型艾葉復(fù)配類消毒產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

[1] 雒曉芳，董開忠，王冬梅，等.新潔爾滅對三種細(xì)菌的抑菌效果研究[J].西北民族大學(xué)學(xué)報，2009，30(1)：64-66.

[2] 劉萍，劉巍，袁銘.艾葉和復(fù)方艾葉水提液體外抗菌作用比較[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，26(5)：484-485.

[3] 衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司.消毒技術(shù)規(guī)范[S].北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，2002：9-200.

[4] 聶紹發(fā),朱貴寶,林天暉,等.新潔爾滅與戊二醛協(xié)同殺菌作用的實驗研究[J].同濟醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001，30(1)：50-52.

[5] 王金和，邊傳周，金登宇, 等.中草藥消毒劑殺菌效果的研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(11)：227-230.

Synergic Germicidal Efficacy of Bromogeramine and Aqueous Extract of Moxa Leaf

CHEN Yu， XU Wei

(Schl.ofLifeSci. &Biopharm.,ShenyangPharm.Univ.,Shenyang110016)

The synergic germicidal efficacy of bromogeramine combined with moxa leaf (Artemisiaargyi) aqueous extract was studied in laboratory. It was found that bromogeramine (0.1%) combined withArtemisiaargyiaqueous extract had obviously synergetic germicidal efficacy againstStaphyloccocusaureusATCC 6538,EscherichiacoliATCC 8099,BacillussubtilisATCC 9372,CandidaalbicansATCC 10231, andAspergilliusnigerATCC 16404. The results showed that bromogeramine combined withArtemisiaargyiaqueous extract had good synergetic germicidal efficacy.

bromogeramine; moxa leaf (Artemisiaargyi); suspension quantitative germicidal test; synergic germicidal efficacy

陳羽 男，碩士，講師。主要從事微生物制藥及消毒劑的殺菌消毒研究。E-mail:chenyu0208303@126.com

*通訊作者。女，博士，教授。主要從事微生物制藥及微生物轉(zhuǎn)化生物活性物質(zhì)的研究。E-mail:gzweishengwu@126.com

2013-12-18；

2013-12-25

Q815

B

1005-7021(2015)01-0109-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.021