劉全永， 楊 銘， 王書錦

(1.商丘職業(yè)技術學院，河南 商丘 476005；2.中國科學院 沈陽應用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016)

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海洋分離芽胞桿菌抗白念珠菌活性物質的理化性質及類別

劉全永1,2， 楊 銘1， 王書錦2

(1.商丘職業(yè)技術學院，河南 商丘 476005；2.中國科學院 沈陽應用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016)

為尋找新型抗真菌活性物質，采用管碟法對7株分離自海洋的芽胞桿菌在不同NaCl濃度下產生抗白念珠菌活性物質特性、活性物質的耐熱性及不同pH值條件下的活性進行了比較，八大溶劑系統(tǒng)紙層析法對活性物質的類別進行了初步鑒定。結果表明，隨著NaCl濃度的變化產生活性物質的量也在變化，NaCl濃度達7%時均不能產生，但在正常海洋環(huán)境鹽濃度(NaCl含量2%～3%)下都產生；活性物質有很強的耐熱性和耐酸堿性，說明其較穩(wěn)定；7株菌產生的抗白念珠菌活性物質均為堿性水溶性抗生素。由于目前臨床上抑制人體病原真菌活性物質絕大多數為脂溶性，因而這些芽胞桿菌產生的抗白念珠活性物質有可能為新型物質，此外本研究結果為這些菌株所產生活性物質的分離純化提供了依據。

海洋芽胞桿菌；白念珠菌；抗真菌；生物活性物質

尋找新型抗真菌活性物質一直是研究熱點[1-11]。海洋細菌可以產生多種不同作用的生物活性物質[12-23]，但對于其抗白念珠菌(Candidaalbicans)的報道卻很少見。從我國近海海域不同地區(qū)采集的海水樣品中，篩選到了7株對白念珠菌有較強抗性的芽胞桿菌[23]，將其中1株定名為凝結芽胞桿菌黑石礁亞種(Bacilluscoagulanssubsp.heishijiaosis)[24]。由于從自然界中篩選的野生微生物菌株產生活性物質的量往往很低，且發(fā)酵液中雜質含量很高，要將活性物質從中分離出來，往往需要酸堿沉淀除雜、加熱濃縮、溶媒萃取等多種預處理，這要求活性物質具有較強的穩(wěn)定性；此外，活性物質的水溶性強弱及離子特性對于采用何種分離提取手段起到重要的參考作用，因而理化性質的研究是新型活性物質篩選過程中關鍵的步驟[26]。鑒于目前已知的抗真菌天然產物均為脂溶性的特點，通過理化性質特別其溶媒萃取特征及其八大層析系統(tǒng)圖譜特征可以判斷活性物質的大致類別，并為活性物質的進一步分離純化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供試菌株為本試驗室自行分離篩選得到的7株抗白念珠菌活性較強的芽胞桿菌，分別編號為LU-B13(分自于三亞南天一柱海水樣品)；LU-B35(分自于三亞大東海水樣1)；LU-421、LU-4B1和LU-4B2(分自于三亞大東海水樣2)；LU-101(分自于青島棧橋水樣)、LU-B02(分自于大連黑石礁水樣)。LU-B02為凝結芽胞桿菌，LU-B13屬蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)，其余各菌株為短小芽胞桿菌(Bacilliuspumilus)，靶子菌為白念珠菌(Candidaalbicans)，由吉林大學醫(yī)學院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 LU-B35、LU-421、LU-4B1、LU-4B2、LU-101活性物質發(fā)酵培養(yǎng)基為抗白念珠菌1號培養(yǎng)基(葡萄糖4 g，蛋白胨1 g，NaCl 1%，水100 mL，0.8 Pa滅菌20 min)；LU-B13、LU-B02活性物質發(fā)酵培養(yǎng)基為抗白念珠菌2號培養(yǎng)基(葡萄糖2 g，蛋白胨0.3 g，酵母膏0.8 g，水100 mL，0.8 Pa滅菌20 min)，靶子菌培養(yǎng)基為沙氏培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 海洋分離芽胞桿菌活性物質耐鹽性的比較 配制NaCl濃度為0、1%、3%、5%、7%的抗白念珠菌1號液體培養(yǎng)基和抗白念珠菌2號液體培養(yǎng)基(20 mL/150 mL)，將各試驗菌種按5%的接種量分別接入搖瓶，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h(其中LU-B35培養(yǎng)32 h)，3 500 r/min離心去沉淀，沙氏平板上管碟法測定發(fā)酵液對白念珠菌的抑菌活性。

1.2.2 海洋分離芽胞桿菌活性物質的耐熱性 配制抗白念珠菌1號液體培養(yǎng)基和抗白念珠菌2號液體培養(yǎng)基(20 mL/150 mL)，將各試驗菌種按5%的接種量分別接入搖瓶，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h(其中LU-B35培養(yǎng)32 h)，3 500 r/min離心去沉淀，發(fā)酵液分別經水浴70 ℃處理30 min或121 ℃處理20 min后，于沙氏平板上管碟法測定發(fā)酵液對白念珠菌的抑菌活性。

1.2.3 海洋分離芽胞桿菌活性物質的耐酸堿性 配制抗白念珠菌1號液體培養(yǎng)基和抗白念珠菌2號液體培養(yǎng)基(20 mL/150 mL)，將各試驗菌種按5%的接種量分別接入搖瓶，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h(其中LU-B35培養(yǎng)32 h)，3 500 r/min離心去沉淀，發(fā)酵液分別以HCl和NaOH調pH至2、4、6、8、10、12，于沙氏平板上管碟法測定發(fā)酵液對白念珠菌的抑菌活性。

1.2.4 海洋分離芽胞桿菌活性物質的溶媒萃取特征 配制抗白念珠菌1號液體培養(yǎng)基和抗白念珠菌2號液體培養(yǎng)基(20 mL/150 mL)，將各試驗菌種按5%的接種量分別接入搖瓶，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h(其中LU-B35培養(yǎng)32 h)，3 500 r/min離心去沉淀，發(fā)酵液依次以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次，于沙氏平板上管碟法測定水相及各有機溶媒相對白念珠菌的抑菌活性。

1.2.5 海洋分離芽胞桿菌活性物質的八大溶劑系統(tǒng)紙層析[26]配制抗白念珠菌1號液體培養(yǎng)基和抗白念珠菌2號液體培養(yǎng)基(20 mL/150 mL)，將各試驗菌種按5%的接種量分別接入搖瓶，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h(其中LU-B35培養(yǎng)32 h)。3 500 r/min離心去沉淀，上清液用毛細玻璃管于16 cm×2 cm的濾紙條上點樣3次，于八大溶劑系統(tǒng)中進行層析。待溶劑上升至終點取出濾紙條，晾干后貼于涂有白念珠菌的沙氏培養(yǎng)基上20 min，使活性物質轉移到培養(yǎng)基表面，28 ℃下培養(yǎng)過夜，觀察記錄抑菌部位，計算Rf值。

2 結果與分析

2.1 海洋分離芽胞桿菌不同鹽濃度下發(fā)酵產生活性物質

海洋細菌產生次級代謝產物的能力往往與培養(yǎng)基中NaCl含量有關。圖1顯示7株芽胞桿菌在不同NaCl濃度的培養(yǎng)基中產生抗真菌活性物質的情況，從總體上看，在不含NaCl的培養(yǎng)基中均能很好地產生活性物質，在NaCl濃度為7%時皆不能產生抗真菌活性物質。同時NaCl濃度對7株菌產生活性物質的影響程度存在著一定的差異， 3% NaCl濃度下，除LU-101外，其他6株菌均能產生活性物質；5% NaCl濃度下，只有LU-B35和LU-B02能產生活性物質。說明NaCl濃度對LU-101的影響最為明顯，當NaCl濃度僅為1%時沒有活性；對NaCl濃度最不敏感的是LU-B35和LU-B02，它們在NaCl濃度5%以下時均能較好產生活性物質。由于海水NaCl濃度2%～3%，因而除LU-101外，其余6株菌在海水環(huán)境鹽濃度下培養(yǎng)均保持一定的抗真菌活性。

圖1 海洋分離芽胞桿菌活性物質的耐鹽性Fig.1 Salinity tolerance of bioactive substances by marine-derived bacilli

2.2 海洋分離芽胞桿菌活性物質的耐熱性

7株芽胞桿菌產生的抗白念珠菌活性物質的熱穩(wěn)定性如圖2所示。7株菌產生的活性物質經70 ℃處理30 min或121 ℃處理20 min后與處理前比較，活性均可保持原有活性約90%以上，說明它們產生的活性物質分子結構及抗真菌活性在高溫下穩(wěn)定。

圖2 海洋分離芽胞桿菌活性物質耐熱性Fig.2 Heat stability of bioactive substances of marine-derived bacillii

2.3 海洋分離芽胞桿菌活性物質的耐酸堿性

7株芽胞桿菌產生的抗白念珠菌活性物質的耐酸堿性如圖3所示。7株菌產生的抗真菌活性物質在pH 2～12的條件下均顯示出較強的活性，即具有較強的耐酸堿性，但也表現出一定的差異。LU-B13、LU-4B1、LU-4B2、LU-B02產生的活性物質活性在不同pH值下最為穩(wěn)定，經酸堿處理后，活性略有上升或不變；LU-B35、LU-421、LU-101產生的活性物質在酸性條件下比堿性條件下更為穩(wěn)定，LU-421在pH 12時活性損失較明顯。

圖3 海洋分離芽胞桿菌抗真菌活性物質的耐酸堿性Fig.3 Marine-derived bacilli bio-active substances pH stability

2.4 海洋分離芽胞桿菌活性物質的溶媒萃取特征

各菌株產生的活性物質依次經氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等有機溶媒萃取后，各相抗白念珠菌活性如圖4所示。從總體上看，7株海洋芽胞桿菌產生的抗真菌活性物質均具有強極性組分存在，其中LU-4B1和LU-4B2的氯仿萃取液均顯示一定的活性，LU-B13活性物質只存在于水相，表明LU-B13產生的活性物質極性最強，其余幾株菌的活性物質還存在于正丁醇相，LU-B35、LU-101產生的抗真菌活性物質在正丁醇相和水相的活性基本相同。

圖4 有機溶媒萃取后各相活性Fig.4 Bio-activity of substances in each

2.5 海洋分離芽胞桿菌活性物質的初步鑒定結果分析

由于各類抗生素的酸堿性、極性和溶解度的不同，根據它們在八大溶劑系統(tǒng)中呈現出來的Rf值繪制的曲線圖譜，可將它們歸屬為6個大類，分別為堿性水溶性抗生素、大環(huán)內酯類抗生素、四環(huán)素類抗生素、多烯類抗生素、非水溶性I型抗生素、非水溶性II型抗生素。

各菌株產生的活性物質經八大溶劑系統(tǒng)紙層析后，Rf值曲線如圖5所示?？梢钥闯觯?株海洋芽胞桿菌產生的活性物質在溶劑系統(tǒng)5和6中的Rf值明顯較大。在溶劑系統(tǒng)5中的Rf值界于0.99～1.0之間，在溶劑系統(tǒng)6中的Rf值界于0.85～0.98之間；在其他溶劑系統(tǒng)中移動較小，尤其是在溶劑系統(tǒng)7中全部不移動，在溶劑系統(tǒng)1中移動的Rf值界于0.06～0.22之間 。與抗生素八大溶劑系統(tǒng)標準層析圖譜相比，它們均屬堿性水溶性類抗生素，這與其有機溶媒萃取特征相一致。此外，在溶劑系統(tǒng)4中所有菌株產生的活性物質均不顯跡，可能是由于該溶劑系統(tǒng)所含六氫吡啶對活性物質造成活性焠滅的緣故。試驗表明，所有7株海洋芽胞桿菌產生的活性物質經八大溶劑系統(tǒng)層析并顯跡后都只有一個顯樣點出現，說明其主要活性物質組分為單一組份或結構性質相近的堿性水溶性物質，LU-4B1和LU-4B2產生的活性物質中非水溶性組分未出現顯跡，可能是由于其所占比例過低，且點樣量小所造成的。

圖5 八大溶劑系統(tǒng)層析圖譜Fig.5 Paper chromatography of bioactive substances

3 討 論

前期對7株抗白念珠菌的海洋芽胞桿菌的生理生化特征研究已知，除LU-B02外，其他6株菌耐鹽度達10%以上。本研究結果表明，當NaCl濃度達7%時，它們均不能產生抗真菌活性物質，說明隨著海水中鹽度的變化，這些菌產生活性物質的特性也在發(fā)生變化，但在正常的海洋環(huán)境中(NaCl含量2%～3%)，都有產生抗白念珠菌活性的能力。此外，雖然這7株菌最高生長溫度都在50 ℃以下，但它們產生的活性物質卻表現出很強的耐熱性和耐酸堿性，說明其活性物質的穩(wěn)定性較強。

目前抗人體病原真菌活性物質絕大多數為脂溶性，只有極少數抗生素如經結構改造后才具有較好的水溶性，尋找水溶性的抗人體病原真菌的天然活性物質是當前抗真菌藥物篩選工作的重點之一，八大溶劑系統(tǒng)紙層析結果顯示7菌株產生的抗白念珠菌活性均為堿性水溶性抗生素。 此前對7株芽胞桿菌鑒定的結果可知，LU-B02為凝結芽胞桿菌黑石礁亞種(Candidacoagulanssubsp.heishijiaosis)，而迄今尚無該菌抗白念珠菌等人體病原真菌的報道，因而由LU-B02產生的堿性水溶性活性物質很可能是一種新型活性產物，這有待于進一步研究證實。

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Physico-Chemical Characters & Classification of Anti-Candida Bioactive Substances Produced by 7 Marine-DerivedBacillusStrains

LIU Quan-yong1, 2, YANG Ming1, WANG Shu-jin2

(1.ShangqiuVocat'l&Tech.Inst.,Shangqiu476005; 2.ShenyangInst.ofAppl.Ecol.,CAS,Shenyang110016)

In order to search for new type of anti-fungal bioactive substances, method of tube plate was adopted to compare the features of 7 marine-isolatedBacillusstrains producing anti-candida bioactive substances at different NaCl concentrations and their thermal resistance and under the condition of different pH value activity. Eight major solvent system of paper chromatography to initially identify the category of active substances was carried out. The result showed that with the variation of NaCl concentration the amount of the bioactive substances produced by theBacillusstrains also varied, all theBacillusstrains cannot produce anti-candida substances when NaCl was as high as 7%, however, they all could produce bioactive substances under normal sea circumstances saline concentration (NaCl content at 2%～3%); the active substances had strong heat and acid-alkaline resistances, suggesting they are fairly stable. The anti-candida active substances produced by 7 strains were all alkaline and water soluble antibiotics. Due to the current clinically inhibiting human pathogenic fungi active substances mostly are lipid-soluble; therefore, these active substances of anti-candida may have the possibility to be a new type of substance that could resistCandidaalbicans. Moreover, the results of this study had provided a foundation to isolate and purify the production of the active substances by these strains.

marine-isolated bacilli;Candidaalbicans; anti-fungal; bioactive substances

國家科技支撐計劃項目(2011BAE06B04-03)

劉全永 男，博士，副教授。主要從事微生物資源與應用研究。Tel：0370-3182188，E-mail: liuqy710@sina.com

2014-11-12；

2015-02-18

Q938.2

A

1005-7021(2015)01-0019-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.004