紀昌濤， 周 瀟， 陳 奇， 宋永相， 黃洪波， 王 博， 鞠建華*

(1.中國科學(xué)院 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，中國科學(xué)院 海洋微生物研究中心，廣東省海洋藥物重點實驗室，中國科學(xué)院 南海海洋研究所，廣東 廣州 510301；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224)

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2株海洋來源產(chǎn)淺藍霉素A的異壁放線菌的分離和鑒定

紀昌濤1,2， 周 瀟3， 陳 奇1,2， 宋永相1， 黃洪波1， 王 博1， 鞠建華1*

(1.中國科學(xué)院 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，中國科學(xué)院 海洋微生物研究中心，廣東省海洋藥物重點實驗室，中國科學(xué)院 南海海洋研究所，廣東 廣州 510301；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224)

利用抗菌及鹵蟲致死活性模型，從中國南海海底沉積物來源的微生物中篩選到2株放線菌SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63，其發(fā)酵產(chǎn)物具有較強活性，經(jīng)16S rRNA基因序列分析這2株放線菌均為異壁放線菌Actinoalloteichussp.。HPLC-DAD分析顯示2株放線菌能產(chǎn)生同一個主要的次級代謝產(chǎn)物，通過正相硅膠柱色譜、反相中壓柱色譜、半制備高效液相色譜等手段，從SCSIO WJ01的發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得了該化合物，運用ESI-MS、1H及13C NMR波譜分析鑒定為淺藍霉素A(Caerulomycin A)。此外，還從SCSIO WJ01的發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了淺藍霉素D。

海洋放線菌；異壁放線菌屬；淺藍霉素；聯(lián)吡啶

天然產(chǎn)物來源的藥物在抗感染、抗腫瘤等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[1]。根據(jù)對1981～2010年新批準的藥物的統(tǒng)計，抗感染領(lǐng)域直接或間接以天然產(chǎn)物為來源的藥物所占比例高達77.4%；而在抗腫瘤領(lǐng)域，1940～2010年間上市的藥物中直接或間接來源于天然產(chǎn)物的藥物占79%[2]。相對于合成的化學(xué)分子實體，天然產(chǎn)物具有許多先天優(yōu)勢，如化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣、易于衍生，更多的手性中心，更多的氧而非氮、硫、鹵素原子，芳香環(huán)原子比例低，更易形成氫鍵，成藥性好等[3]。在挖掘微生物活性天然產(chǎn)物的研究中，陸生微生物資源經(jīng)歷了近一個世紀的篩選和開發(fā)，雖仍是人們努力的方向，但從中發(fā)現(xiàn)新的菌種資源和新的抗生素已顯得日益困難。因此，人們把目光投向占地球表面70%以上的海洋。海洋具有高壓、高鹽、寡營養(yǎng)、低光照、低溫等極端環(huán)境[4-5]，棲息在此特殊環(huán)境中的海洋微生物進化出獨特的代謝途徑，有產(chǎn)生活性顯著、結(jié)構(gòu)多樣的次級代謝產(chǎn)物的可能。中國南海蘊藏著豐富的有待開發(fā)的微生物資源，近年來課題組從中國南海篩選、發(fā)現(xiàn)了許多能產(chǎn)生獨特次級代謝產(chǎn)物的藥用放線菌資源，如能產(chǎn)具有抗瘧原蟲作用的吲哚生物堿Marinacarbolines A-D及抗菌、抗腫瘤的環(huán)肽Marthiapeptide A[6-8]的MarinactinosporathermotoleransSCSIO 00652[9]，產(chǎn)細胞毒活性角環(huán)素Grincamycins的StreptomyceslusitanusSCSIO LR32[10]，產(chǎn)抗感染活性環(huán)肽Marformycins的StreptomycesdrozdowicziiSCSIO 10141[11]等。

圖1 淺藍霉素A和D的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of caerwlomycin A and D

本研究對來源于南海海底沉積物的放線菌進行抗菌及鹵蟲致死活性篩選，發(fā)現(xiàn)2株放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物有鹵蟲致死活性、抗大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌的活性，經(jīng)16S rRNA基因序列分析，這2株放線菌為異壁放線菌屬Actinoalloteichussp. SCSIO WJ01和Actinoalloteichussp. SCSIO ZJ63；經(jīng)高效液相色譜(HPLC-DAD)對2株放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)這2株菌都能產(chǎn)生一個相同的主要次級代謝產(chǎn)物，為聯(lián)吡啶類化合物淺藍霉素A(圖1)。據(jù)文獻報道，淺藍霉素A具有顯著的抗菌活性和很強的免疫抑制活性[12-14]。另外，還從SCSIO WJ01的發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了淺藍霉素D。本文報道這2株海洋放線菌及其次級代謝產(chǎn)物淺藍霉素的分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株SCSIO WJ01分離自中國南海(E116°12.155′′，N22°17.985′′)50 m海底沉積物樣品，菌株SCSIO ZJ63分離自中國南海(E120°0.250′′，N22°22.971′′)3 536 m海底沉積物樣品，菌種保存于中國科學(xué)院海洋微生物研究中心(廣州)。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均用M-AM2ab培養(yǎng)基。配方(g/100 mL)：豆粉0.5，酵母粉0.5，可溶性淀粉2，細菌學(xué)蛋白胨0.2，海鹽3，碳酸鈣0.2，pH 7.4，121 ℃滅菌30 min備用。

1.1.3 儀器及試劑 Bruker AVANCE DRX 500核磁共振儀(500/125 MHz，TMS為內(nèi)標)，Bruker amaZon SL離子肼質(zhì)譜儀，Varian ProStar 210和Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀，中壓制備層析系統(tǒng)EZ Purifier III(上海利穗化工科技有限公司)；硅膠薄層層析板(HSGF254)和柱層析用硅膠(100～200目)均為煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司產(chǎn)品，反相中壓柱填料為YMC GEL ODS-A(75 μm)，半制備色譜柱為YMC-Pack ODS-A(250 mm×10 mm，5 μm)；色譜純乙腈(安徽時聯(lián))，氘代甲醇、DMSO(CIL)，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 放線菌SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63的分離、16S rRNA基因序列分析 ①菌株分離和培養(yǎng)：無菌條件下取約5 g海底沉積物泥樣加入20 mL滅菌水中(含30 g/L海鹽+少許玻璃珠)，輕輕混勻，60 ℃水浴10 min，冷卻至室溫，30 ℃環(huán)境下200 r/min震蕩30 min，梯度稀釋后吸取200 μL樣品涂平板(含50 μg/mL制霉菌素)，30 ℃環(huán)境下靜置培養(yǎng)20～30 d，定期觀察。根據(jù)生長情況不斷轉(zhuǎn)接至新的平板，直至分離到單克隆放線菌株。②16S rRNA基因序列的PCR擴增、測序：用細菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3′)和1492R(5′-ACGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。50 μL PCR反應(yīng)體系：DNA模板0.5 μL，5×PCR Buffer 10.0 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L)4 μL，27F(10 μmol/L)2 μL，1492R(10 μmol/L)2 μL，F(xiàn)astPfu高保真酶(5 U/μL)0.5 μL，DMSO 2 μL，補充dd H2O至50 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min；4 ℃保溫。1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠，用凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，加A尾純化后連接到pCR 2.1載體并轉(zhuǎn)入E.coliDH5α，經(jīng)PCR驗證和質(zhì)粒酶切驗證后，選3個質(zhì)粒送深圳華大公司測序。③系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：放線菌SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63的16S rRNA基因序列分別通過BLAST在線分析，獲取同源性較高的菌株信息后，下載到本地通過Mega5自帶的ClustalW進行多序列比對，系統(tǒng)發(fā)育樹使用鄰接法(Neighbor-Joining，Kimura 2)構(gòu)建。

1.2.2 放線菌SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63菌株的發(fā)酵培養(yǎng) 種子液用250 mL錐形瓶，每瓶加入50 mL培養(yǎng)基，從平板上接入適量菌種，于28 ℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)36 h后分別轉(zhuǎn)接于1 L錐形瓶，每瓶含200 mL培養(yǎng)基，于28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)7 d。

1.2.3 放線菌SCSIO WJ01發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離 發(fā)酵產(chǎn)物(6 L)于4 000 r/min離心10 min，分離得到上清液和菌絲體部分，上清液經(jīng)丁酮萃取后減壓濃縮，菌絲體用丙酮浸提后減壓濃縮，通過HPLC分析后合并上清液和菌絲體提取物得到總浸膏17 g。采用正相柱層析，氯仿-甲醇梯度(V(氯仿)∶V(甲醇)分別為100∶0、98∶2、96∶4、94∶6、92∶8、90∶10、8∶2、5∶5)洗脫共得到8個組分Fr.1～8。活性追蹤顯示Fr.3～4為活性組分，進一步經(jīng)過中壓反相柱層析，甲醇-水梯度(V(甲醇)∶V(水)為0∶100～100∶0)洗脫得到亞組分Fr.A-1～A-13，通過TLC驗證合并后對其中Fr.A-5～A-8進行常壓正相柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)分別為7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7)洗脫，通過TLC檢測后，主要組分以半制備HPLC(乙腈-水35%～95%線性洗脫30 min，流速2.5 mL/min)在tR16 min得到化合物1(75 mg)，在tR17.5 min得到化合物2(7 mg)。

1.2.4 放線菌SCSIO ZJ63發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離 發(fā)酵產(chǎn)物(4 L)于4 000 r/min離心10 min，分離得到上清液和菌絲體部分，上清液經(jīng)丁酮萃取后減壓濃縮得到浸膏A；菌絲體用丙酮浸提得到浸膏B，通過HPLC分析后合并A和B得到總浸膏15 g。采用正相柱層析，氯仿-甲醇梯度(V(氯仿)∶V(甲醇)分別為100∶0、98∶2、96∶4、94∶6、92∶8、90∶10、8:2、5∶5)洗脫共得到8個組份Fr.1～8?；钚宰粉欙@示Fr.3～4為活性組分，進一步經(jīng)過正向柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)分別為8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8)洗脫得到亞組分Fr.B-1～B-8，HPLC結(jié)合活性追蹤顯示Fr.B-4為活性組分，以中壓制備MPLC(甲醇-水10%～80%線性洗脫60 min，流速8 mL/min)在tR21.5 min得到化合物1(80 mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63菌株鑒定

16S rRNA基因序列分析表明SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63與藍灰異壁放線菌Actinoalloteichuscyanogriseus和斯比提異壁放線菌ActinoalloteichusspitiensisRMV-1378T相似性較高，在99.49%和99.92%之間，故菌株SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63為異壁放線菌屬成員，根據(jù)鄰接法(Neighbor-Joining，Kimura 2)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)與最大似然法(Maximum likelihood)等構(gòu)樹結(jié)果一致。因此，SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63應(yīng)為藍灰異壁放線菌A.cyanogriseus或斯比提異壁放線菌A.spitiensis的菌株，現(xiàn)保藏于中國科學(xué)院海洋微生物研究中心，其菌落特征如圖3所示。

2.2 SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析

SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63菌株發(fā)酵液50 mL，用等體積丁酮萃取，蒸干丁酮，殘渣溶解于1 mL甲醇中，分別取20 μL樣品進行HPLC分析，結(jié)果顯示SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63在相同的保留時間tR10.8 min處，均有一個UV吸收相同的化合物，即隨后鑒定的淺藍霉素A，如圖4所示。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63分子系統(tǒng)進化樹Fig.2 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequences showing relationship between strain SCSIO WJ01, SCSIO ZJ63 and closely related members of genus Actinoalloteichus

圖3 SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63菌落特征Fig.3 Colonies characteristics SCSIO WJ01 and SCSIO ZJ63

2.3 化合物1和2的結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 化合物1 白色粉末，ESI-MS(+)給出準分子離子峰m/z230.1[M+H]+，252.1[ M+Na]+，提示其分子量為229，結(jié)合氫譜和碳譜信息推測其分子式為C12H11N3O2，不飽和度為9。1H NMR高場區(qū)有一個甲氧基的質(zhì)子信號，低場區(qū)有6個耦合的芳香氫信號，根據(jù)其耦合常數(shù)可分為兩組：δH7.90(d,J=2.0 Hz)和7.32(d,J=2.0 Hz)；8.68(d,J=7.5 Hz)、8.38(d,J=7.0 Hz)、7.94(dd,J=7.5,7.0 Hz)及7.45(dd,J=7.5,7.5 Hz)，結(jié)合碳譜中的芳碳信號，以及分子中存在氮原子，提示分子中存在2個芳環(huán)體系，推測為吡啶環(huán)，占用10個芳碳；剩余的一個芳碳信號，結(jié)合1H NMR在低場區(qū)存在一個單峰芳香質(zhì)子信號δH8.15(s)，以及一個活潑質(zhì)子信號δH11.73(1H，s)，推斷分子中存在醛肟的結(jié)構(gòu)單元。經(jīng)查閱文獻[15] ，確定化合物1為淺藍霉素A。

ESI-MS(+) (m/z):230.1[M+H]+,252.1[M+Na]+,1H NMR(DMSO-d6,500 MHz) δ:11.73(1H,s,7-N-OH),8.68(1H,d,J=7.5 Hz,H-6′),8-38(1H,d,J=7.0 Hz,H-3′),8.15(1H,s,H-7),7.94(1H,dd,J=7.5, 7.0 Hz,H-4′),7.90(1H,d,J=2.0 Hz,H-3),7.45(1H,dd,J=7.5,7.0 Hz,H-5′),7.32(1H,d,J=2.0 Hz,H-5),3.94(3H,s,4-OMe);13C NMR(DMSO-d6,125 MHz) δ:166.5(C-4),156.8(C-2),154.4(C-2′),153.3(C-6),149.1(C-6′),148.7(C-7),137.2(C-4′),124.4(C-5′),120.7(C-3′),106.4(C-3),105.5(C-5),55.5(4-OMe)。

圖4 菌株SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63產(chǎn)生淺藍霉素的HPLC分析Fig.4 HPLC analysis of the caerulomycin A from the culture extracts of SCSIO WJ01 and SCSIO ZJ63

2.3.2 化合物2 白色粉末，(+)ESI-MS給出準分子離子峰m/z404.0[M+H]+，提示其分子量為403，根據(jù)氫譜和碳譜信息推測其分子式為C19H21N3O7，不飽和度為11。與化合物1相比，1H NMR譜顯示少一個芳香質(zhì)子信號，而在δH5.27～3.17區(qū)域多出4個連氧質(zhì)子信號，以及1個甲氧基質(zhì)子信號，在高場區(qū)δH1.39(d，J=6.2 Hz)多出一個連次甲基的甲基質(zhì)子信號。13C NMR譜的19個碳信號中，芳香區(qū)有與1相似的11個碳信號，另外還存在6個連氧碳、2個甲氧基以及1個甲基碳信號。與文獻[16] 對照，數(shù)據(jù)基本一致，故確定其為淺藍霉素D。

(+)ESI-MSm/z404.0 [M+H]+，426.4 [M+Na]+；1H NMR(CD3OD,500 MHz) δ:8.65(1H,d,J=7.5 Hz,H-6′),8.15(1H,s,H-12),7.95(1H,d,J=7.5 Hz,H-3′),7.91(1H,dd,J=7.5,7.0 Hz,H-4′),7.50(1H,s,H-6),7.43(1H,dd,J=7.5,7.0 Hz,H-5′),5.47(1H,s,H-10a),3.94(1H,dq,J=12.4,6.2 Hz,H-2),3.83(1H,d,J=8.5 Hz,H-4),3.58(3H,s,3-OMe),3.47(3H,s,4a-OMe),3.17(1H,t,J=8.5 Hz,H-3),1.39(3H,d,J=6.2 Hz,H-11);13C NMR(CD3OD,125 MHz) δ:154.5(C-2′),150.1(C-9),149.2(C-6′),149.1(C-12),147.6(C-7),146.3(C-5a),137.9(C-4′),137.7(C-9a),125.8(C-3′),124.5(C-5′),109.4(C-6),97.2(C-4a),92.4(C-10a),84.1(C-3),71.3(C-2),70.9(C-4),61.1(3-OMe),51.3(4a-OMe),17.9(C-11)。

3 討 論

淺藍霉素A最早是由Funk等[14]于1959年從Streptomycescaeruleus(2008年Tamura等[17]重分類為Actinoalloteichuscyanogriseus)的發(fā)酵液中分離得到，由Divekar等[18]于1966年確定其結(jié)構(gòu)。隨后，人們相繼分離鑒定了淺藍霉素B-K等系列化合物。該類化合物有抗真菌，抗細菌活性[14]，植物細胞毒活性[13]，倉鼠、大鼠和人腫瘤細胞毒性[19-21]，免疫抑制等[12]廣泛的生物活性。淺藍霉素A的免疫抑制活性尤其引人關(guān)注，相對于免疫抑制劑環(huán)孢菌素、他克莫司、雷帕霉素，淺藍霉素A能更加有效地抑制白細胞增殖[12]。本研究從中國南海海底沉積物中分離篩選得到的2株異壁放線菌SCSIO WJ01和SCSIO ZJ63，均產(chǎn)淺藍霉素A，其中菌株SCSIO ZJ63的產(chǎn)率達到20 mg/L，為通過誘變育種和代謝工程改造進一步提高其產(chǎn)量，或通過生物合成技術(shù)改造其結(jié)構(gòu)提供了寶貴的菌種資源。

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Isolation and Identification of Two Marine-Originated Actinoalloteichus sp. Producing Caerulomycin A

JI Chang-tao1, 2, ZHOU Xiao3, CHEN Qi1, 2, SONG Yong-xiang1,HUANG Hong-bo1,WANG Bo1, JU Jian-hua1

(1.CASKeyLab.ofTrop'lMarineBio-Res. &Ecol.,GuangdongKeyLab.ofMarineMateriaMedica,RNAMCtr.forMarineMicrobiol.,S.ChinaSeaInst.ofOceanol.,ChinaAcad.ofSci.,Guangzhou510301; 2.Uni.ofChinaAcad.ofSci.,Beijing, 110049; 3.SWForestryUni.Kunming, 650224)

Two marine-originated actinobacteria strains SCSIO WJ01 and SCSIO ZJ63 isolated and screened from sediments collected in the bottom of South China Sea, using antibiotic and lethal activities model against brine shrimp (Artemiasalina), their fermentation broths possessed fairly strong activity. These two strains were identified asActinoalloteichussp. through 16S rRNA gene sequence analysis. HPLC-DAD analysis disclosed that strains SCSIO WJ01 and SCSIO ZJ63 could produce the same major secondary metabolite. These fermentation products were isolated from the fermentation extract of strain SCSIO WJ01 by means of ortho-phase silica gel column chromatography and counter-phase mid-pressure column chromatography, and semi-preparative HPLC etc and identified to be caerulomycin A using ESI-MS,1H and13C NMR spectroscopic analyses. In addition, caerulomycin D was also isolated and identified from fermentation product of strain SCSIO WJ01.

marine Actinomycetes;Actinoalloteichus; caerulomycin; dipyridines

國家自然科學(xué)青年基金項目(41106138，41206135)；中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程青年人才領(lǐng)域前沿項目(SQ201119)

紀昌濤 男，碩士。研究方向為海洋微生物天然產(chǎn)物及其生物合成。Tel: 020-89108627，E-mail：jichangtao1988@163.com

* 通訊作者。男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師。研究方向為海洋微生物天然產(chǎn)物及其生物合成。Tel: 020-89023028，E-mail：jju@scsio.ac.cn

2014-05-06；

2014-06-03

Q93

A

1005-7021(2015)01-0024-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.005