卡介苗(BCG)感染對(duì)U937細(xì)胞系蛋白質(zhì)乙?；降挠绊?/h1>
2015-12-26 08:16羅恩杰
微生物學(xué)雜志 2015年1期
李 苗， 羅恩杰
(中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)
?
卡介苗(BCG)感染對(duì)U937細(xì)胞系蛋白質(zhì)乙酰化水平的影響
李 苗， 羅恩杰*
(中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)
研究卡介苗(BCG)感染對(duì)U937細(xì)胞系蛋白質(zhì)乙?；降挠绊?。構(gòu)建U937巨噬細(xì)胞模型，感染BCG后提取細(xì)胞總蛋白，western blot方法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白乙?；降母淖儭＝Y(jié)果表明，在分化成熟的U937細(xì)胞系中，BCG感染能夠上調(diào)蛋白質(zhì)乙?；剑鸨碛^遺傳學(xué)的改變。
卡介苗(BCG)；U937；乙酰化
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染引起的慢性傳染病，其發(fā)病率和死亡率均居重大傳染病前列，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命。Mtb是典型的胞內(nèi)寄生菌，在感染早期主要寄生在肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)，感染晚期主要寄生在肺巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞內(nèi)[1-2]。因此，體內(nèi)的單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)既是抵抗結(jié)核分枝桿菌感染的第一道防線，也是最關(guān)鍵的一道防線[3]。近年來關(guān)于病原體感染宿主細(xì)胞，引起表觀遺傳學(xué)的改變，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的研究成為人們探討感染性疾病病因?qū)W的又一新興策略[4]。在眾多表觀遺傳調(diào)控機(jī)制中，蛋白質(zhì)的乙?；l(fā)揮著尤為重要的作用[5-6]。本研究以卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)，一種活的減毒牛型結(jié)核分支桿菌疫苗為刺激因素，檢測(cè)在分化成熟的巨噬細(xì)胞U937中蛋白質(zhì)乙?；降淖兓瑥亩鵀殛U明結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和細(xì)胞 BCG(沈陽市疾控中心提供)，人淋巴瘤單核細(xì)胞系U937(來自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)。
1.1.2 試劑 RBMI-1640培養(yǎng)基(invitrogen coropration 31800-022)，氟波酯PMA(Sigma Aldrich，美國(guó))，小鼠抗乙?；嚢彼峥贵w(santa cruz，美國(guó))，小鼠β-actin抗體(Cell Signaling Technology，美國(guó))。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分化 用含10%胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)液培養(yǎng)U937細(xì)胞，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞；無抗生素培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至106個(gè)；轉(zhuǎn)種至4塊6孔板，每孔加入PMA 100 ng/mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育。48 h后觀察細(xì)胞貼壁。去上清，加入無PMA完全培養(yǎng)基； 制備BCG懸液，按照BCG(MOI=1∶10)，刺激4 h。
1.2.2 抗酸染色法 用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2～3滴，在火焰高處徐徐加熱3～5 min，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗，3%鹽酸酒精脫色30 s，用水沖洗后用堿性美蘭溶液復(fù)染1 min，水洗，用吸水紙吸干后油鏡觀察。
1.2.3 Western blot印跡雜交 收集細(xì)胞，預(yù)冷的1×PBS洗2次，2 500 r/min，離心5 min。加入100 μL單去污裂解液(含PMSF)，冰上裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清。每孔準(zhǔn)備100 μg蛋白，加上樣緩沖液煮沸5 min。上樣至SDS聚丙烯酰胺凝膠中，100 V電泳約1.5 h。取出凝膠，于轉(zhuǎn)印液中平衡30 min。4 ℃、40 V電轉(zhuǎn)印過夜至PVDF膜。取出PVDF膜，1×PBS洗2～3 min，室溫封閉2 h。應(yīng)用特異性小鼠抗乙酰化賴氨酸抗體(1∶500稀釋)或β-actin(1∶1 000稀釋)，為一抗雜交2 h，加入1∶2 000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，室溫雜交2 h。ECL顯色，成像。
2 結(jié)果與分析
2.1 巨噬細(xì)胞模型的建立
人單核細(xì)胞系U937細(xì)胞正常狀態(tài)下懸浮生長(zhǎng)，鏡下觀察細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞透亮(圖1)。經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化的U937細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化(圖2)，細(xì)胞發(fā)生貼壁，體積增大，呈團(tuán)狀聚集。
2.2 BCG感染分化成熟的U937細(xì)胞
以BCG(MOI=1∶10)感染分化成熟的U937細(xì)胞，抗酸染色法顯示BCG進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，見圖3。
2.3 U937細(xì)胞蛋白質(zhì)乙酰化水平的變化
BCG感染分化成熟U937細(xì)胞，提取感染后的總蛋白，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)感染后總蛋白乙?；礁哂趯?duì)照組(圖4)。
圖1 U937細(xì)胞的正常生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.1 The normal U937 cells
圖2 U937細(xì)胞被PMA誘導(dǎo)分化后的形態(tài)Fig.2 The U937 cells differentiate into macrophage-like cells after a PMA treatment
圖3 BCG感染U937細(xì)胞Fig.3 BCG infection of U937cells 抗酸染色法，箭頭所示為BCGthe acid-fast staining method, an arrow shown in BCG
圖4 BCG感染對(duì)細(xì)胞總蛋白乙?；降挠绊慒ig.4 Effect of BCG infection on the level of protein acetylation
3 討 論
細(xì)菌與宿主細(xì)胞以及機(jī)體的相互作用關(guān)系決定了細(xì)菌感染和致病的分子基礎(chǔ)。越來越多的研究表明，細(xì)菌感染能夠引起細(xì)胞的組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑，從而改變宿主的轉(zhuǎn)錄程序。在眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方式中，乙?；l(fā)揮著重要作用。共有兩類酶參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)乙?；癄顟B(tài)，即組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase, HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDACs)。HATs催化乙酰輔酶A的乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移至組蛋白及一些轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的特定賴氨酸殘基，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子與DNA的親和力及轉(zhuǎn)錄活性的改變，從而調(diào)控基因表達(dá)水平[7]。HDAC在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)乙酰化中的作用與HAT相反。這兩類酶的平衡對(duì)維持蛋白質(zhì)的正常乙?；街陵P(guān)重要。
單核-巨噬細(xì)胞包括存在于血液中的單核細(xì)胞和組織中的巨噬細(xì)胞。單核細(xì)胞在血液中僅存留數(shù)小時(shí)至數(shù)日，然后移行至全身各組織并發(fā)育成熟為巨噬細(xì)胞。分枝桿菌進(jìn)入機(jī)體后，可通過主動(dòng)和被動(dòng)兩種機(jī)制定位于巨噬細(xì)胞中。在自然感染狀態(tài)下，作為機(jī)體第一道防線的巨噬細(xì)胞會(huì)主動(dòng)對(duì)進(jìn)入的分枝桿菌進(jìn)行吞噬。本實(shí)驗(yàn)采用U937作為細(xì)胞模型。U937來源于人的原始單核細(xì)胞，屬于前單核細(xì)胞，以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。用PMA誘導(dǎo)分化后，可以觀察到細(xì)胞貼壁，并聚集成串，表示已成為成熟的巨噬細(xì)胞模型[8-9]。
應(yīng)用BCG作為刺激因素，檢測(cè)U937細(xì)胞中蛋白質(zhì)的乙酰化水平。結(jié)果提示，BCG感染能夠上調(diào)總蛋白乙?；?。在結(jié)核桿菌感染過程中，乙酰化水平的改變可能會(huì)導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)水平的改變，從而影響結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展，并且將為闡明結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制，預(yù)防和綜合控制結(jié)核病的傳播提供新思路。
[1] Humphreys IR, Stewart GR, Turner DJ, et al.A role for dendritic cells in the dissemination of mycobacterial infection[J].Microbes Infect,2006,8(5): 1339-1346.
[2] Wolf AJ, Linas B, Trevejo-Nunez GJ, et al. Mycobacterium tuberculosis infects dendritic cells with high frequency and impairs their functioninvivo[J].J Immunol, 2007,179(4):2509-2519.
[3] Tsolaki AG. Innate immune recognition in tubereulosis infection[J].Adv Exp Med Biol,2009,653:185-197.
[4] Hamon MA, Cossart P. Histone Modifications and Chromatin Remodeling during Bacteria Infections[J]. Cell Host & Microbe,2008,4(2):100-109.
[5] Timmermann S, Lehrmann H, Polesskaya A, et al. Histone acetylation and disease[J]. Cell Mol Life Sci., 2001,58(5-6):728-736.
[6] Li M, Zhao Y, Li Y, et al. Upregulation of human with-no-lysine kinase-4 gene expression by GATA-1 acetylation[J].Int J Biochem Cell Biol,2009 ,41(4):872-878. Epub 2008 Aug 27.
[7] Chen L, Fischle W, Verdin E,et al. Duration of Nuclear NF-B Action Regulated by Reversible Acetylation[J].Science,2001,293:1653-1657.
[8] Kim SJ. Leptin potentiates prevotella intermedia lipopolysaeeharide-induced production of TNF-alpha in monocyte- derived macrophages[J].J Periodontal Implant Sci,2010,40:119-124.
[9] Mureith MW，Chang JJ，Lifson JD，et al. Exposure to HIV-1-encoded Toll-like receptor 8 ligands enhances monocyte response to microbial encoded Toll-like receptor 2/4 ligands[J].AIDS,2010,24:1841-1848.
The Effect of BCG Infection on the Level of Protein Acetylation in U937 Cell Lines
LI Miao, LUO En-jie
(Teach. &Res.Div.ofPathog.Biol.,Coll.ofBasicMed.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110001)
The effect of BCG infection on protein acetylation level in U937 cell lines was studied. U937 macrophage model was constructed, and then total cellular protein was extracted after infected with BCG. Western blot was used to detect the changes of total protein acetylation level.The results showed that the BCG infection upregulated the protein acetylation level in matured differentiated U937 cells, and caused in epigenetic changes.
BCG; U937; acetylation
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81201333)
李苗 女，講師，博士。研究方向?yàn)楦腥拘约膊〉谋碛^遺傳學(xué)。E-mail:sendtolm@126.com
* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)榀懺x的感染與免疫。E-mail：enjieluo@hotmail.com
2014-03-27；
2014-04-08
Q939.93； R379.91+1
A
1005-7021(2015)01-0046-03
10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.009
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李 苗， 羅恩杰
(中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)
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卡介苗(BCG)感染對(duì)U937細(xì)胞系蛋白質(zhì)乙酰化水平的影響
李 苗， 羅恩杰*
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1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分化 用含10%胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)液培養(yǎng)U937細(xì)胞，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞；無抗生素培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至106個(gè)；轉(zhuǎn)種至4塊6孔板，每孔加入PMA 100 ng/mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育。48 h后觀察細(xì)胞貼壁。去上清，加入無PMA完全培養(yǎng)基； 制備BCG懸液，按照BCG(MOI=1∶10)，刺激4 h。
1.2.2 抗酸染色法 用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2～3滴，在火焰高處徐徐加熱3～5 min，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗，3%鹽酸酒精脫色30 s，用水沖洗后用堿性美蘭溶液復(fù)染1 min，水洗，用吸水紙吸干后油鏡觀察。
1.2.3 Western blot印跡雜交 收集細(xì)胞，預(yù)冷的1×PBS洗2次，2 500 r/min，離心5 min。加入100 μL單去污裂解液(含PMSF)，冰上裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清。每孔準(zhǔn)備100 μg蛋白，加上樣緩沖液煮沸5 min。上樣至SDS聚丙烯酰胺凝膠中，100 V電泳約1.5 h。取出凝膠，于轉(zhuǎn)印液中平衡30 min。4 ℃、40 V電轉(zhuǎn)印過夜至PVDF膜。取出PVDF膜，1×PBS洗2～3 min，室溫封閉2 h。應(yīng)用特異性小鼠抗乙酰化賴氨酸抗體(1∶500稀釋)或β-actin(1∶1 000稀釋)，為一抗雜交2 h，加入1∶2 000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，室溫雜交2 h。ECL顯色，成像。
2 結(jié)果與分析
2.1 巨噬細(xì)胞模型的建立
人單核細(xì)胞系U937細(xì)胞正常狀態(tài)下懸浮生長(zhǎng)，鏡下觀察細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞透亮(圖1)。經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化的U937細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化(圖2)，細(xì)胞發(fā)生貼壁，體積增大，呈團(tuán)狀聚集。
2.2 BCG感染分化成熟的U937細(xì)胞
以BCG(MOI=1∶10)感染分化成熟的U937細(xì)胞，抗酸染色法顯示BCG進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，見圖3。
2.3 U937細(xì)胞蛋白質(zhì)乙酰化水平的變化
BCG感染分化成熟U937細(xì)胞，提取感染后的總蛋白，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)感染后總蛋白乙?；礁哂趯?duì)照組(圖4)。
圖1 U937細(xì)胞的正常生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.1 The normal U937 cells
圖2 U937細(xì)胞被PMA誘導(dǎo)分化后的形態(tài)Fig.2 The U937 cells differentiate into macrophage-like cells after a PMA treatment
圖3 BCG感染U937細(xì)胞Fig.3 BCG infection of U937cells 抗酸染色法，箭頭所示為BCGthe acid-fast staining method, an arrow shown in BCG
圖4 BCG感染對(duì)細(xì)胞總蛋白乙?；降挠绊慒ig.4 Effect of BCG infection on the level of protein acetylation
3 討 論
細(xì)菌與宿主細(xì)胞以及機(jī)體的相互作用關(guān)系決定了細(xì)菌感染和致病的分子基礎(chǔ)。越來越多的研究表明，細(xì)菌感染能夠引起細(xì)胞的組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑，從而改變宿主的轉(zhuǎn)錄程序。在眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方式中，乙?；l(fā)揮著重要作用。共有兩類酶參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)乙?；癄顟B(tài)，即組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase, HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDACs)。HATs催化乙酰輔酶A的乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移至組蛋白及一些轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的特定賴氨酸殘基，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子與DNA的親和力及轉(zhuǎn)錄活性的改變，從而調(diào)控基因表達(dá)水平[7]。HDAC在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)乙酰化中的作用與HAT相反。這兩類酶的平衡對(duì)維持蛋白質(zhì)的正常乙?；街陵P(guān)重要。
單核-巨噬細(xì)胞包括存在于血液中的單核細(xì)胞和組織中的巨噬細(xì)胞。單核細(xì)胞在血液中僅存留數(shù)小時(shí)至數(shù)日，然后移行至全身各組織并發(fā)育成熟為巨噬細(xì)胞。分枝桿菌進(jìn)入機(jī)體后，可通過主動(dòng)和被動(dòng)兩種機(jī)制定位于巨噬細(xì)胞中。在自然感染狀態(tài)下，作為機(jī)體第一道防線的巨噬細(xì)胞會(huì)主動(dòng)對(duì)進(jìn)入的分枝桿菌進(jìn)行吞噬。本實(shí)驗(yàn)采用U937作為細(xì)胞模型。U937來源于人的原始單核細(xì)胞，屬于前單核細(xì)胞，以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。用PMA誘導(dǎo)分化后，可以觀察到細(xì)胞貼壁，并聚集成串，表示已成為成熟的巨噬細(xì)胞模型[8-9]。
應(yīng)用BCG作為刺激因素，檢測(cè)U937細(xì)胞中蛋白質(zhì)的乙酰化水平。結(jié)果提示，BCG感染能夠上調(diào)總蛋白乙?；?。在結(jié)核桿菌感染過程中，乙酰化水平的改變可能會(huì)導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)水平的改變，從而影響結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展，并且將為闡明結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制，預(yù)防和綜合控制結(jié)核病的傳播提供新思路。
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The Effect of BCG Infection on the Level of Protein Acetylation in U937 Cell Lines
LI Miao, LUO En-jie
(Teach. &Res.Div.ofPathog.Biol.,Coll.ofBasicMed.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110001)
The effect of BCG infection on protein acetylation level in U937 cell lines was studied. U937 macrophage model was constructed, and then total cellular protein was extracted after infected with BCG. Western blot was used to detect the changes of total protein acetylation level.The results showed that the BCG infection upregulated the protein acetylation level in matured differentiated U937 cells, and caused in epigenetic changes.
BCG; U937; acetylation
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81201333)
李苗 女，講師，博士。研究方向?yàn)楦腥拘约膊〉谋碛^遺傳學(xué)。E-mail:sendtolm@126.com
* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)榀懺x的感染與免疫。E-mail：enjieluo@hotmail.com
2014-03-27；
2014-04-08
Q939.93； R379.91+1
A
1005-7021(2015)01-0046-03
10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.009
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