魏海蓉， 易錫斌， 譚 鉞， 宗曉娟， 王甲威， 徐 麗， 劉慶忠*

（1. 山東省果樹(shù)研究所，山東省果樹(shù)生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安271000；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安271018）

甜櫻桃果實(shí)色澤艷麗，營(yíng)養(yǎng)豐富，且具有一定的醫(yī)療保健價(jià)值，因而備受消費(fèi)者的青睞。甜櫻桃果實(shí)的紅色主要決定于花青苷類物質(zhì)的組成和含量［1］?；ㄇ嘬帐且环N廣泛存在于植物體中的水溶性天然色素，屬黃酮類化合物，在植物體內(nèi)主要呈現(xiàn)藍(lán)色、紫色和紅色［2］。甜櫻桃果皮中的花青苷不僅使果實(shí)具有艷麗的色澤，而且在抗氧化［3］，抗腫瘤、防止冠狀動(dòng)脈心臟疾病、抵御病原體［4］和紫外輻射［5］等方面有重要的營(yíng)養(yǎng)和藥理作用。研究表明甜櫻桃的紅色品種比黃色品種的抗氧化能力強(qiáng)［6］。因此甜櫻桃中花青苷的含量是決定其品質(zhì)的重要因素之一。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于花青苷的研究主要集中在分離、鑒定、生物合成機(jī)理和保健功能等方面。關(guān)于花青苷的檢測(cè)方法，目前常用紫外-可見(jiàn)分光光度法［7］、高效液相色譜法［8，9］和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［10，11］。其中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法比其他方法在快速分離、準(zhǔn)確定性和靈敏度等方面更具有優(yōu)勢(shì)。但到目前為止，有關(guān)甜櫻桃的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以甜櫻桃成熟果實(shí)為研究對(duì)象，建立了UPLC-MS／MS 測(cè)定方法，利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式對(duì)甜櫻桃果皮中的花青苷組分進(jìn)行了定性和定量分析，旨在為甜櫻桃的品質(zhì)評(píng)價(jià)和優(yōu)異種質(zhì)挖掘提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與試材

Triple Quad 4500 液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，配電噴霧離子（ESI）源（美國(guó)AB SCIEX公司）；ELGAPURELAB Ultra 超純水儀（英國(guó)ELGALabWater 公司）；AB-135 型電子分析天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；JA 5003B 型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Centrifuge 5430R 型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；TH-100BQX 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司）。

乙腈、甲醇（色譜純）（德國(guó)Merck 公司）；甲酸（色譜純）（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；7 種花青苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，CAS：7084-24-4）、矢車菊素-3-蕓香糖苷（cyanidin-3-rutinoside，CAS：18719-76-1）（Sigma公司）；芍藥素-3-葡萄糖苷（peonidin-3-glucoside，CAS：6906-39-4）、芍藥素-3-蕓香糖苷（peonidin-3-rutinoside，CAS：27539-32-8）、天竺葵素-3-蕓香糖苷（pelargonidin-3-rutinoside，CAS：33978-17-5）、矢車菊素-3-木糖苷（cyanidin-3-xyloside，CAS：29761-24-8）和飛燕草素-3-葡萄糖苷（delphinidin-3-glucoside，CAS：6906-38-3）（法國(guó)Extrasynthese 公司）。

甜櫻桃樣品：采自山東省果樹(shù)研究所實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.00 mg，分別用含0.1%（v／v，下同）甲酸的甲醇定容至10 mL，配成100 mg／L 的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取各單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL 用含0.1% 甲酸的甲醇定容到10 mL，配成1 000 μg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。依次取0、0.1、0.3、0.5 和1.0 mL 上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇-0.1% 甲酸水溶液（2 ∶8，v／v）定容至10 mL，配成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

取1 ～2 mm 厚甜櫻桃成熟果實(shí)的果皮0.5 g，加液氮研磨后，置于50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入甲醇-0.1% 甲酸水溶液（2 ∶8，v／v）提取液15 mL，超聲波振蕩10 min，放入4 ℃冰箱中浸提24 h，然后于12 000 r／min 下離心15 min，收集上清液于50 mL 離心管中，待凈化。

1.3.2 凈化

AB-8 型大孔樹(shù)脂的活化方法：用95% 乙醇浸泡24 h，過(guò)濾后用蒸餾水洗至無(wú)味；再用5% 氫氧化鈉浸泡12 h，過(guò)濾后用蒸餾水洗至中性；最后用5%鹽酸溶液浸泡12 h，過(guò)濾后用蒸餾水洗至中性，用蒸餾水浸泡，備用。

將活化完全的AB-8 型大孔樹(shù)脂裝入玻璃層析柱中，將待凈化液上柱，流速為1.2 mL／min，待大孔樹(shù)脂吸附飽和后，用蒸餾水淋洗去除水溶性維生素和可溶性糖類等極性小分子，然后用80% 乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，于35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，用甲醇-0.1% 甲酸水溶液（2 ∶8，v／v）復(fù)溶并定容至2 mL，過(guò)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜，濾液壓入2 mL 進(jìn)樣瓶，供UPLC-MS／MS 測(cè)定。

1.3.3 空白基質(zhì)

樣品被多次提取花青苷后其殘?jiān)鼮榭瞻谆|(zhì)。

1.4 UPLC-MS／MS 條件

1.4.1 UPLC 條件

色譜柱為Phenomenex Kinetex（100 mm×4.6 mm，2.6 μm），柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液（含5 mmol／L 甲酸銨），流動(dòng)相B 為100%甲醇，流速為0.3 mL／min。梯度洗脫程序：0 ～1.0 min，20% B；1.0 ～5.5 min，20% B ～70% B；5.5 ～7.8 min，70% B ～80% B；7.8 ～8.0 min，80% B ～20% B；8.0 ～9.0 min，20% B。

1.4.2 MS／MS 條件

電噴霧離子源，正離子電離，MRM 掃描模式，氣簾氣（curtain gas）壓力275.79 kPa，離子化電壓（ion spray voltage）＋4 500 V，離子源溫度550 ℃，電噴霧氣（ion source gas 1）壓力344.74 kPa，輔助加熱氣（ion source gas 2）壓力379.21 kPa，碰撞氣（collision gas）壓力55.16 kPa，駐留時(shí)間（dwell time）40 ms。7 種化合物優(yōu)化后的母離子Q1、子離子Q3、解簇電壓（declustering potential，DP）、碰撞能（collision energy，CE）、出口電壓（collision cell exit potential，CXP）見(jiàn)表1。

表1 MRM 模式下7 種花青苷類物質(zhì)的UPLC-MS／MS 優(yōu)化條件Table 1 Optimized UPLC-MS／MS parameters for the analysis of the seven anthocyanins in MRM mode

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

花青苷極性較強(qiáng)，當(dāng)提取溶劑的極性和花青苷極性相近時(shí)，花青苷在提取溶劑中的溶解性最好，溶出率最大［12］。文獻(xiàn)［13］中采用的花青苷提取溶劑體系有鹽酸／甲醇／水、鹽酸／乙醇／水、甲酸／甲醇／水、甲酸／乙醇／水、酒石酸／乙醇／水和10% 檸檬酸水溶液等?；ㄇ嘬赵谳^強(qiáng)的酸性條件下相對(duì)穩(wěn)定并且呈色效果好［14］。因此，本實(shí)驗(yàn)分別以甲醇、乙醇和丙酮分別與鹽酸、乙酸和甲酸組成的酸性混合溶液為提取劑進(jìn)行提取，采用分光光度計(jì)測(cè)定總花青苷的相對(duì)含量，以比較以上9 種提取劑的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同溶劑的提取效果差異較大，鹽酸與甲醇、乙醇和丙酮組成的酸性提取液的提取效果整體好于甲酸和乙酸與3 種有機(jī)溶劑組成的酸性提取液（見(jiàn)圖1）。其中，0.1% （v／v，下同）鹽酸甲醇的提取效果最好。因此，本實(shí)驗(yàn)采用0.1% 鹽酸甲醇作為甜櫻桃果皮中花青苷的提取溶劑。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

圖1 不同溶劑提取甜櫻桃中花青苷類物質(zhì)的效果Fig.1 Extraction efficiency of different solvents for the anthocyanins in sweet cherry

目前，花青苷類物質(zhì)的純化方法多采用大孔樹(shù)脂法［15］。本實(shí)驗(yàn)比較了AB-8、HPD-100A 和HPD-450A 3 種大孔樹(shù)脂對(duì)甜櫻桃果皮中花青苷的靜態(tài)吸附和解吸效果。結(jié)果表明，AB-8 對(duì)花青苷類物質(zhì)的吸附作用最強(qiáng)，吸附率為81.48%；HPD-450A 的吸附作用次之，吸附率為77.36%；HPD-100A 的吸附作用最弱，吸附率為62.76%。AB-8 和HPD-100A 對(duì)花青苷的解吸效果差異不明顯，分別為73.58% 和74.30%；HPD-450A 的解吸效果較差，僅為62.34%。綜合考慮3 種大孔樹(shù)脂的吸附和解吸效果，本實(shí)驗(yàn)選擇AB-8 作為花青苷類物質(zhì)的凈化吸附劑。

2.3 UPLC 條件的優(yōu)化

花青苷類物質(zhì)的極性較大，文獻(xiàn)［16，17］中目標(biāo)化合物在C18 柱上能夠很好地分離。本實(shí)驗(yàn)采用Phenomenex Kinetex 色譜柱分離，比較了甲醇和乙腈、水和0.1% 甲酸水溶液作為流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果表明，甲醇的分離度優(yōu)于乙腈，0.1% 甲酸水溶液優(yōu)于水。實(shí)驗(yàn)在0.1% 甲酸水溶液中加入5 mmol／L 甲酸銨后，峰形得到明顯改善，靈敏度提高。因此，流動(dòng)相A 采用含5 mmol／L 甲酸銨的0.1% 甲酸水溶液，流動(dòng)相B 采用甲醇，進(jìn)行梯度洗脫。在此條件下，7 種化合物能夠得到較好的分離和檢測(cè)，總離子流圖見(jiàn)圖2a。

2.4 MS／MS 條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)花青苷類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)特征，在電噴霧正離子模式下，對(duì)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、脫溶劑溫度、脫溶劑氣壓力和錐孔氣壓力等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后進(jìn)行母離子Q1 掃描，7 種化合物的母離子均以［M＋H］＋形式存在，其m／z 分別為595.2、449.2、463.3、609.2、579.2、419.2 和465.1（見(jiàn)表1）。確定母離子后，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，從而得到子離子信息和碰撞能量。每種物質(zhì)選擇3 個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的子離子與母離子組成檢測(cè)離子對(duì)，采用MRM 檢測(cè)模式對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。7 種花青苷的選擇離子譜圖見(jiàn)圖2。

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

用0.1% 甲酸甲醇溶液將7 種花青苷配制成質(zhì)量濃度分別為0、10、30、50 和100 μg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的UPLC-MS／MS 條件下進(jìn)行測(cè)定。以定量離子峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg／L）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，7 種化合物的線性相關(guān)系數(shù)（r2）為0.996 4 ～0.999 3（見(jiàn)表2），表明各化合物在0 ～100 μg／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，能滿足檢測(cè)需求。采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)色譜峰3 倍信噪比確定檢出限，以10 倍信噪比確定本方法的定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 7 種花青苷類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg／L）的總離子流圖和MRM 譜圖Fig.2 Total ion current chromatogram and select ion chromatograms of the seven anthocyanins （10 μg／L）

表2 7 種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients （r2），limits of detection （LODs）and limits of quantification （LOQs）of the seven anthocyanins

2.6 加標(biāo)回收率

以甜櫻桃果皮提取液為檢測(cè)試樣，根據(jù)各化合物的背景值，分別添加3 種不同濃度的7 種花青苷類物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6 次，結(jié)果見(jiàn)表3。7 種花青苷類物質(zhì)的加標(biāo)回收率為97.2% ～105.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.9% ～5.8%，說(shuō)明本方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，符合檢測(cè)要求。

表3 甜櫻桃品種“美早”果皮中7 種花青苷類物質(zhì)的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）for the seven anthocyanins spiked in the peel of“Tieton”sweet cherry fruits（n＝6）

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本文建立的方法對(duì)甜櫻桃紅色品種“美早”和純黃色品種“13-33”的成熟果實(shí)樣品進(jìn)行了定性和定量檢測(cè)。從紅色品種“美早”中共檢測(cè)出矢車菊素-3-蕓香糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-蕓香糖苷、天竺葵素-3-蕓香糖苷、矢車菊素-3-木糖苷和飛燕草素-3-葡萄糖苷7 種花青苷類物質(zhì)，其含量分別為742.5、582.5、10.1、14.8、34.2、4.3 和14.2 mg／kg。黃色品種“13-33”中僅檢測(cè)出矢車菊素-3-蕓香糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-木糖苷4 種花青苷類物質(zhì)，其含量?jī)H分別為3.3、5.0、1.2 和1.1 mg／kg?？梢?jiàn)不同品種的甜櫻桃中花青苷類物質(zhì)的含量差異非常大。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)甜櫻桃果皮中的花青苷類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可以快速、準(zhǔn)確地對(duì)甜櫻桃果皮中的花青苷類物質(zhì)進(jìn)行定性及定量測(cè)定。通過(guò)樣品測(cè)定發(fā)現(xiàn)，不同顏色的甜櫻桃品種中花青苷類物質(zhì)組分和含量差異很大，紅色甜櫻桃品種中含有豐富的花青苷類物質(zhì)，而黃色品種中花青苷類物質(zhì)含量極少。

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