余 璐， 宋 偉， 呂亞寧， 趙暮雨，周芳芳， 胡艷云， 鄭 平*

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥230036；2. 安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局，安徽 合肥230022；3. 食品安全分析與檢測(cè)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230022）

茶葉中的農(nóng)藥殘留問題一直是各國關(guān)注的焦點(diǎn)。許多國家及國際組織均對(duì)茶葉中的農(nóng)藥殘留制定了最大殘留限量（MRLs），例如，日本肯定列表制度規(guī)定與茶葉有關(guān)的農(nóng)藥種類有276 種，歐盟有453 種，中國有28 種［1-3］。隨著人們對(duì)食品安全的日益重視，各國規(guī)定的檢測(cè)項(xiàng)目還在不斷增加。因此，迫切需要發(fā)展一種高通量的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)。

目前，氣相色譜-四極桿質(zhì)譜法（GC-Q／MS）和液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-QQQ／MS）由于選擇性好、靈敏度高而廣泛應(yīng)用于茶葉中的農(nóng)藥多殘留分析［4-8］。但以四極桿作為質(zhì)量分析器的GC-Q／MS 和LC-QQQ／MS 均為低分辨質(zhì)譜，當(dāng)分析復(fù)雜樣品時(shí)，往往對(duì)質(zhì)荷比接近的干擾物不能有效地區(qū)分，常出現(xiàn)假陽性結(jié)果。同時(shí)在選擇離子掃描（SIM）或多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描模式下，由于儀器掃描速率不高導(dǎo)致離子駐留時(shí)間有限，限制了一次同時(shí)掃描的化合物數(shù)量，無法真正實(shí)現(xiàn)高通量篩查。在采用LC-QQQ／MS 分析幾百種農(nóng)藥時(shí)，往往需要把化合物分成幾組進(jìn)行分別檢測(cè)［9-11］，降低了分析速度。而在全掃描模式時(shí)，其靈敏度低，分辨率差，不能準(zhǔn)確定性［12］。此外，GC-Q／MS 和LCQQQ／MS 的定性分析必須依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制和使用，增加了實(shí)驗(yàn)成本和分析的工作量。近年來高分辨質(zhì)譜的應(yīng)用為農(nóng)藥多殘留分析提供了可靠的依據(jù)。

高分辨的飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF／MS）具有質(zhì)量范圍廣、分辨率和質(zhì)量精度較高、分析速度快的特點(diǎn)。與低分辨質(zhì)譜不同，TOF／MS 可通過全掃描獲得化合物的精確質(zhì)量數(shù)和可能的化學(xué)分子式，大大提高了復(fù)雜背景下的抗干擾能力，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。并且TOF／MS 的掃描速率高，理論上同時(shí)掃描的目標(biāo)物數(shù)量無上限，可真正實(shí)現(xiàn)一次掃描幾百種農(nóng)藥的高通量檢測(cè)［13-15］。TOF／MS 還可建立特定化合物數(shù)據(jù)庫，結(jié)合樣品采集的精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、同位素比值等信息，通過軟件進(jìn)行自動(dòng)檢索和分析確證，從而實(shí)現(xiàn)不使用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行快速鑒定［16，17］。因此，TOF／MS 是對(duì)復(fù)雜樣品中痕量化合物進(jìn)行定性分析的有效手段，可滿足高通量快速篩查和定量分析的需求，在農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)以茶葉為研究對(duì)象，以固相萃取法為凈化手段，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF／MS）儀，建立了茶葉中204 種農(nóng)藥的快速篩查方法。該方法基于UPLC-Q-TOF／MS技術(shù)建立了204 種農(nóng)藥的精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和譜圖庫，利用數(shù)據(jù)庫對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果的檢索進(jìn)行篩查分析，從而實(shí)現(xiàn)了無需標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，一次進(jìn)樣就可完成茶葉中204 種農(nóng)藥的同時(shí)篩查與確證。該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為茶葉中農(nóng)藥的高通量快速檢測(cè)提供了可靠的分析平臺(tái)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290-6540 超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；ZORBAX SBC18 柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）（美國Agilent公司）；勻漿機(jī)（德國IKA 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI 公司）；甲酸、甲醇、甲苯和乙腈均為色譜純（美國TEDIA 公司）；石墨化炭黑-N-丙基乙二胺復(fù)合固相萃取柱（Carb-PSA，6 mL，500 mg，SUPELCO 公司）；無水硫酸鈉為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）。

204 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：i）農(nóng)藥單標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg），分別置于10 mL 的棕色容量瓶中，根據(jù)其溶解性選擇甲醇、乙腈、丙酮等溶劑［2，13，15］溶解并定容至刻度，于4 ℃避光保存。ii）農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：按照每種農(nóng)藥的化學(xué)性質(zhì)和保留時(shí)間把農(nóng)藥分成A、B、C、D 4組。根據(jù)單標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，準(zhǔn)確量取適量單標(biāo)準(zhǔn)溶液至100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，于4℃避光保存。

茶葉樣品為實(shí)驗(yàn)室日常送檢樣品。

1.2 樣品前處理

稱取1 g（精確至0.01 g）茶葉于50 mL 離心管中，加入15 mL 乙腈，13 500 r／min 均質(zhì)提取1 min，4 200 r／min 離心5 min，吸取上層清液于雞心瓶中。殘?jiān)?5 mL 乙腈重復(fù)提取一次，離心。合并上清液，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL 左右，待凈化。

Carb-PSA 柱中加入約2 cm 高的無水硫酸鈉，用4 mL 乙腈-甲苯（3 ∶1，v／v）預(yù)洗柱，用下面連接的雞心瓶收集流出液，將流出液轉(zhuǎn)移至Carb-PSA柱，并用乙腈-甲苯（3 ∶1，v／v）洗滌雞心瓶3 次（每次2 mL），將洗滌液也移入柱中；在柱上裝上50 mL貯液器，用25 mL 乙腈-甲苯（3 ∶1，v／v）淋洗柱，收集所有流出液于雞心瓶中，在40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.5 mL，用氮?dú)獯蹈?，?.5 mL 乙腈-0.1% 甲酸水（2 ∶8，v／v）定容液溶解，過0.2 μm 濾膜，濾液供儀器測(cè)定。

1.3 UPLC-Q-TOF／MS 條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱；流動(dòng)相：A 相為5 mmol／L 乙酸銨-0.1% （v／v）甲酸水溶液，B 相為乙腈。梯度洗脫程序：0 ～3.00 min，1% B ～30% B；3.00～6.00 min，30% B ～40% B；6.00 ～9.00 min，40% B；9.00 ～15.00 min，40% B ～60% B；15.00 ～19.00 min，60% B ～90% B；19.00 ～23.00 min，90% B；23.00～23.01 min，90% B ～1% B，保持4 min。流速：0.4 mL／min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）源，正離子模式；干燥氣溫度：325 ℃；干燥氣流速：10 L／min；霧化器壓力：276 kPa；鞘流氣溫度：325 ℃；鞘流氣流速：11 L／min；毛細(xì)管電壓：4 000 V；掃描方式：正離子全掃描；全掃描范圍：m／z 50 ～1 600；碎裂電壓：140 V。

UPLC-Q-TOF／MS 配置了雙噴霧器電噴霧源，可以連續(xù)導(dǎo)入?yún)⒈热芤簩?duì)儀器質(zhì)量軸進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。參比溶液中含嘌呤（C5H4N4，其離子精確相對(duì)分子質(zhì)量為121.050 873 0）和HP-0921 （C18H18O6N3P3F24，其離子精確相對(duì)分子質(zhì)量為922.009 798），能夠?qū)崟r(shí)對(duì)測(cè)定的目標(biāo)物進(jìn)行質(zhì)量數(shù)校正，給出離子的準(zhǔn)確質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)庫的建立

1.4.1 一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫的建立（TOF／MS 模式）

本實(shí)驗(yàn)在上述色譜分離條件下對(duì)204 種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，獲得204 種農(nóng)藥的保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量、母離子以及離子化形式。通過在系統(tǒng)自帶軟件中輸入每種農(nóng)藥的名稱、分子式、精確相對(duì)分子質(zhì)量和保留時(shí)間，建立了204 種農(nóng)藥的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫。

1.4.2 二級(jí)譜圖庫的建立（Q-TOF／MS 模式）

一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫建立完成后，在不同碰撞能量下對(duì)204 種農(nóng)藥進(jìn)行再次測(cè)定，采集二級(jí)譜圖庫所需數(shù)據(jù)，然后通過PCDL 軟件，建立204 種農(nóng)藥的二級(jí)譜圖庫，包括母離子、保留時(shí)間、不同碰撞能量下的二級(jí)質(zhì)譜圖等信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

目前，茶葉中農(nóng)殘檢測(cè)常采用乙腈作為提取試劑。經(jīng)研究證明，乙腈極性較大，穿透能力強(qiáng)，能提取范圍較寬、種類較多的農(nóng)藥樣品。且相對(duì)其他試劑而言，乙腈提取的色素等雜質(zhì)較少［4，9，18］。因此，本實(shí)驗(yàn)選用乙腈作為提取試劑。

針對(duì)茶葉樣品前處理，目前日本官方分析方法以及大部分文獻(xiàn)［9，19-22］報(bào)道采用茶葉加水浸泡，然后采用有機(jī)溶劑萃取的方式。而也有少量文獻(xiàn)［5，11，23］報(bào)道采用直接加入有機(jī)試劑均質(zhì)提取的方式。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)這兩種提取方式進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，加水浸泡后，農(nóng)藥的提取效率并沒有得到顯著改善，提取回收率為51.03% ～153.26%；且隨著加水浸泡，茶葉中的一些水溶性色素或水溶性雜質(zhì)（如茶多酚、茶堿等）也被提取出來，使基質(zhì)干擾加大，導(dǎo)致噻蟲啉、啶蟲脒、抑霉唑、雙酰草胺、抗蚜威、萎銹靈等農(nóng)藥的響應(yīng)普遍偏低，降低了碎片離子的匹配程度，從而在篩查過程中出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)采用不加水直接用乙腈提取樣品。另外，本實(shí)驗(yàn)對(duì)均質(zhì)、手動(dòng)渦旋和振蕩器振蕩3 種提取方式進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，均質(zhì)的提取效率最高，對(duì)204種農(nóng)藥的提取回收率為64.30% ～122.47%，基質(zhì)干擾相對(duì)較??；提取時(shí)間最短，明顯優(yōu)于其他方法；且對(duì)204 種農(nóng)藥均能準(zhǔn)確定性。這是因?yàn)楦咚倬|(zhì)可以破壞樣品組織，使提取試劑與目標(biāo)物充分接觸，從而提高萃取效率。綜合考慮各種因素，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈均質(zhì)提取的方法。

2.2 凈化方法的選擇

茶葉基體復(fù)雜，含有大量的色素、生物堿、有機(jī)酸等，不僅會(huì)干擾目標(biāo)物的分析，而且會(huì)對(duì)色譜柱和質(zhì)譜造成致命的損害，故需要有效的凈化方法去除雜質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-甲苯（3 ∶1，v／v）作為洗脫液，比較了常用于農(nóng)殘檢測(cè)的4 種固相萃取小柱：Cleanert TPT 柱、Carb-PSA 柱、Florisil 柱和Envi-Carb 柱。以基質(zhì)效應(yīng)較大的7 種農(nóng)藥為例，測(cè)試結(jié)果見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lorisil 柱或Envi-Carb 柱的回收率高于Carb-PSA 柱與Cleanert TPT柱。Carb-PSA 柱與Cleanert TPT 柱的回收率結(jié)果較為相近，其204 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率分別在65.2% ～119.5% 與70.3% ～116.4% 范圍內(nèi)。從凈化效果看，F(xiàn)lorisil 柱去除色素的能力較差；Envi-Carb 柱雖可去除大部分色素，但去除其他干擾物的能力一般，凈化效果較差。Carb-PSA 柱是雙NH2結(jié)構(gòu)，具有較高的離子交換容量，能夠有效去除茶葉中如色素、有機(jī)酸等極性雜質(zhì)，樣品提取液譜圖上的雜質(zhì)峰較少，基質(zhì)效應(yīng)更小。綜合來看，雖然Florisil 柱或Envi-Carb 柱的回收率較高，但大量雜質(zhì)也同時(shí)隨之洗脫下來，凈化效果較差。而Carb-PSA柱與Cleanert TPT 柱的凈化效果較好，且204 種農(nóng)藥的回收率均滿足實(shí)驗(yàn)要求。另外，考慮到Carb-PSA 柱的使用成本較Cleanert TPT 柱要低，故實(shí)驗(yàn)采用Carb-PSA 固相萃取小柱凈化。

圖1 7 種農(nóng)藥在不同固相萃取柱上的回收率對(duì)比Fig.1 Recoveries of the seven pesticides on different SPE columns

通過洗脫曲線對(duì)洗脫溶劑的用量進(jìn)行了優(yōu)化。在空白樣品中加入50 μg／kg 混合標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行洗脫，比較了5、10、15、20、25、30 mL 洗脫溶劑對(duì)204種農(nóng)藥回收率的影響，部分農(nóng)藥的洗脫曲線見圖2。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫溶劑體積≤10 mL 時(shí)，大部分農(nóng)藥的回收率隨著洗脫溶劑體積的增加而增大。當(dāng)洗脫溶劑體積≥15 mL 時(shí)，只有吡蚜酮（pymetrozine）和嘧螨醚（pyrimidifen）的回收率繼續(xù)增加，其余農(nóng)藥的回收率均趨于平穩(wěn)。洗脫溶劑體積為25 mL 時(shí)，204 種農(nóng)藥的回收率為70.34% ～118.38%，且全部趨于平穩(wěn)，故選擇洗脫溶劑的用量為25 mL。

2.3 定性分析

圖2 洗脫溶劑用量對(duì)部分農(nóng)藥回收率的影響Fig.2 Effect of eluent volume on the recoveries of a part of pesticides

在實(shí)際樣品分析中，樣品先進(jìn)行一級(jí)全掃描測(cè)定，測(cè)定結(jié)果通過已建立的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫進(jìn)行自動(dòng)檢索，軟件根據(jù)實(shí)測(cè)離子與數(shù)據(jù)庫中的精確質(zhì)量偏差、保留時(shí)間、同位素分布和同位素比例4 個(gè)因素的匹配程度進(jìn)行打分，經(jīng)優(yōu)化，將檢索得分≥70的農(nóng)藥確定為疑似農(nóng)藥。以茶葉空白樣品中添加10 μg／kg 噻嗪酮為例，圖3a 為噻嗪酮的一級(jí)提取離子流色譜圖，圖3b 為一級(jí)質(zhì)譜圖，圖3c 為軟件自動(dòng)檢索后噻嗪酮的一級(jí)匹配結(jié)果。由圖3c 可知，噻嗪酮的質(zhì)量偏差均小于5×10-6（5 ppm），滿足歐盟的定性要求，可以作為定性依據(jù)。且保留時(shí)間（圖3a）、同位素比例及其分布（圖3b）與數(shù)據(jù)庫中的理論值也均匹配良好，一級(jí)檢索得分為97.50，從而確定噻嗪酮為疑似農(nóng)藥。由此可見，本實(shí)驗(yàn)可以根據(jù)精確質(zhì)量偏差、保留時(shí)間、同位素分布和同位素比例對(duì)樣品中的204 種農(nóng)藥進(jìn)行快速篩查。

圖3 噻嗪酮的（a）提取離子色譜圖、（b）一級(jí)質(zhì)譜圖和（c）一級(jí)匹配結(jié)果Fig.3 （a）extracted ion chromatogram，（b）MS spectrum and （c）MS matched results of buprofezin

篩查出的疑似農(nóng)藥還需利用二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子進(jìn)行進(jìn)一步確證。樣品經(jīng)二次測(cè)定后，將樣品的碎片離子信息與譜圖庫中碎片離子信息進(jìn)行匹配，給出鏡像對(duì)比結(jié)果。經(jīng)優(yōu)化，二級(jí)檢索得分≥60 的農(nóng)藥確定為目標(biāo)農(nóng)藥。圖4 為噻嗪酮的二級(jí)質(zhì)譜鏡像對(duì)比結(jié)果，圖4 中可以明顯看到主要的特征碎片與譜圖庫均匹配良好，噻嗪酮的二級(jí)得分為94.93，故確定樣品中含有噻嗪酮。參照歐盟2002／657／EC［24］規(guī)定：當(dāng)使用高分辨質(zhì)譜時(shí)，每個(gè)離子可獲得2 個(gè)定性位點(diǎn)。而UPLC-Q-TOF／MS 通過全掃描獲得一級(jí)母離子的精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)碎片離子信息，噻嗪酮可獲得22 個(gè)定性位點(diǎn)，完全滿足定性要求（限用化合物確認(rèn)需最少3 個(gè)定性位點(diǎn)），可實(shí)現(xiàn)在無對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的情況下進(jìn)行篩查與確證。此外，噻嗪酮通過UPLC-Q-TOF／MS 獲得的定性位點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于LC-MS／MS 的4 個(gè)位點(diǎn)，從而大大降低了出現(xiàn)假陽性結(jié)果的概率，提高了定性結(jié)果的可信度。

圖4 茶葉樣品中噻嗪酮的二級(jí)質(zhì)譜鏡像結(jié)果Fig.4 MS2 spectral difference results of buprofezin in a tea sample

為了考察本實(shí)驗(yàn)所建立的篩查方法的可靠性，采用已建立的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級(jí)譜圖庫對(duì)添加了204 種農(nóng)藥的茶葉樣品進(jìn)行自動(dòng)檢索。結(jié)果見表1，204 種農(nóng)藥均與一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫檢索匹配良好，質(zhì)量偏差均小于5 ppm，檢索得分均高于70。而二級(jí)譜圖庫檢索得分高于60 的占91.7% ；少部分農(nóng)藥得分低于60，這可能是由于添加的農(nóng)藥濃度較低或基質(zhì)導(dǎo)致有相近質(zhì)量數(shù)的干擾造成的，但其譜圖中主要的特征離子均匹配良好。在實(shí)際樣品分析中，這種情況會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)，一般通過扣除背景來減少樣品基質(zhì)對(duì)定性匹配的干擾。在采用該方法對(duì)基質(zhì)加標(biāo)樣品的分析中，二級(jí)檢索得分低于60 的農(nóng)藥，扣除背景后得分均高于60，從而確定為目標(biāo)農(nóng)藥。

由此可見，本實(shí)驗(yàn)建立的篩查方法是準(zhǔn)確可靠的，能夠在無對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的情況下完成茶葉中204種農(nóng)藥的篩查與確證。

表1 204 種農(nóng)藥的分子式、保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)、質(zhì)量數(shù)偏差和檢索得分Table 1 Formulae，retention times，accurate masses，mass errors and automated retrieval scores of the 204 pesticides

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除了目標(biāo)分析物以外的其他成分對(duì)待測(cè)物測(cè)定值的影響，也就是指基質(zhì)對(duì)分析方法準(zhǔn)確性的干擾。本文分別用基質(zhì)空白液和溶劑配制了一系列不同質(zhì)量濃度（5、10、20、50、100 μg／L）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后比較這兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的差異，從而判斷基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱。計(jì)算公式如下：基質(zhì)效應(yīng)（ME）＝［（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率／溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）-1］×100%。結(jié)果如圖5 所示，茶葉中只有3 種農(nóng)藥出現(xiàn)了基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其余201種農(nóng)藥的ME 值均為負(fù)，所以為基質(zhì)抑制效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)茶葉中204 種農(nóng)藥中有114 種農(nóng)藥表現(xiàn)了中等基質(zhì)效應(yīng)，74 種農(nóng)藥表現(xiàn)強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。中等和強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)占總數(shù)的92.16%，由此可見茶葉具有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。因此，分析目標(biāo)化合物時(shí)選用空白茶葉配制的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量更為準(zhǔn)確。

圖5 204 種農(nóng)藥在茶葉中的農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)分布Fig.5 Distribution of matrix effects （ME）of the 204 pesticides in tea

目前，基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制還不是十分清楚，在液相色譜-質(zhì)譜分析中，一般認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)是由質(zhì)譜檢測(cè)器的離子化過程引起的。在形成帶電噴霧滴時(shí)，非揮發(fā)性的基質(zhì)組分與分析物離子競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)生，非揮發(fā)性基質(zhì)組分將霧滴吸在一起，阻止其分裂成更小的微滴［25］。通常情況下使用電噴霧離子源（EIS）作為電離源時(shí)，更容易出現(xiàn)離子化抑制現(xiàn)象，最終導(dǎo)致基質(zhì)抑制效應(yīng)。此外，還有很多其他因素也會(huì)影響基質(zhì)效應(yīng)，如樣品基質(zhì)的種類和濃度，待測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等，待測(cè)物在樣品中的濃度，檢測(cè)器及接口類型等［26］。

2.5 方法的線性關(guān)系、定量限、回收率和精密度

將204 種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用空白樣品提取液稀釋配制成5、10、20、50、100 μg／kg 的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在建立的分析條件下對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2 可以看出，204 種農(nóng)藥均線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。

表2 茶葉中204 種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)（r2）、添加回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和定量限（n＝6）Table 2 Correlation coefficients （R2），spiked recoveries，RSDs and LOQs of the 204 pesticides in tea （n＝6）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

歐盟、日本、國際法典委員會(huì)（CAC）規(guī)定茶葉中農(nóng)藥的MRLs 分別為0.01 ～30.0、0.01 ～30.0、0.10 ～50.0 mg／kg，沒有明確規(guī)定的農(nóng)藥殘留限量均采用0.01 mg／kg 的一律標(biāo)準(zhǔn)［10］。按10 倍信噪比計(jì)算定量限，茶葉中204 種農(nóng)藥的定量限均小于10 μg／kg（見表2），滿足各國農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的要求。以嘧菌環(huán)胺（cyprodinil）、苯線磷亞砜（fenamiphos sulfoxide）、噻唑磷（fosthiazate）、稻瘟靈（isoprothiolane）4 種農(nóng)藥為例，其在接近定量限的加標(biāo)茶葉樣品（添加水平為1 μg／kg）中的提取離子流圖見圖6。向茶葉空白樣品中添加204 種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為10、20、50 μg／kg，然后按照本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行提取、凈化和檢測(cè)，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)6 次測(cè)定，204 種農(nóng)藥的平均回收率為68.1% ～117.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.1% ～18.9% （見表2）。

圖6 茶葉空白樣品中添加水平為1 μg／kg 的嘧菌環(huán)胺、苯線磷亞砜、噻唑磷和稻瘟靈的提取離子流圖Fig.6 Extracted ion chromatograms of cyprodinil，fenamiphos sulfoxide，fosthiazate and isoprothiolane spiked in blank tea at 1 μg／kg

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

應(yīng)用本文所建立的篩查方法對(duì)日常送檢的10份茶葉樣品進(jìn)行了204 種農(nóng)藥殘留的快速篩查檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，其中的8 份茶葉樣品共檢出15 種農(nóng)藥。8 份樣品中檢出農(nóng)藥的一級(jí)檢索得分均高于70，二級(jí)檢索得分高于60 的農(nóng)藥占89.7%。低于60 的農(nóng)藥，經(jīng)背景扣除后，二級(jí)得分均提高到60 以上，故達(dá)到了確證要求。例如，樣品1 中避蚊胺的二級(jí)檢索得分為49.11，其扣除背景前的鏡像對(duì)比結(jié)果見圖7a，背景中主要的特征離子均匹配較好，但由于樣品中含有m／z 110.071 3、138.065 9 和195.087 2 共3 個(gè)干擾離子，使匹配程度降低，二級(jí)檢索得分較低。背景扣除后（見圖7b），3 個(gè)干擾離子被成功扣除，二級(jí)檢索得分提高為87.22，從而確定含有避蚊胺。為了驗(yàn)證結(jié)果，取4 份陽性樣品，用GB／T 23205-2008 方法進(jìn)行再次檢測(cè)，測(cè)得結(jié)果與本方法結(jié)果基本一致，證明了本方法的有效性。

圖7 茶葉中避蚊胺（a）扣除背景前和（b）扣除背景后碎片離子的鏡像對(duì)比結(jié)果Fig.7 Comparison of spectral difference results of （a）before and （b）after background subtraction of diethyltoluamide in a tea sample

從表3 可以看出，噻嗪酮、啶蟲脒和三唑磷的檢出率較高，8 份樣品按GB 2763-2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》衡量，所有檢出農(nóng)藥均未超標(biāo)；按歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)衡量，只有樣品6 中三唑磷的檢出含量為54.07 μk／kg，超出了歐盟規(guī)定的最大殘留限量，其余農(nóng)藥均未超標(biāo)。由此可知，雖然茶葉樣品中農(nóng)藥的檢出率較高，但大部分農(nóng)藥的殘留水平偏低，滿足我國限量要求。

表3 10 份實(shí)際樣品的測(cè)試結(jié)果Table 3 Detected results of ten real samples

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了茶葉中204 種農(nóng)藥的UPLC-QTOF／MS 快速篩查方法。利用目標(biāo)化合物特征離子的精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、同位素比例等信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫的檢索，實(shí)現(xiàn)了無需對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)篩查和確認(rèn)茶葉中204 種農(nóng)藥。204 種農(nóng)藥在5 ～100 μg／kg 范圍線性良好，平均回收率為68.1% ～117.2%。該方法快速、準(zhǔn)確，分析通量高，可以為茶葉中多農(nóng)殘的快速篩查和質(zhì)量控制提供重要的方法依據(jù)。

［1］ Ma H M，Wang Y Q，Qian H. China Tea Processing （馬惠民，王永強(qiáng)，錢和. 中國茶葉加工），2012（4）：18

［2］ Li Y. ［MS Dissertation］. Qinhuangdao：Yanshan University（李巖. ［碩士學(xué)位論文］. 秦皇島：燕山大學(xué)），2013

［3］ GB 2763-2014

［4］ Dong J B，Wang J H. Food Science （董金斌，王金花. 食品科學(xué)），2009，30（12）：230

［5］ Deng X J，Qian G，Chen X P，et al. Food Chem，2014，145：853

［6］ Mezcua M，Martinez-Uroz A，F(xiàn)ernandez-Alba A. Gas Chromatography. London：Elsevier，2012

［7］ Liu B，Zhao H X. Chinese Journal of Analysis Laboratory（劉冰，趙紅霞. 分析試驗(yàn)室），2013，32（10）：77

［8］ Zhao H X，Zhao S C，Deng L G，et al. Food Anal Methods，2013，6：497

［9］ Jia W，Huang J R，Ling Y，et al. Journal of Instrumental Analysis （賈瑋，黃峻榕，凌云，等. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)），2013，32（1）：9

［10］ Pang G F，F(xiàn)an C L，Li Y，et al. Journal of Instrumental Analysis （龐國芳，范春林，李巖，等. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)），2012，31（9）：1017

［11］ GB／T 23205-2008

［12］ Li X Y，Zhang H Y，F(xiàn)an C L，et al. Chemistry （李曉穎，張紅醫(yī)，范春林，等. 化學(xué)通報(bào)），2014，77（2）：123

［13］ Peng X，Zhao Z Y，Kang J，et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory （彭興，趙志遠(yuǎn)，康健，等. 分析試驗(yàn)室），2014，33（3）：282

［14］ Li X J，Peng T，Li C J. Journal of Instrumental Analysis（李曉娟，彭濤，李重九. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)），2012，31（5）：628

［15］ Zhao Z Y，Shi Z H，Kang J，et al. Chinese Journal of Chromatography （趙志遠(yuǎn)，石志紅，康健，等. 色譜），2013，31（4）：327

［16］ Mezcua M，Malato O，Garcia-Reyes J F，et al. Anal Chem，2009，81（3）：913

［17］ Zhang F，Yu C T，Wang W W，et al. Anal Chim Acta，2012，757：39

［18］ Lou Z Y，Chen Z M，Luo F J，et al. Chinese Journal of Chromatography （樓正云，陳宗懋，羅逢健，等. 色譜），2008，26（5）：568

［19］ JAP-178 GC／MS

［20］ Hou R Y，Bian H Z，Zhao X X，et al. Journal of Instrumental Analysis （侯如燕，卞紅正，趙秀霞，等. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)），2011，30（1）：58

［21］ Lou Z Y，Tang F B，Chen Z M，et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory （樓正云，湯富彬，陳宗懋，等. 分析試驗(yàn)室），2009，28（Suppl）：76

［22］ Xu J，Chen J，Ye H Y，et al. Journal of Instrumental Analysis （徐娟，陳捷，葉弘毅，等. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)），2011，30（9）：990

［23］ Feng Y W，Xue Q H，Wang Z J. Food and Fermentation Industries （馮永巍，薛慶海，汪振炯. 食品與發(fā)酵工業(yè)），2013，39（5）：176

［24］ 2002／657／EC

［25］ Xiang P，Shen M，Zhuo X Y. Journal of Instrumental Analysis （向平，沈敏，卓先義. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)），2009，28（6）：753

［26］ Duan J Y. ［MS Dissertation］. Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences （段俊彥. ［碩士學(xué)位論文］. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院），2009