成 斌， 謝一凡， 胡優(yōu)敏， 劉慧中， 鈕因堯* ， 陸 陽

（1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系化學(xué)教研室，上海200025；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗教學(xué)中心功能學(xué)實驗室，上海200025；3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗教學(xué)中心化學(xué)生物學(xué)實驗室，上海200025）

毒蕈堿型膽堿能受體（muscarinic receptor，簡稱M 受體）廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)組織、心臟、平滑肌及腺體等，調(diào)節(jié)神經(jīng)信號傳遞、心血管活動、平滑肌收縮及分泌腺功能等。M 受體有M1～M55種亞型。其中，M3亞型主要位于平滑肌和腺體，是多種疾病的重要靶標。M3受體拮抗劑可用于臨床治療膀胱過度活動癥等與平滑肌有關(guān)的疾病［1，2］，并已成為緩解慢性阻塞性肺病的首選藥物［1，3］。但是，亞型選擇性（M3／M2）偏低的M3受體拮抗劑在臨床應(yīng)用中，因拮抗M2亞型受體會引起心動過速、矛盾性支氣管收縮、黏液高分泌而產(chǎn)生較強的副作用［4-7］。

由本課題組合成的系列外消旋3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷類化合物具有較好的M3受體拮抗活性及一定的亞型選擇性（M3／M2）［8，9］。這些化合物都具有（3S，6S）和（3R，6R）對映異構(gòu)體。前期初步研究結(jié)果表明（3S，6S）-異構(gòu)體的拮抗活性大多為（3R，6R）-異構(gòu)體的100 倍以上，且分子的絕對構(gòu)型對亞型選擇性（M3／M2）也有一定的影響［10］。與外消旋體相比，（3S，6S）-異構(gòu)體更具有高效低毒的潛質(zhì)和藥物研發(fā)價值。因此，本課題組進一步設(shè)計合成了系列手性3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷用于生物學(xué)研究。為了準確評價該類化合物不同對映異構(gòu)體的拮抗活性及亞型選擇性（M3／M2），需要建立分析異構(gòu)體光學(xué)純度的方法，而該方法鮮見報道。

本文應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）法，分別利用淀粉型Chiralpak AD、纖維素型Chiralcel OD-H 手性柱，嘗試拆分3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷類化合物的6 對對映異構(gòu)體（結(jié)構(gòu)見圖1），探討手性拆分機理，分析C-3α 位取代基團的立體、靜電性質(zhì)對拆分結(jié)果的影響，為其他莨菪烷類化合物的拆分分離提供方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

美國Agilent 1260 高效液相色譜儀包括G1311C 四元泵、G1329B 自動進樣器、G1316A 柱溫箱、G4212B 二極管陣列檢測器和OpenLAB CDS Chemstation 色譜工作站；Chiralpak AD （250 mm×4.6 mm，10 μm）色譜柱和Chiralcel OD-H（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱購自大賽璐藥物手性技術(shù)上海有限公司；正己烷、異丙醇為HPLC 級（美國TEDIA 公司）；3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷類化合物由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室合成。

圖1 3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷的對映異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of enantiomers of 3α-acyloxy-6βacetoxyltropane compounds

1.2 樣品制備

于1 mL 異丙醇中加入1 mg 樣品，超聲溶解。取該溶液100 μL，加入400 μL 正己烷，振蕩搖勻。

1.3 色譜條件

色譜柱為Chiralpak AD、Chiralcel OD-H 手性柱，流動相為不同配比的正己烷-異丙醇，流速0.8 mL／min，檢測波長為210 ～250 nm 范圍內(nèi)化合物的最大吸收波長，柱溫30 ℃，進樣體積5.0 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 Chiralpak AD 手性柱對系列化合物的拆分

在正相色譜條件下，選擇不同的流動相以及各種配比拆分6 個目標物，通過比較分離結(jié)果，獲得最優(yōu)的色譜分離條件。以正己烷-異丙醇為流動相，6對對映異構(gòu)體在Chiralpak AD 手性柱上的拆分結(jié)果見表1，色譜圖見圖2?？梢钥闯觯珻hiralpak AD手性柱對對映體6 的選擇性識別能力最強（選擇性因子α ＝1.21），對映體6 實現(xiàn)完全分離（Rs＝3.31）；手性柱對對映體2、3、4 的選擇性識別能力較低（α＝1.03，1.05，1.05），3 對對映體僅實現(xiàn)部分分離（Rs＝0.55，0.72，0.90）；對對映體1、5 沒有選擇性（α 均為1.00），兩對對映體完全沒有被分離（Rs均為0）。

表1 3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷系列化合物在Chiralpak AD 手性柱上的拆分Table 1 Enantioseparation of 3α-acyloxy-6β-acetoxyltropane compounds on a Chiralpak AD column

圖2 正相色譜條件下6 個3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷化合物在Chiralpak AD 柱上拆分的色譜圖Fig.2 Chromatograms of enantioseparation of six 3α-acyloxy-6β-acetoxyltropane compounds on a Chiralpak AD column under normal phase conditions

2.2 Chiralcel OD-H 手性柱對系列化合物的拆分

在正相色譜條件下，通過條件優(yōu)化實驗，獲得Chiralcel OD-H 手性柱拆分6 對對映體的最優(yōu)分離條件。以正己烷-異丙醇為流動相，6 對對映異構(gòu)體在Chiralcel OD-H 手性柱上的拆分結(jié)果見表2，色譜圖見圖3?？梢钥闯?，Chiralcel OD-H 手性柱對對映體1 的選擇性最大（α ＝1.10），對映體實現(xiàn)完全分離（Rs＝2.32）；與淀粉型Chiralpak AD 手性柱相比，纖維素型Chiralcel OD-H 手性柱對對映體2、3、4 的選擇性增強（α＝1.04，1.07，1.09）；對映體2的分離度明顯增大（Rs＝0.80），而對映體3、4 分別實現(xiàn)基本分離（1 ＜Rs＝1.46 ＜1.5）和基線分離（Rs＝1.54）；但是對對映體6 的選擇性卻降低（α ＝1.05），對映體僅實現(xiàn)部分分離（Rs＝1.00）；手性柱對對映體5 沒有選擇性（α ＝1.00），對映體完全沒有被分離（Rs＝0）。

表2 3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷系列化合物在Chiralcel OD-H 手性柱上的拆分Table 2 Enantioseparation of 3α-acyloxy-6β-acetoxyltropane compounds on a Chiralcel OD-H column

圖3 6 對3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷對映體在正相條件下Chiralcel OD-H 柱上拆分的色譜圖Fig.3 Chromatograms of enantioseparation of six 3α-acyloxy-6β-acetoxyltropane compounds on a Chiralcel OD-H column under normal phase conditions

2.3 兩種手性柱對3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷的拆分機理和結(jié)果分析

Chiralpak AD、Chiralcel OD-H 柱的手性固定相分別是涂敷在10 μm、5 μm 厚硅膠表面的直鏈淀粉-三（3，5-二甲苯基氨基苯甲酸酯）和纖維素-三（3，5-二甲苯基氨基苯甲酸酯）［11］（結(jié)構(gòu)見圖4）。多糖類手性固定相的拆分機制尚未被完全闡明。一般認為手性固定相內(nèi)部存在手性空腔，化合物全部或部分進入空腔，與固定相之間產(chǎn)生氫鍵作用，同時發(fā)生偶極-偶極、π-π 等相互作用。具有一定空間位阻的取代基能使一對對映體與固定相的手性空腔產(chǎn)生一定的空間適應(yīng)性差異，有助于形成具有不同穩(wěn)定性的非對映體復(fù)合物，從而被先后洗脫分離［12，13］。

本文中莨菪烷類化合物的C-3α 位酰氧基的羰基O 作為給電子體可能與固定相R 基團中的NH形成氫鍵，同時，C-3α 位上的五、六元環(huán)和固定相的芳香環(huán)也可能存在π-π 作用。但是，由于C-3α 位取代基團的靜電、立體性質(zhì)不同，同一手性柱對于3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷系列各化合物的拆分效果存在明顯差異。

圖4 （a）Chiralpak AD 和（b）Chiralcel OD-H 手性固定相的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structures of chiral stationary phases of （a）Chiralpak AD and （b）Chiralcel OD-H

對映體4 的C-3α 位取代基團3，3-二苯基-丙酰氧基，其體積比對映體2、3 的苯丙酰氧基、對氯苯乙酰氧基的體積大。適當增加化合物的空間位阻，有利于擴大一對對映體與固定相之間的空間適應(yīng)性差異，提高手性柱對旋光異構(gòu)體的識別能力，所以對映體4 在兩種手性柱上的拆分效果都優(yōu)于對映體2、3。對映體3 與2 相比，C-3α 位取代基的苯環(huán)上多了一個氯原子，通過p-π 共軛，適當增強化合物與手性固定相之間的π-π 作用，有利于增加一對對映體保留時間之間的差異，使其更容易被分離。在兩種手性柱上，對映體3 的分離度比對映體2 略高。對映體6 與4 相比，在C-3α 位通過環(huán)化固定兩個苯環(huán)的相對位置，進一步增加了空間位阻，提高了Chiralpak AD 手性柱對對映體6 的選擇性識別能力，從而實現(xiàn)了對映體的完全分離。對映體5 與4相比，C-3α 位的取代基團（3，3，3-三苯基-丙酰氧基）多了一個苯環(huán)，在增加空間體積的同時，可能大大增強了化合物與固定相之間的π-π 相互作用，延長化合物在兩種手性柱中的保留時間（對映體5 在兩種手性柱中的保留時間最長），同時顯著降低了對映體與固定相之間的空間適應(yīng)性差異，使得兩種手性柱對對映體5 無選擇性識別能力，對映體完全不能被拆分?？梢姦?π 相互作用在對映體的拆分中也發(fā)揮著重要作用。

淀粉型Chiralpak AD 和纖維素型Chiralcel OD-H 兩種手性柱的固定相雖然都屬于多糖，且分子式相同，但淀粉型固定相以α-1，4 糖苷鍵連接形成螺旋結(jié)構(gòu)，而纖維素型固定相卻通過β-1，4 糖苷鍵形成線型結(jié)構(gòu)，它們各自形成的手性空腔的空間結(jié)構(gòu)不同，與同一化合物的一對對映異構(gòu)體之間的空間適應(yīng)性差異不同，使得化合物在兩種手性柱上的拆分效果完全不同。例如，在Chiralpak AD 柱上，對映體6 實現(xiàn)完全分離，對映體1 完全不能分離。但在Chiralcel OD-H 柱上，對映體6 只能實現(xiàn)部分分離，而對映體1 卻實現(xiàn)完全分離。除對映體5、6 以外，Chiralcel OD-H 柱對化合物的拆分能力都強于Chiralpak AD 柱，表明總體上Chiralcel ODH 柱對3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷系列化合物的拆分效果更好。此外，由于兩手性柱填料的粒徑不同（Chiralpak AD，10 μm；Chiralcel OD-H，5 μm），柱效相差較大，對拆分效果也會產(chǎn)生一定的影響。

流動相中的極性成分異丙醇也能與固定相形成氫鍵，抑制化合物-固定相復(fù)合物的形成，降低Chiralpak AD、Chiralcel OD-H 柱的手性識別能力。因此，減小流動相中異丙醇的比例，能增強兩種手性柱對對映異構(gòu)體的手性識別能力，延長化合物在柱中的保留時間，提高對映體的分離度［14］。

3 結(jié)論

本文考察了6 個外消旋體3α-酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷在Chiralpak AD、Chiralcel OD-H 手性柱上的拆分情況。在Chiralpak AD 手性柱上，對映體6 實現(xiàn)完全分離，而對映體1 完全不能分離；在Chiralcel OD-H 柱上，對映體1、4、3 分別實現(xiàn)完全分離、基線分離和基本分離，對映體6 只能實現(xiàn)部分分離；對映體5 在兩種手性柱上都完全不能被分離。說明固定相手性空腔的結(jié)構(gòu)對化合物的拆分結(jié)果影響很大。對映體5 在兩種手性柱上都完全不能被分離。拆分結(jié)果表明，C-3α 位取代基團的空間位阻效應(yīng)是決定對映體與手性空腔空間適應(yīng)性差異的關(guān)鍵因素，它主導(dǎo)手性固定相選擇性識別對映體的能力強弱，但是化合物與固定相之間的分子間作用力在對映體的拆分中也發(fā)揮重要作用。本研究方法為其他莨菪烷類化合物的手性拆分提供了參考。

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