(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，湖南 衡陽 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

梅毒螺旋體金屬蛋白酶水解纖維蛋白原的活性研究

劉雙全

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，湖南 衡陽 421001)

目的研究梅毒螺旋體金屬蛋白酶Tp0751對細(xì)胞外基質(zhì)纖維蛋白原的水解能力，為深入研究TP的致病機制提供實驗依據(jù)。方法采用兩點法構(gòu)建H198A突變型及H202A突變型Tp0751基因，分別構(gòu)建野生型和突變型Tp0751原核載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；體外實驗檢測Tp0751野生型Tp0751蛋白、H198A Tp0751突變型蛋白、H202ATp0751突變型蛋白對纖維蛋白原的降解活性。結(jié)果成功表達(dá)并純化了野生型Tp0751蛋白、H198A Tp0751突變體蛋白、H202A Tp0751突變體蛋白，各蛋白相對分子量大小約為26kD；纖維蛋白原在與野生型Tp0751蛋白作用約24h后被完全水解；與H198A Tp0751突變體蛋白作用約24 h后部分水解，尚有部分未被降解；與H202A Tp0751突變體蛋白作用約24h后幾乎不被水解。結(jié)論野生型Tp0751蛋白具有水解纖維蛋白原的作用；Tp0751蛋白水解纖維蛋白原的活性可能與金屬蛋白酶HEXXH域相關(guān),影響Tp0751蛋白對纖維蛋白原的降解的活性位點可能是202位的H而不是198位的H。

梅毒螺旋體； 金屬蛋白酶； Tp0751； 水解活性

梅毒螺旋體(Treponema pallidum，Tp)是引起人類梅毒(syphilis)的病原體。梅毒是一種能造成成人嚴(yán)重全身性損害及胎兒的胎傳梅毒的性傳播性疾病(STD)[1-4]。居高不下的梅毒發(fā)病率引起了我國公共衛(wèi)生部門乃至全球公共衛(wèi)生部門的高度關(guān)注，控制本病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)則是闡明Tp致病機制。感染宿主過程中，黏附是Tp感染機體的第一步，Tp穿透血管壁屏障后，如何防止血液凝固是Tp隨血液循環(huán)播散至全身引起慢性感染的關(guān)鍵。血液凝固的關(guān)鍵過程是血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿睦w維蛋白。Houston[5]等發(fā)現(xiàn)Tp0751除了能結(jié)合宿主ECM外，還能降解人類纖維蛋白原。HEXXH活性區(qū)為金屬蛋白酶活性域，其與細(xì)菌許多蛋白降解活性相關(guān)[6-9]。但是，Tp0751金屬蛋白酶的水解活性是否與該區(qū)域有關(guān)尚有待研究和探索。為了探索Tp0751蛋白水解活性機制，本文對野生型及HEXXH活性區(qū)突變型Tp0751蛋白水解纖維蛋白原的活性進(jìn)行研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

1.1.1 菌株與載體 Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株、表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)、PET-30a(+)質(zhì)粒均為南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存。

1.1.2 主要試劑 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，Ni-NTA親和層析柱購自QIAGEN公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；卡那霉素購自上海生工生物工程公司；人纖維蛋白原購自美國Sigma公司。

1.1.3 主要儀器HEMA公司凝膠圖像分析系統(tǒng)；北京六一儀器廠水平電泳儀；MP220超聲細(xì)胞破碎儀；Beckman公司DU640核酸蛋白定量分析儀。

1.2 方法

1.2.1 野生型和突變型Tp0751重組表達(dá)載體的構(gòu)建 野生型Tp0751重組質(zhì)粒的構(gòu)建：從GenBank中查詢Tp0751基因序列，設(shè)計1對PCR擴增引物，由上海生工合成；以Tp Nichols株的基因組DNA為模板，PCR擴增Tp0751基因,構(gòu)建pET30a(+)/Tp0751重組表達(dá)質(zhì)粒(上述質(zhì)粒構(gòu)建由本課題組前期研究完成 )

H198A和H202A突變型Tp0751重組質(zhì)粒的構(gòu)建：從GenBank中查詢Tp0751基因序列，針對Tp0751金屬結(jié)構(gòu)域HEXXH中的198位的H及202位的H，采用兩點法分別設(shè)計2對PCR擴增引物,構(gòu)建pET30a(+)/H198A Tp0751、pET30a(+)/H202A Tp0751重組表達(dá)質(zhì)粒(上述質(zhì)粒由北京博亞結(jié)晶生物科技公司構(gòu)建)。

1.2.2 野生型和突變型Tp0751重組蛋白的表達(dá)、純化 將pET30a(+)/Tp0751、pET30a(+)/H198A Tp0751和pET30a(+)/H202A Tp0751重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌E.coli BL21構(gòu)建原核重組表達(dá)體，分別挑選單個陽性菌落，大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白；離心收集菌體，用超聲波破碎菌體后離心收集上清上Ni-NTA親和層析柱純化，具體操作見說明書，SDS-PAGE電泳分析蛋白純化產(chǎn)物。

1.2.3 野生型Tp0751蛋白、H198A突變型和H202A突變型Tp0751對Fg水解能力檢測 將野生型Tp0751蛋白、H198A和H202A突變型Tp0751蛋白與Fg按比例混合(蛋白終質(zhì)量為30 μg，F(xiàn)g中終質(zhì)量為60 μg，反應(yīng)總體積為100 μL)，SDS-PAGE檢測Tp0751對Fg不同作用時間段的降解活性。

2 結(jié) 果

2.1野生型、H198A突變型和H202A突變型Tp0751重組蛋白的表達(dá)、純化挑選陽性重組表達(dá)菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在分子量約為26 KD處有一明顯蛋白條帶，與預(yù)期的分子量大小相符(圖1)；重組蛋白經(jīng)純化后，蛋白純度在90%以上。

圖2 H198A突變型Tp0751蛋白純化結(jié)果圖 1：蛋白Mark；2：洗滌液洗滌第一次；3：洗滌液洗滌第二次；4：洗脫液洗脫第一次；5：洗脫液洗脫第二次

圖3 H202A突變型Tp0751蛋白純化結(jié)果圖 1：蛋白Mark；2：洗滌液洗滌第一次；3：洗滌液洗滌第二次；4：洗脫液洗脫第一次；5：洗脫液洗脫第二次

2.2野生型Tp0751水解纖維蛋白原的活性野生型Tp0751蛋白水解纖維蛋白原反應(yīng)總體積為100 μL，包括30 μg 野生型Tp0751蛋白，60 μg Fg，反應(yīng)0 h，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h后，分別留取反應(yīng)產(chǎn)物，與5×蛋白上樣緩沖液混勻后，100 ℃,5 min，跑SDS-PAGE蛋白膠分析，結(jié)果如圖4所示：Fg在與Wt-Tp0751反應(yīng)6 h后開始出現(xiàn)明顯降解，在反應(yīng)12 h后Fg基本上被完全降解，且Wt-Tp0751目的蛋白逐漸減少并出現(xiàn)了多條小分子降解蛋白條帶。

圖4 wt-Tp0751蛋白水解Fg結(jié)果圖 1：蛋白Mark；2：反應(yīng)0 h后；3：反應(yīng)1 h后；4：反應(yīng)2 h后；5：反應(yīng)4 h后；6：反應(yīng)6 h后；7：反應(yīng)8 h后；8：反應(yīng)12 h后；9：反應(yīng)24 h后

2.3 H198A突變型Tp0751水解纖維蛋白原的活性水解結(jié)果如圖5所示：Fg在與H198A突變型Tp0751 6 h后逐漸開始出現(xiàn)降解，但是反應(yīng)24 h后，尚存明顯的未被降解的蛋白帶。

2.4 H202A突變型Tp0751水解纖維蛋白原的活性水解結(jié)果如圖6所示：Fg在與H202A突變型Tp0751蛋白作用24 h后，F(xiàn)g基本上未被降解，突變型Tp0751蛋白也未見明顯降解。

圖5 H198A突變型Tp0751蛋白水解Fg結(jié)果圖 1：蛋白Mark；2：反應(yīng)0 h后；3：反應(yīng)1 h后；4：反應(yīng)2 h后；5：反應(yīng)4 h后；6：反應(yīng)6 h后；7：反應(yīng)8 h后；8：反應(yīng)12 h后；9：反應(yīng)24 h后

圖6 H202A突變型Tp0751蛋白水解Fg結(jié)果圖 1：蛋白Mark；2：反應(yīng)0 h后；3：反應(yīng)1 h后；4：反應(yīng)2 h后；5：反應(yīng)4 h后；6：反應(yīng)6 h后；7：反應(yīng)8 h后；8：反應(yīng)24 h后

3 討 論

Tp本身的代謝能力低下無法進(jìn)行體外的連續(xù)人工培養(yǎng)、缺乏遺傳可操作系統(tǒng)和外膜易脆性導(dǎo)致人們對Tp不能進(jìn)行遺傳操作，嚴(yán)重阻礙了人們從分子水平對Tp致病機制的研究[10]。Tp全基因序列解析[2]極大的促進(jìn)了人們對Tp基因結(jié)構(gòu)與功能的研究。Tp在感染宿主過程中，粘附是Tp感染機體的第一步，也是Tp在體內(nèi)定植和擴散的關(guān)鍵因素。Tp除了能黏附于許多宿主細(xì)胞上[4,10-14]，還能結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)；介導(dǎo)Tp與宿主細(xì)胞黏附的主要介質(zhì)之一便是細(xì)胞外基質(zhì)；導(dǎo)致梅毒廣泛傳播的主要原因則是Tp與各種細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合。目前已證實Tp0483[12]、Tp0136[15]、Tp0751[11,14]能吸附宿主細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等，這些蛋白被認(rèn)為是Tp的粘附素，其中最為重要、研究最多的是粘附素Tp0751。

最新研究表明Tp0751是具有雙重生物學(xué)功能的膜相關(guān)酶，不但參與粘附，還是一種依賴鋅的具有金屬酶樣活性的能水解組織成分的蛋白，其與Tp感染后擴散密切相關(guān)[5]。HEXXH活性區(qū)為金屬蛋白酶金屬離子依賴的活性區(qū)，其與細(xì)菌許多蛋白降解活性相關(guān)。Tp0751金屬蛋白酶的水解活性是否與該區(qū)域有關(guān)尚有待研究和探索。本研究擬通過構(gòu)建和表達(dá)野生和突變型Tp0751蛋白，分別對其水解Fg的活性進(jìn)行研究，進(jìn)行其金屬酶水解活性區(qū)的探索，為深入研究Tp致病機制奠定基礎(chǔ)和提供實驗依據(jù)。

本研究通過體外研究野生型Tp0751蛋白及其突變體蛋白對人纖維蛋白原Fg的水解情況，從蛋白結(jié)構(gòu)方面入手進(jìn)而研究其水解細(xì)胞外基質(zhì)成分的能力；本研究選擇了金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域HEXXH中198位的H及202位的H作為突變位點,Tp的天然宿主人類的細(xì)胞外基質(zhì)成分纖維蛋白原作為基質(zhì)，通過定時吸取目的蛋白與纖維蛋白原反應(yīng)物進(jìn)行SDS-PAGE分析顯示Fg水解程度的判斷，從而確定目的蛋白的水解能力。

研究結(jié)果顯示：蛋白與纖維蛋白原反應(yīng)24小時后，與wt-Tp0751蛋白作用的纖維蛋白原能被完全降解；而與H198A突變體蛋白作用的纖維蛋白原還有明顯的未被降解的蛋白帶存在；與H202A突變體蛋白作用的纖維蛋白原則基本上未被降解。同wt-Tp0751相比，H198A突變體蛋白水解Fg的活性明顯減弱，但仍存在一定的水解能力，H202A突變體蛋白幾乎不存在水解Fg的能力。結(jié)果提示Tp金屬蛋白酶HEXXH結(jié)構(gòu)域中，202位H可能與Tp0751降解細(xì)胞外成分的活性有關(guān)，而108位的H可能與之降解活性無關(guān)，但是至于該結(jié)構(gòu)域其它位點是否也與蛋白水解活性有關(guān)，各位點間對Fg的水解是否存在協(xié)同作用亦或是抑制作用我們尚不得而知。為了進(jìn)一步探索其水解活性功能域，有必要對HEXXH結(jié)構(gòu)域其它位點突變體蛋白對蛋白水解Fg能力進(jìn)行研究。

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TheFibrinolyticPotentialofTreponemaPallidumMetalloprotease

LIU Shuangquan

(TheFirstAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the fibrinolytic potential of Treponema pallidum metalloprotease Tp0751,providing the experimental basis for further research on syphilis pathogenic mechanism.MethodsConstructed the H198A mutant Tp0751 and H202A mutant Tp0751 with two-point technology.Wide-type and Mutant Tp0751 recombinant protein were expressed in E.coli BL21.And detected their degradation activity to fibrinogen.ResultsThree fusion protein with molecular weight about 26KDa were attained after expression and purification,The wild type Tp0751 can degradate plasminogen-free human fibrinogen,fibrinogen was absolutely degradated 24h post-incubation,The H198A mutant Tp0751 can also degradate plasminogen-free human fibrinogen,but which was partly degradated 24h post-incubation;The H202A mutant Tp0751 can not degradate plasminogen-free human fibrinogen,fibrinogen was scarcely degradated 24h post-incubation.ConclusionThe wild type Tp0751 can degradate plasminogen-free human fibrinogen,The HEXXH motif may have a important role on Tp0751 to the degradation of plasminogen-free human fibrinogen,residue H202,but not H198,from the pallilysin HEXXH motif is required for fibrinogen degradation.

Treponema pallidum; metalloprotease; Tp0751; fibrinolytic potential; Pathogenic mechanism

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.003

2015-04-10；

2015-06-30

國家自然科學(xué)基金(No.81201331)；湖南省自然科學(xué)基金重點項目(No.11JJ4076)；湖南省教育廳青年基金(No.11B107).

R377.1

A

(此文編輯：秦旭平)