張培文，趙 雪，何 玲，巫小倩，張順華，朱 礪

（四川農業(yè)大學動物科技學院，四川雅安 625014）

四川省引進外種豬群體的ESR基因PvuⅡ位點多態(tài)性分析

張培文，趙 雪，何 玲，巫小倩，張順華，朱 礪*1

（四川農業(yè)大學動物科技學院，四川雅安 625014）

采用PCR-RFLPs方法，對四川引進外種豬（杜洛克、長白豬和約克夏）ESR基因的多態(tài)性進行研究。并對ESR基因的基因頻率和基因型頻率進行分析，結果表明：杜洛克出現了AA、AB、BB3種基因型，基因型頻率分別為76.32%、18.42%和5.26%，A、B基因頻率分別為85.53%和14.47%；長白豬中僅出現AA和AB2種基因型，且基因型頻率分別為67.74%和32.26%，其中，等位基因A、B頻率分別為83.87%和16.13%；在約克夏中存在AA、AB、BB3種基因型，頻率分別為22.22%、61.90%和15.87%，等位基因A與等位基因B頻率相當，分別為53.18%和46.82%。

杜洛克；長白豬；約克夏；ESR基因；PCR-RFLP

0 引言

豬是世界上最重要的肉用動物之一，而中國既是養(yǎng)豬大國，也是豬肉消費大國。但在我國養(yǎng)豬業(yè)中，處于繁育體系“金字塔”頂端的核心種質群一直處于較為薄弱的狀態(tài)，對引種的依賴性較強。為了擺脫“引種-退化-再引種”的不良循環(huán)，我們應加強對引進種豬的再一次選育[1]。

豬的產仔數是極其重要的經濟性狀，提高母豬產仔數可增加商品肉豬的產量，給現代養(yǎng)豬業(yè)帶來非常大的經濟效益。目前，關于豬產仔數的研究中，報道了大量的主基因，如雌激素受體(ESR)基因、催乳素受體(PRLR)基因、卵泡促激素β亞基(FSHβ)基因、備解素(OPN)基因等。ESR基因是影響繁殖性能的重要功能基因，且該基因在國內外被廣泛研究，并運用于后備種豬的標記輔助選擇（MAS）[2-4]。

1994年， 美 國Iowa大 學 的Rothschild等[5-7]發(fā)現了豬雌激素受體基因（Estrogen receptor gene， ESR），并確定其是產仔數性狀的主效基因或者是與產仔數主效基因緊密連鎖的基因，并且找到了將ESR基因酶切為AA、AB、BB3種基因型的多態(tài)性位點PvuⅡ，研究發(fā)現，BB為優(yōu)勢基因型，且不同基因型的繁殖性能表現為BB＞AB＞AA的趨勢；等位基因B為優(yōu)勢基因。在此之后，大量的對不同豬種的研究得出了相同結論，盡管所研究的這些豬種存在著不同的遺傳背景[8-9]。本次試驗以319頭種豬（包括杜洛克38頭、長白豬155頭，約克夏126頭）的耳組織為樣本，提取耳組織中的DNA，采用PCR-RFLP分型技術對ESR基因進行檢測，從而分析引進種豬的ESR基因分布情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自四川某豬育種公司核心育種場新引進的種豬耳組織樣品（包括杜洛克38頭、長白豬155頭、約克夏126頭）。-20 ℃下75%酒精保存，用于基因組DNA制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

取火柴頭大小的豬耳組織樣品，放于75%的酒精中洗凈，在1.5 mL的離心管中剪碎，利用TIANGEN DNA提取試劑盒提取DNA，按照試劑盒步驟操作。獲取的DNA樣品放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增反應

引物合成。PCR引物序列參照文獻[7]，引物由華大基因合成：

Forward primer：5’-CCTGTTT TTACAGTGACTTTTACAGAG-3’

Reverse primer：5’-CACTTCGA GGGTCAGTCCAATTAG -3’

ESR基因的擴增，擴增反應總體積為25μL，其中TIANGEN 2×PreMasterMix 12.5μL；上游引物1μL；下游引物1μL；DNA模板2μL；DEPC水8.5μL。ESR基 因反應條件：第1步94℃預變性3min，第2步94℃變性30 s，第3步退火60 ℃ 30 s，第4步72 ℃延伸5 min，重復第2步到第4步35個循環(huán)，最后再72℃延伸5 min，于12 ℃保存。PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外檢測儀檢測照相并分析。

1.2.3 PvuⅡ酶切與電泳檢測

利用PvuⅡ酶對反應所得120bpESR基因進行酶切，整個反應體系為15μL，包括酶切反應緩沖液buffer1.5μL；擴增產物溶液10μL；限制性內切酶PvuⅡ0.5μL；加DEPC水至15.0μL。將混合液于37℃條件下水浴過夜（8 h以上）。將酶切后產物利用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈檢測儀檢測照相并分析。

2 結果與分析

2.1 ESR的PCR擴增

抽取PCR擴增產物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因的目的片段，所得片段大小120 bp（圖1）。圖譜上觀測無彌散和拖尾現象，表明擴增目的條帶效果良好，與期望結果一致。

2.2 ESR基因的酶切電泳分析

通過限制性內切酶PvuⅡ酶切，可能出現3種結果，分別為AA（120bp/120bp）、AB基 因 型（120bp/65bp、55bp）和BB基因型（ 65bp、55bp/65bp、55bp）。本試驗中，杜洛克（見圖2）、約克夏（見圖4）均出現了AA、AB、BB 3種基因型、而長白豬（見圖3）僅出現了AA、AB 2種基因型。（本次試驗中，由于所用瓊脂糖濃度較低，且電泳時間較短，導致55bp與65bp片段未分開）

2.3 ESR基因的群體遺傳特性分析

對杜洛克、長白豬、約克夏種豬的ESR基因利用PCR-RFLP技術進行基因分型，根據文獻中基因分型的判定標準[6]，3個豬種ESR基因的基因型分布以及群體遺傳特性分析結果見表1?？倶颖竞?19頭，包括杜洛克38頭、長白豬155頭，約克夏126頭。

圖1 ESR基因PCR產物電泳的結果

圖2 杜洛克ESR基因PCR-RFLPs 3%瓊脂糖凝膠電泳

圖3 長白豬ESR基因PCR-RFLPs 3%瓊脂糖凝膠電泳

圖4 約克夏ESR基因PCR-RFLPs 3%瓊脂糖凝膠電泳

由表1可知，杜洛克出現3種基因型，其中AA基因型頻率最高，為76.32%，其次為AB型，基因型頻率為18.42%，BB基因型僅為5.26%；且其A等位基因頻率高達85.53%。長白豬中，僅出現AA和AB 2種基因型，且AA基因型頻率為67.74%，AB基因型為32.26%；其中等位基因A的頻率為83.87%，等位基因B的頻率為16.13%。在約克夏中，基因型頻率最高的為AB基因型，頻率為61.90%，緊接著為AA基因型，為22.22%，最低的為BB基因型，頻率為15.87%，在約克夏中，等位基因A與等位基因B頻率相當，分別為53.18%和46.82%。

表1 ESR基因的基因頻率和基因型頻率的分布

3 討論

本次試驗所測得杜洛克等位基因B的頻率為14.47%，比田勇等[10]研究的47.06%低，而李鳳娥等[11]2000年試驗得出杜洛克B基因的頻率為0。在對長白豬的研究中，本次試驗所得B基因頻率為16.13%，之前有大量關于長白豬的研究中分別得出其等位基因B頻率為7.69%、19%、10%等[12]。對約克夏的研究中，張淑君等[13]報道了其B基因頻率為47.06%，后來田勇等[10]研究得出了相同結果，而本試驗中，所得B等位基因頻率為46.82%，比前人研究略低。導致這種結果的原因可能是試驗豬群以及樣本大小存在差異等。

ESR基因是影響豬繁殖性能的主效基因，是目前為止選擇產仔數最好的標記。據前人研究得出豬產仔數與ESR基因型之間有BB＞AB＞AA的趨勢[5-7]。劉建華等[14]對杜洛克、長白豬和約克夏ESR基因進行了研究，發(fā)現ESR基因對豬頭胎產仔數有顯著影響，BB和AA純合子頭胎總產仔數與活產仔數分別相差3.361和1.1913，每個等位基因B的加性效應分別是1.680和0.597。田勇等[10]研究發(fā)現，在杜洛克中，初產胎次B基因的加性效應為3.56和2.10，在經產胎次中B基因的加性效應為1.90和1.38；在長白豬中，初產胎次B基因的加性效應為2.70和1.25，在經產胎次中B基因的加性效應為1.62和2.24；在杜洛克中，初產胎次B基因的加性效應為2.29和1.92，在經產胎次中B基因的加性效應為0.76和1.15。

在本試驗中，在杜洛克、長白以及約克夏3個豬種中BB基因型頻率均低，分別為5.26%、0、15.87%；且在杜洛克與長白豬中，AA基因型頻率均大于60%；而在約克夏中AB基因型為主要基因型，占到61.90%。通過以上數據，我們可以對引進的這一批種豬的繁殖性能有一個大概的了解。我們應綜合種豬的其他性狀，并對ESR基因的優(yōu)勢等位基因B進行保留，對引進的種豬進行再一次選育。豬的繁殖性狀屬于低遺傳力性狀，非遺傳效應對其影響較大。因此，除了堅持遺傳標記輔助選擇外，還需要注意為種豬提供較好的營養(yǎng)、防疫及飼養(yǎng)環(huán)境等其他綜合的非遺傳條件，以確保種豬的最佳繁殖性能。

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2014-02-09)

國家科技支撐計劃項目（編號：2013BAD20B07），四川省科技支撐計劃項目（編號：2013NZ0041），科技部和四川省科技富民強縣項目資助

朱礪，教授，博士生導師，研究方向：豬的遺傳育種