韓文琦，甄宇紅，張樹彪，趙軼男，孫永，郭鑫，王恩霞，劉姿，孫耀庭

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陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)RNA干擾的效果評價

韓文琦1，甄宇紅1，張樹彪2，趙軼男2，孫永1，郭鑫1，王恩霞1，劉姿1，孫耀庭1

1 大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116044 2 大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用國家民委-教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600

韓文琦, 甄宇紅, 張樹彪, 等. 陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)RNA干擾的效果評價. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(8): 1239–1246.Han WQ, Zhen YH, Zhang SB, et al. Efficacy of RNA interference mediated by cationic liposomes. Chin J Biotech, 2015, 31(8): 1239–1246.

考察自制的肽型陽離子脂質(zhì)體CDO14作為RNA轉(zhuǎn)染載體的細胞毒性及其運載siRNA進行RNA干擾的效果。通過MTT法檢測脂質(zhì)體對穩(wěn)定表達熒光素酶的肺癌A549 (Luc-A549) 細胞的毒性。以脂質(zhì)體為載體將熒光素酶siRNA (Luc-siRNA) 轉(zhuǎn)染至Luc-A549細胞內(nèi)，用發(fā)光儀檢測轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)熒光素酶含量，BCA法檢測細胞內(nèi)總蛋白含量。在裸鼠腋下接種Luc-A549細胞，成瘤后尾靜脈注射Luc-siRNA和脂質(zhì)體的復(fù)合物，利用活體成像系統(tǒng)檢測模型小鼠體內(nèi)熒光素酶的表達量。細胞毒性實驗表明，自制脂質(zhì)體的毒性與商品脂質(zhì)體DOTAP相近，低于商品脂質(zhì)體Lipo2000；細胞轉(zhuǎn)染實驗表明自制脂質(zhì)體作為基因轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染效率高于DOTAP；體內(nèi)轉(zhuǎn)染實驗表明CDO14作為載體轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于DOTAP。結(jié)果表明，肽型陽離子脂質(zhì)體CDO14具有毒性小、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點，有望作為轉(zhuǎn)染載體用于基因治療。

陽離子脂質(zhì)體, 熒光素酶, A549細胞, RNA干擾

RNA干擾 (RNA interference，RNAi) 是生物體內(nèi)雙鏈RNA介導(dǎo)的同源mRNA降解現(xiàn)象，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制[1-2]。RNAi為特異性抑制目的基因的表達提供了有效的方法，目前主要應(yīng)用于調(diào)節(jié)目的基因功能，抗病毒和抗腫瘤的基因治療等領(lǐng)域[3-4]。RNAi研究近年發(fā)展迅速，但如何高效轉(zhuǎn)運siRNA，尤其是以較低濃度的siRNA高效沉默目的基因仍是一個急需解決的問題。

目前用于基因轉(zhuǎn)染的載體可分為病毒載體和非病毒載體。雖然病毒作為轉(zhuǎn)運載體具有效率高的優(yōu)點[5-7]，但存在免疫原性高、載體容量小和致癌性等缺點[8-10]，限制了它在臨床治療上的應(yīng)用。非病毒載體中最典型的是陽離子脂質(zhì)體 (Cationic liposomes)，具有可自然降解、無免疫原性、可重復(fù)轉(zhuǎn)染等優(yōu)點[11-15]，近年來備受研究者的重視，至今已有數(shù)十種陽離子脂質(zhì)體被研制出來[16]。本文將考察自制的肽型陽離子脂質(zhì)體CDO14 (圖1) 的毒性及其介導(dǎo)RNA干擾的效果。

圖1 陽離子脂質(zhì)體CDO14的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 siRNA與細胞株

siRNA購自Invitrogen公司；表達熒光素酶的人肺癌細胞A549 (Luc-A549) 由美國北卡羅萊納大學(xué)藥學(xué)院惠贈。

1.1.2 檢測試劑及化學(xué)試劑

脂質(zhì)體DOTAP和Lipo2000購自Life公司；CDO14自制；Luciferase Assay Kit購自Promega公司；D-luciferin Potassium Salt購自上?？七h迪生物科技有限公司。

1.1.3 實驗動物

4?6周雌性BALB/c-nude小鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)SPF動物中心，實驗動物使用許可證號：SCXK (遼) 2010-0002，于無特異致病原 (SPF) 的環(huán)境下飼養(yǎng)。動物飼養(yǎng)和使用符合實驗動物管理條例，動物實驗經(jīng)大連醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準。

1.1.4 實驗儀器

活體成像儀IVIS200購自美國Xenogen公司；發(fā)光儀GioMaxTM 96 Microplate Luminometer購自Promega公司；CO2培養(yǎng)箱購自上海智城分析儀器制造有限公司；酶標儀FC購自美國Thermol公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測脂質(zhì)體毒性

將Luc-A549細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL含10% FBS不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，接種4×103?5×103個細胞。將細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育16?24 h，使細胞密度達80%?90%左右。將DOTAP、Lipo2000、CDO14三種脂質(zhì)體分別用無血清DMEM稀釋，每種脂質(zhì)體均稀釋為0.06、0.006、0.000 6 mg/mL，室溫放置5 min，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加200 μL脂質(zhì)體稀釋液，在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育4?5 h后棄除脂質(zhì)體稀釋液，加入含F(xiàn)BS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL MTT，4?6 h后每孔加入100 μL三聯(lián)液繼續(xù)培養(yǎng)，12?20 h后用酶標儀檢測各孔在570 nm下的吸光值。

1.2.2 siRNA的合成

siRNA由Invitrogen公司合成，Luc-siRNA序列：正義5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAT T-3′，反義3′-TTGAAUGCGACUCAUGAAGC U-5′；陰性對照siRNA序列：正義5′-UUCUCCG AACGUGUCACGUTT-3′，反義3′-ACGUGACA CGUUCGGAGAATT-5′，此序列不與任何人類基因序列同源，命名為N-siRNA。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染

將A549細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入500 μL含10% FBS不含雙抗的DMEM，接種0.5×105?2×105個細胞，將細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育16?24 h使細胞密度達80%?90%左右。將1.5 μg Luc-siRNA或N-siRNA用PBS稀釋至50 μL，3 μg脂質(zhì)體DOTAP或CDO14用PBS稀釋至50 μL，將稀釋后的siRNA與脂質(zhì)體混合 (即質(zhì)量比1︰2)，制備的復(fù)合物在室溫放置20 min，然后每孔加入100 μL上述復(fù)合物轉(zhuǎn)染細胞。對照組不加siRNA，只加相同劑量的脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)染的細胞在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育4?5 h，吸棄原培養(yǎng)液，重新加入500 μL含10% FBS不含雙抗的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 發(fā)光值的測定

細胞轉(zhuǎn)染48 h后，去除孔中DMEM，用DPBS潤洗2次，每孔加入600 μL裂解液 (10%甘油，1% Triton-100溶于DPBS中)，室溫充分裂解20 min后，取細胞裂解液20 μL移至96孔白板中，加80 μL熒光素酶檢測液，使用發(fā)光儀測發(fā)光值，以發(fā)光值表示熒光素酶的量。

1.2.5 總蛋白含量的測定

將250 μL蛋白檢測試劑和5 μL細胞裂解液混勻，加到96孔透明板中，37 ℃孵育20 min。使用酶標儀測570 nm下吸光值，計算總蛋白 含量。

以熒光素酶含量/總蛋白含量 (RLU/mg) 表示細胞內(nèi)RNAi的效果。

1.2.6 裸鼠移植瘤模型的建立

取對數(shù)生長期Luc-A549細胞，用胰蛋白酶消化，離心、收集細胞后用PBS洗兩次。再次重懸后，用PBS調(diào)整體積，使?jié)舛冗_到 2×107cells/mL。在無菌室內(nèi)，將裸鼠常規(guī)消毒后，在前肢腋下皮下接種上述細胞，每只0.2 mL。接種后，定期觀察小鼠的精神、飲食及排便等情況，稱量小鼠體重。接種1周左右，可見接種部位皮下長出米粒大小的硬結(jié)，為移植瘤模型建成。接種15 d左右，瘤體積 (計算公式V=ab2/2，a和b分別代表移植瘤最大長徑和橫徑) 達到100?200 mm3，開始實驗。

1.2.7 裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染

將12只成瘤裸鼠隨機分為4組，每組3只，分別為空白對照組、陰性對照組、DOTAP轉(zhuǎn)染組、CDO14轉(zhuǎn)染組。每只裸鼠用量為8 μg siRNA和24 μg脂質(zhì)體，先將siRNA與脂質(zhì)體分別稀釋于42 μL與76 μL PBS中，然后將siRNA加到脂質(zhì)體中，混勻，制備的復(fù)合物室溫放置20 min后，給裸鼠尾靜脈注射進行體內(nèi)轉(zhuǎn)染。

1.2.8 裸鼠體重、瘤體積和活體成像檢測

于轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后48 h測量并記錄裸鼠體重，用游標卡尺測瘤大小，并計算瘤體積。活體成像檢測體內(nèi)熒光素酶的表達，裸鼠腹腔注射熒光素3 mg/20 g，自由活動15 min后用異氟烷麻醉，再進入活體成像系統(tǒng)拍照。以轉(zhuǎn)染前后小鼠瘤內(nèi)的凈光密度比表示體內(nèi)RNAi的 效果。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 脂質(zhì)體對Luc-A549細胞的毒性

在給藥48 h后，MTT法檢測細胞的存活率。由圖2可見，在脂質(zhì)體濃度為0.000 6 mg/mL時，不同脂質(zhì)體對細胞存活率的影響無顯著性差異；當脂質(zhì)體濃度為0.006 mg/mL時，DOTAP組和Lipo2000組細胞的存活率分別為80%和49%，CDO14組細胞的存活率為79%，自制脂質(zhì)體組細胞的存活率高于商品脂質(zhì)體Lipo2000 (<0.05)，與DOTAP相當；當脂質(zhì)體濃度為0.06 mg/mL時，各組的細胞存活率均較低，但CDO14組與DOTAP組相當，明顯高于Lipo2000組 (<0.05)?？梢?，自制脂質(zhì)體的毒性與DOTAP相當，低于Lipo2000，在后續(xù)的實驗中將采用DOTAP作為陽性對照。

圖2 不同脂質(zhì)體對Luc-A549細胞的毒性

2.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的細胞內(nèi)RNAi

將siRNA轉(zhuǎn)染至Luc-A549細胞，Luc-siRNA轉(zhuǎn)染組熒光素酶的表達量明顯低于N-siRNA轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染siRNA組 (<0.05)，N-siRNA轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染siRNA組間無明顯差異，表明合成的Luc-siRNA可在轉(zhuǎn)錄水平上抑制熒光素酶報告基因的表達 (圖3)。

兩種脂質(zhì)體介導(dǎo)的Luc-siRNA轉(zhuǎn)染組熒光素酶的表達量明顯低于無脂質(zhì)體組 (<0.05)；以CDO14為載體組Luc-A549細胞的熒光素酶表達量明顯低于以DOTAP為載體組 (<0.05) (圖3)。

2.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)小鼠體內(nèi)RNAi

小鼠腋下接種Luc-A549細胞15 d后進行體內(nèi)轉(zhuǎn)染，分別在轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后48 h檢測小鼠體內(nèi)熒光素酶的表達量和小鼠的瘤體積。如圖 4所示，在小鼠腫瘤接種部位能觀察到熒光素酶的表達，Luc-RNAi特異性轉(zhuǎn)染組熒光素酶表達量在轉(zhuǎn)染后明顯降低。如圖5所示，隨著時間的推移，各組小鼠體內(nèi)腫瘤細胞增多，瘤體積增大；轉(zhuǎn)染48 h后，空白對照組和N-siRNA非特異性轉(zhuǎn)染組熒光素酶表達量隨著腫瘤體積的增加而升高，而兩種脂質(zhì)體介導(dǎo)的Luc-RNAi特異性轉(zhuǎn)染組熒光素酶表達量均顯著降低，以脂質(zhì)體CDO14介導(dǎo)的干擾效果更明顯。

圖3 不同脂質(zhì)體介導(dǎo)Luc-A549細胞內(nèi)Luc-RNAi

Luc-RNAi特異性轉(zhuǎn)染組與空白組及N-siRNA非特異性轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染前后瘤體積比例無顯著差異。說明Luc-RNAi并沒有影響腫瘤的大小，只是干擾了熒光素酶的表達。

圖4 不同脂質(zhì)體介導(dǎo)小鼠體內(nèi)Luc-RNAi

圖5 轉(zhuǎn)染后48 h與轉(zhuǎn)染前凈光密度比和瘤體積比

3 討論

RNAi是進化上保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默途徑，是一種具有巨大潛力的人類疾病治療工具，但如何高效運載siRNA進入靶組織已成為限制RNAi應(yīng)用的主要障礙[17]。陽離子脂質(zhì)體是一種由多聚陽離子磷脂和膽固醇構(gòu)成的表面帶有正電荷的脂質(zhì)體復(fù)合物，是目前公認的轉(zhuǎn)染效率較高的非病毒載體之一，但有一定的細胞毒 性[18]。其介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的機制為：帶正電荷的陽離子脂質(zhì)體通過靜電作用與帶負電的基因 (DNA或RNA) 形成脂質(zhì)體-基因復(fù)合物，通過細胞內(nèi)吞或細胞膜融合作用進入細胞內(nèi)，進一步釋放基因，從而在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯[19]。

肽型陽離子脂質(zhì)體與其他類型的陽離子脂質(zhì)體相比具有良好的生物降解能力和生物相容性，并具有靶向性，近年來受到廣泛關(guān)注[20-21]。陽離子脂質(zhì)體作為基因轉(zhuǎn)染載體，轉(zhuǎn)染效果與脂質(zhì)體的氨基酸、多肽等頭部有關(guān)，而連接鍵決定了其穩(wěn)定性和生物降解性[22-23]。本研究中考察的肽型陽離子脂質(zhì)體CDO14的極性頭部是由3個鳥氨酸形成的三肽；疏水尾部是兩個14碳烷基鏈，連接鍵為氨基甲酸酯。細胞毒性實驗表明該脂質(zhì)體的細胞毒性與常用的商品脂質(zhì)體DOTAP相近，其作為siRNA轉(zhuǎn)染載體，在體內(nèi)外的RNAi效果均優(yōu)于DOTAP。DOTAP的極性頭部是季銨鹽，其與基因的結(jié)合域比肽型頭部要小，因而其結(jié)合力可能會弱。此外，DOTAP中的連接鍵是酯鍵，而CDO14中的連接鍵是氨基甲酸酯鍵，相對而言后者具有更好的穩(wěn)定性。DOTAP的季銨鹽頭部可能使其毒性大于肽型頭部的脂質(zhì)體，我們在考察脂質(zhì)體對A549細胞毒性的實驗中得到的結(jié)果是二者毒性相近，但對于其他細胞及在體內(nèi)的毒性如何，還有待于深入研究。

為了評價體內(nèi)siRNA干擾效果，我們將穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株Luc-A549接種小鼠腋下，在裸鼠體內(nèi)穩(wěn)定成瘤，建立了表達熒光素酶的小鼠移植瘤模型。該模型與傳統(tǒng)的腫瘤動物模型相比，能夠通過活體成像技術(shù)在空間和時間分布上反映細胞內(nèi)熒光素酶的表達，便于檢測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況，同時可以對同一個研究個體進行長時間反復(fù)跟蹤成像，以便長期觀察，并減少了不同實驗動物之間的個體差異[24-25]。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明肽型陽離子脂質(zhì)體CDO14 與商品脂質(zhì)體相比具有毒性小、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點，有望作為轉(zhuǎn)染載體用于基因治療。但此類脂質(zhì)體在其他細胞中的毒性及轉(zhuǎn)染效果，以及其體內(nèi)毒性還需進一步研究。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Efficacy of RNA interference mediated by cationic liposomes

Wenqi Han1, Yuhong Zhen1, Shubiao Zhang2, Yinan Zhao2, Yong Sun1, Xin Guo1, Enxia Wang1, Zi Liu1, and Yaoting Sun1

1,,116044,,2,,116600,,

To investigate the cytotoxicity of the homemade peptide cationic liposome CDO14 and its efficacy of RNA interference (RNAi). MTT method was used to determine the cytotoxicity of the liposome to a human lung cancer cell line Luc-A549 that can express luciferase stably. Luciferase siRNA (Luc-siRNA) was transfected into Luc-A549 cells by CDO14. Contents of luciferase in the transfected cells were detected by luminous instrument and contents of total protein in these cells were detected by BCA method. Nude mice were inoculated with Luc-A549 cells in axilla to establish xenograft tumor model. Complexes of Luc-siRNA and the cationic liposomes were injected into the modeling mice via tail vein. Contents of luciferase in the transfected mice were detected by the whole body imaging system. The cytotoxicity of the homemade cationic liposome was similar to that of commercial liposome DOTAP, and lower than that of Lipo2000. The siRNA transfection efficacy mediated by CDO14 was higher than that mediated by DOTAP. The homemade peptide cationic liposome CDO14 is expected to serve as delivery vector in gene therapy because of its low cytotoxicity and high transfection efficiency.

cationic liposome, luciferase, A549 cell, RNAi

10.13345/j.cjb.140520

October 29, 2014; Accepted: December 10, 2014

National Natural Science Foundation of China (Nos. 20876027, 21176046), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA020707), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. DC12010104), Natural Science Foundation of Liaoning Province (No. 2013023037).

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2015-02-27

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150227.1139.005.html