張占軍，王富花，曾曉雄

（1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)生物與化工工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095；3.揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127）

薤白多糖抑瘤及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性研究

張占軍1，2，王富花3，曾曉雄2

（1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)生物與化工工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095；3.揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127）

采用MTT法對(duì)薤白多糖純化組分（AMP40-1、AMP40-2）在體外抑制人肺癌細(xì)胞A549和人胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖作用進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，AMP40-2對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，薤白多糖AMP40-1、AMP40-2均能不同程度的抑制BGC-823細(xì)胞的增殖，且抑制作用與多糖之間存在不同程度的正相關(guān)量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。通過大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12培養(yǎng)體系，對(duì)薤白多糖純化組分（AMP40-1、AMP40-2）進(jìn)行了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性研究。結(jié)果表明，薤白多糖AMP40-2對(duì)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞具有一定的促分化作用。

薤白多糖；癌細(xì)胞；增殖；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性

多糖是由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的多聚物，廣泛分布于自然界中，是一類重要的活性物質(zhì)。我國(guó)對(duì)多糖研究起步較晚，但隨著近年來(lái)生物學(xué)、化學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，我國(guó)對(duì)多糖及其復(fù)合物的研究越來(lái)越深入。多糖的生物活性受單糖組成、分子量、結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)、糖醛酸及硫酸基的含量等方面的影響較大[1-3]，使得多糖的活性呈多樣化。有關(guān)多糖抗腫瘤活性的報(bào)道較多，普遍認(rèn)為以（1→3）-β-D-葡聚糖和以（1→4）-β-D-葡聚糖占優(yōu)勢(shì)的多糖具有明顯的抗腫瘤活性[4]；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子因其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用，而有望用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，已報(bào)道的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子大多為蛋白質(zhì)，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的多糖報(bào)道較少，已報(bào)道的具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的多糖如刺梨多糖[5]和土黨參多糖[6]等。

蔥屬植物（Allium）屬百合科多年生草本植物，具有獨(dú)特的蔥蒜味。全世界己發(fā)現(xiàn)蔥屬植物700多種，我國(guó)蔥屬植物資源豐富，約有110多種，具有適應(yīng)性強(qiáng)，生存環(huán)境廣的特點(diǎn)。薤白為蔥屬多年生草本植物，多食用，其干燥鱗莖也可入藥。截至目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)薤白的研究多集中于小分子物質(zhì)，其藥理活性主要有抑制血小板聚集，抗抑郁[7]，抗菌，抗癌，解痙平喘[8]，鎮(zhèn)痛和耐缺氧以及降血糖、降血脂[9]等。而對(duì)薤白多糖藥理活性方面的研究較少。為了解薤白多糖的生理活性，正確評(píng)價(jià)薤白中的功效成分，本研究對(duì)薤白多糖抑制癌細(xì)胞增殖以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

薤白（野白頭）購(gòu)于安徽慧隆中藥飲片有限公司。

薤白多糖40%醇沉組分（AMP40-1、AMP40-2）按照文獻(xiàn)[10]所述的分離純化方法進(jìn)行制備。

1.2 菌種及細(xì)胞株

人胃癌BGC-823細(xì)胞株，人肺癌A549細(xì)胞株，大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞株均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要儀器及試劑

3111型Thermo Scientific Forma CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國(guó)Corning公司；Synergy-2型多功能酶標(biāo)儀：美國(guó) BioTek公司；NikonTS-100F倒置相差顯微鏡：日本尼康公司；GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-IBU型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；Series II 3110型細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo Scientific公司；DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清、丙酮酸鈉溶液、HEPES試劑購(gòu)自Gibco公司；噻唑藍(lán)（MTT）、0.25%EDTA-胰酶、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、青霉素-鏈霉素貯存溶液為Sigma產(chǎn)品。二甲基亞砜（DMSO）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂及牛肉膏、膽鹽、磷酸氫二鉀、蛋白胨、氯化鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.4 方法

1.4.1 薤白多糖的體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性研究

薤白多糖對(duì)人肺癌細(xì)胞A549及人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的抑制作用按照Mosman[11]和Sheng等[12]報(bào)道的方法稍有修改。

1.4.1.1 人肺癌細(xì)胞A549及人胃癌細(xì)胞BGC-823的培養(yǎng)

A549和BGC-823細(xì)胞株凍存管解凍后，將凍存液無(wú)菌轉(zhuǎn)移至含有5mLDMEM完全培養(yǎng)基中離心10min，傾去上清部分，沉淀部分加10mLDMEM完全培養(yǎng)基制取細(xì)胞懸浮液，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待貼壁生長(zhǎng)良好后，水平輕微搖晃并吸干培養(yǎng)液，加入適量胰酶（以液面蓋住細(xì)胞為宜），37℃條件下放置2min～3min，顯微鏡觀察使細(xì)胞消化適度，隨即吸干消化液，加入適量完全DMEM培養(yǎng)基，用吸管反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液。將以上細(xì)胞按需要稀釋后接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每2天～每3天左右傳代一次以保持細(xì)胞處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.4.1.2 細(xì)胞接種

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和BGC-823細(xì)胞按上述方法酶解、細(xì)胞計(jì)數(shù)法調(diào)整細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)/m L（A549細(xì)胞為5×104個(gè)/mL），然后接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL。以純DMEM完全培養(yǎng)基作為調(diào)零孔，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24h。

1.4.1.3 薤白多糖樣品對(duì)A549和BGC-823細(xì)胞增殖的抑制作用

以薤白多糖純化組分（AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1和AMP80-1）為實(shí)驗(yàn)樣品，對(duì)分別接種A549和BGC-823的細(xì)胞培養(yǎng)板預(yù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行加樣處理，用排槍每孔吸去50μL培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組和不同濃度（25、50、100、200、400μg/mL）的樣品組。正常對(duì)照組每孔加50μLDMEM培養(yǎng)液；樣品組分別加入終濃度為25、50、100、200、400μg/mL的薤白多糖純化組分溶液（用新鮮DMEM完全培養(yǎng)基溶解）各50μL/孔。人肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)72 h，人胃癌細(xì)胞BGC-823分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入10μL 5mg/mLMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心移去培養(yǎng)液，每孔加入100μL DMSO溶液溶解藍(lán)紫色結(jié)晶。水平晃動(dòng)搖勻后，用酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm波長(zhǎng)下的各孔的光吸收值（Abs），檢測(cè)不同多糖樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制情況，按下式計(jì)算多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率：

1.4.2 薤白多糖神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性研究

薤白多糖對(duì)PC-12細(xì)胞的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性按照Buchet[13]和Wu[14]等報(bào)道的方法略作修改。

1.4.2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)

PC12細(xì)胞采用高糖85%DMEM加12%胎牛血清、3%的馬血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)液，置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天～每3天換液一次，待單層細(xì)胞生長(zhǎng)到約80%匯合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4.2.2 細(xì)胞接種

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（培養(yǎng)液為3%的馬血清，12%胎牛血清，85% DMEM），調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)約為1×104，在37℃，5%CO2條件下預(yù)培養(yǎng)16 h。

1.4.2.3 薤白多糖對(duì)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞的分化作用

以薤白多糖純化組分（AMP40-1、AMP40-2）為實(shí)驗(yàn)樣品，對(duì)接種PC12的細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行加樣處理。吸去原培養(yǎng)液，分別加入終濃度為20μg/mL的薤白多糖樣品（AMP40-1、AMP40-2），終體積為200μL。同時(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和NGF對(duì)照組（NGF終濃度為100 ng/mL）。在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天～每4天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)14 d。定期用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，其中神經(jīng)突起長(zhǎng)度超過胞體直徑2倍以上的細(xì)胞被記為分化細(xì)胞。

2 結(jié)果與分析

2.1 薤白多糖的體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性

2.1.1 薤白多糖作用48 h對(duì)人肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)的抑制作用

薤白多糖40%醇沉純化組分AMP40-1、AMP40-2對(duì)人肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)的抑制作用如圖1所示。

圖1 薤白多糖作用48小時(shí)對(duì)人肺癌細(xì)胞A 549生長(zhǎng)的抑制作用Fig.1 Effectof AMPon grow th inhibition of human lung carcinoma A549 cells for 48 hours

從圖1可以看出，AMP40-1未發(fā)現(xiàn)對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)有抑制作用，而AMP40-2對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)其抑制作用與濃度呈明顯的濃度依賴效應(yīng)。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多糖對(duì)人肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)的抑制率普遍較低，如Sheng等[12]報(bào)道的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）多糖CPPSIa在濃度600μg/mL作用48 h后對(duì)A549的抑制率也只有37.6%；Ye等[15]報(bào)道的馬尾藻多糖組分SPP-3-1與SPP-3-2的抑制率在濃度為 1.0 mg/mL時(shí)抑制率分別為64.81%和66.99%。相比其它多糖，薤白多糖AMP40-2在濃度400μg/mL作用48 h后抑制率能達(dá)到27.52%，表明其對(duì)人肺癌細(xì)胞A549具有較好的抑制活性。與AMP40-1相比，AMP40-2對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的抑制作用存在明顯的差異，這可能是由于在分子量、單糖組成、糖連接方式及糖醛酸含量等方面的差異造成的。

2.1.2 薤白多糖對(duì)人肺癌細(xì)胞BGC-823生長(zhǎng)的抑制作用

薤白多糖40%醇沉純化組分AMP40-1、AMP40-2對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823作用24小時(shí)后增殖的影響如圖2所示。

圖2 薤白多糖作用24小時(shí)對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823生長(zhǎng)的抑制作用Fig.2 Effect of AM P on grow th inhibition of human gastric carcinoma BGC-823 cells for 24 hours

從圖2可以看出，純化組分AMP40-1和AMP40-2對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，其中AMP40-2的抑制作用與濃度在一定范圍內(nèi)呈明顯的正相關(guān)量效關(guān)系。AMP40-2對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的抑制作用在濃度400μg/mL作用24小時(shí)后抑制率達(dá)到29.88%，顯著要高于AMP40-1的7.38%。

薤白多糖 40%醇沉純化組分 AMP40-1和AMP40-2對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823作用48h后的抑制作用如圖3所示。

圖3 薤白多糖作用48小時(shí)對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823生長(zhǎng)的抑制作用Fig.3 Effectof AMPon grow th inhibition of human gastric carcinoma BGC-823 cells for 48 hours

從圖3可以看出，純化組分AMP40-1和AMP40-2對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的生長(zhǎng)均起到一定的抑制作用，且組分AMP40-1、AMP40-2的抑制作用與濃度在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)呈明顯的正相關(guān)量效關(guān)系。與作用24 h一樣，AMP40-2對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的抑制作用明顯強(qiáng)于其它組分，在濃度400μg/mL時(shí)，它們對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制率分別為72.01%和48.46%。

薤白多糖純化組分AMP40-1、AMP40-2對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823作用72 h后的抑制作用如圖4所示。

圖4 薤白多糖作用72小時(shí)對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823生長(zhǎng)的抑制作用Fig.4 Effect of AM P on grow th inhibition of human gastric carcinoma BGC-823 cells for 72 hours

從圖4可以看出，40%醇沉純化組分AMP40-1和AMP40-2對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用，且AMP40-1和AMP40-2的抑制作用與濃度在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)呈明顯的正相關(guān)量效關(guān)系。與作用24、48 h一樣，AMP40-2對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的抑制作用明顯強(qiáng)于AMP40-1，在濃度400μg/m L時(shí)，它們對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到85.95%和52.63%。此結(jié)果也進(jìn)一步表明薤白多糖對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的抑制作用的強(qiáng)弱與其多糖分子量的大小、糖醛酸含量以及單糖組成等因素存在明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2.2 薤白多糖對(duì)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞的分化作用

通過大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12培養(yǎng)體系，以NGF為陽(yáng)性對(duì)照，分別加入薤白多糖后連續(xù)培養(yǎng)14 d后在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行顯微照相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 薤白多糖對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞分化的影響Fig.5 Effect of AM P on differen tiation of ratadrenal pheochrom ocytoma PC12 cells

PC12細(xì)胞模型常被用于研究神經(jīng)元的發(fā)育、分化和功能。PC12細(xì)胞表面分布有豐富的NGF受體，該細(xì)胞受到NGF樣活性物質(zhì)刺激后會(huì)停止細(xì)胞分裂，長(zhǎng)出神經(jīng)突起，成為交感神經(jīng)細(xì)胞元樣的細(xì)胞[5]。從圖5可以看出，AMP40-1和空白對(duì)照組細(xì)胞呈球形，均未長(zhǎng)出突起，AMP40-2部分長(zhǎng)出神經(jīng)樣纖維，NGF陽(yáng)性對(duì)照組大量長(zhǎng)出神經(jīng)樣纖維。說明薤白多糖AMP40-2對(duì)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞具有一定的促分化作用，即AMP40-2具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。

3 結(jié)論與展望

腫瘤是當(dāng)今世界直接危及人類生命的一種最常見、最嚴(yán)重的疾病，因而如何有效地預(yù)防和治療腫瘤已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)[16]。19世紀(jì)60年代Chihara首次報(bào)道了有關(guān)大型真菌多糖的抗癌活性，此后，研究人員陸續(xù)分離得到了各種結(jié)構(gòu)的具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的多糖。不同于傳統(tǒng)的抗癌藥物，這些物質(zhì)是通過激活機(jī)體各種免疫反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生抗腫瘤作用，因此對(duì)機(jī)體并不會(huì)造成傷害[17]。本研究發(fā)現(xiàn)薤白多糖對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823存在較強(qiáng)的抑制作用，由于AMP40-1和AMP40-2在分子量大小、糖醛酸含量及單糖組成等方面存在著較大區(qū)別，結(jié)果也進(jìn)一步表明了多糖抗癌活性的強(qiáng)弱與上述因素存在明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。另一方面，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子大多為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，有關(guān)多糖的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性報(bào)道的并不多，盡管相對(duì)于NGF，薤白多糖AMP40-2的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性還較弱，但通過多糖神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的研究，對(duì)于豐富神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子類物質(zhì)的認(rèn)識(shí)以及開發(fā)多糖的新用途具有重要意義。

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The An titum or Activity and Neurotrophic Activity of Polysaccharides from Allium macrostemon Bunge

ZHANGZhan-jun1，2，WANGFu-hua3，ZENGXiao-xiong2
（1.College of Biologicaland Chemical Engineering，Yangzhou VocationalUniversity，Yangzhou 225009，Jiangsu，China；2.Collegeof Food Science and Technology，Nanjing AgriculturalUniversity，Nanjing 210095，Jiangsu，China；3.Yangzhou Polytechnology Institute，Yangzhou 225127，Jiangsu，China）

MTTassaywasused to investigate the anti-proliferation activitiesagainsthuman gastric cancer cells（BGC-823）and human lungadenocarcinoma epithelialcells（A549）in vitroof AMP40-1 and AMP40-2.The results showed that AMP40-2 inhibited proliferation of A549 in a dose-dependentmanner.For human gastric carcinoma cell BGC-823，AMP40-1 and AMP40-2 significantly inhibited proliferation in dose-dependentand time-dependent manner.The neurotrophic activity of polysaccharides from A.macrostemon Bunge were investingated by PC12 cell assay.The screening results showed that AMP40-2 induced the differentiation of PC12 celland hasobviousneurotrophic activity.

polysaccharide from Allium macrostemon bunge；cancer cells；proliferation；neurotrophic activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.026

2013-12-09

江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自然科學(xué)基金）項(xiàng)目（BK20141269）；江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”（蘇教師[2012]39號(hào)）

張占軍（1977—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。