曾 杰朱 琳龔金秋陳 強(qiáng)楊利國王水蓮*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙 410128;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070)

繁殖育種

促性腺激素抑制激素對動(dòng)物繁殖的影響

曾 杰1朱 琳1龔金秋1陳 強(qiáng)1楊利國2王水蓮1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙 410128;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070)

促性腺激素抑制激素（GnIH）是首次發(fā)現(xiàn)于日本鵪鶉下丘腦的神經(jīng)肽，通過一種G蛋白偶聯(lián)受體（GPR147）作用于垂體及GnRH神經(jīng)元，從而降低促性腺激素合成和釋放、抑制性腺發(fā)育和維持。本文結(jié)合GnIH的分布特點(diǎn)以及在性腺細(xì)胞中的作用方式，闡述了影響動(dòng)物GnIH合成與表達(dá)的影響因素以及其對不同種類動(dòng)物的生殖的調(diào)控作用，表明GnIH在動(dòng)物的繁殖活動(dòng)中扮演重要的角色，為臨床上對動(dòng)物的生殖調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

GnIH GPR147 合成表達(dá) 生殖調(diào)控

促性腺激素抑制激素是2000年Tsutsui及其同事于日本鵪鶇下丘腦發(fā)現(xiàn)的一種含有12個(gè)氨基酸的精氨酰-苯丙酰胺（RF酰胺）神經(jīng)肽，其作用受體為G蛋白偶聯(lián)受體147（GPR147）。通過減少性腺激素的合成與釋放作用，從而對動(dòng)物的繁殖進(jìn)行調(diào)控，故將其命名為促性腺激素抑制激素。此后，GnIH及其同系物于各類動(dòng)物中相繼被發(fā)現(xiàn)，因它們都擁有特征性的C端氨基酸序列LPXRF（X=L或P），故被稱為RF酰胺相關(guān)肽（RFRPs），在哺乳動(dòng)物中RFRP基因至少能編碼兩種生物學(xué)上有效的GnIH同源肽分別為RFRP-1和RFRP-3，RFRP-2在大鼠和牛的下丘腦中相繼被鑒定出來卻并非RF酰胺相關(guān)肽。GnIH的發(fā)現(xiàn)，證明GnRH并不是唯一能直接影響垂體促性腺激素釋放的下丘腦神經(jīng)肽。

1 GnlH的分布

在鳥類中，對斑馬雀腦GnIH通過原位雜交及免疫組化分析表明，GnIH的mRNA及多肽位于視旁核和下丘腦核背內(nèi)側(cè)。熒光顯微免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，免疫陽性的GnIH神經(jīng)元廣泛的分布于腦中多個(gè)區(qū)域，包括隔膜、視前區(qū)、正中隆起、視頂蓋等區(qū)域；在中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、中腦中央灰質(zhì)區(qū)、髓質(zhì)迷走神經(jīng)背側(cè)等區(qū)域集中分布且在海馬區(qū)等處也有分布。在白冠雀腦中，通過免疫組化的結(jié)果顯示 GnIH神經(jīng)元主要聚集在下丘腦的室旁核區(qū)域，也有一些分散在腦腹中隔區(qū)，而其神經(jīng)纖維分布廣泛，在下丘腦的正中隆起（ME）處最為密集，且在鳥類的大腦中呈相似的分布情況。在哺乳動(dòng)物中，免疫陽性的RFRP-3神經(jīng)元主要集中在下丘腦的背內(nèi)側(cè)核（DMH），而神經(jīng)纖維網(wǎng)在視前區(qū)、視旁核等處均有分布。

2 影響GnlH的合成與表達(dá)的因素

2.1 褪黑素（MLT）的影響

褪黑素是位于腦室中松果體分泌的一種吲哚類激素，主要通過G蛋白偶聯(lián)受體的介導(dǎo)對動(dòng)物繁殖功能發(fā)揮調(diào)控作用，Vishwajit等利用松果體摘除術(shù)結(jié)合眼摘除術(shù)，發(fā)現(xiàn)GnIH的mRNA前體以及成熟CnIH在下丘腦中的合成減少。利用黑暗和光照的不同條件對鵪鶉進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)GnIH的mRNA的合成以及GnIH的釋放在黑暗期間比在白晝更多。相反，血漿促黃體激素（LH）濃度在黑暗期間有所下降，從而證明褪黑激素能作用于GnIH神經(jīng)元，不僅刺激GnIH合成和釋放，而且抑制鳥類血漿LH濃度。Chowdhury等也發(fā)現(xiàn)褪黑素不僅可以調(diào)控GnIH的釋放，還可以影響GnIH的表達(dá)。因此，褪黑素可影響GnIH的合成與表達(dá)，并呈現(xiàn)光周期性的調(diào)節(jié)。

2.2 季節(jié)性的影響

季節(jié)性對于GnIH有重要的影響。Rebecca等通過在春秋兩季分別分析家麻雀中GnIH對壓力的反應(yīng)，利用免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法，發(fā)現(xiàn)GnIH對于壓力的反應(yīng)在兩個(gè)季節(jié)中有很大的不同，在秋季GnIH的陽性神經(jīng)元更多，然而GnIH陽性神經(jīng)元只在春季有顯著的增加。同樣，通過測定金魚垂體LH-β、FSH-β亞基mRNA以及GnIH受體mRNA的變化，發(fā)現(xiàn)GnIH的合成與分泌明顯受到季節(jié)的影響。

2.3 激素的影響

性激素的釋放對于動(dòng)物的生長發(fā)育具有重要作用，Takeshi等研究了大鼠在其生長發(fā)育階段下丘腦中RFRP的mRNA和其同源受體（GRP-147）mRNA的生理變化，以及性激素對RFRP mRNA及其受體mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，在雌激素濃度低的性成熟期前，卵巢雌激素可促進(jìn)RFRP mRNA的表達(dá)?？梢娫诖笫蟮纳L發(fā)育期間，隨著雌激素濃度的改變，會(huì)使得下丘腦的RFRP系統(tǒng)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，從而影響成熟期前雌性大鼠RFRP mRNA的表達(dá)水平。

利用下丘腦RFRP表達(dá)細(xì)胞模型（rHypoE-23），Nicole等研究了類固醇介導(dǎo)的RFRP的調(diào)節(jié)和GRP-147的轉(zhuǎn)錄合成，發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素興奮劑地米塞松可以提高RFRP和GRP-147的mRNA的水平，其機(jī)制是地米塞松直接作用于糖皮質(zhì)激素受體原子核，從而調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素（GC）轉(zhuǎn)錄的變化，并獨(dú)立完成新蛋白合成。表明通過糖皮質(zhì)激素受體依賴的機(jī)制，RFRP-表達(dá)神經(jīng)元可作為潛在應(yīng)激反應(yīng)的上游介質(zhì)。

Tobari等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)性活躍期間的雄性鵪鶉下丘腦室旁核中的去甲腎上腺素（NE）分泌的快速增加，使得下丘腦室旁核中GnIH的前體mRNA的表達(dá)增加以及血漿中促黃體生成素（LH）的濃度降低。熒光雙標(biāo)記免疫組化顯示 GnIH 神經(jīng)元受到NE的神經(jīng)支配，利用免疫組化與原位雜交相結(jié)合進(jìn)一步顯示 GnIH 神經(jīng)元可表達(dá)α2A-腎上腺素能受體 mRNA。這些結(jié)果表明，室旁核NE釋放增加會(huì)刺激 GnIH 釋放，從而抑制性活躍雄性鵪鶉的LH釋放。

2.4 發(fā)育階段的影響

對于在不同的生長發(fā)育階段以及發(fā)情周期的動(dòng)物，GnIH的合成與表達(dá)具有差異性。Zhao等通過克隆黑線倉鼠下丘腦cDNA，以及記錄黑線倉鼠下丘腦RFRP mRNA和GnRH mRNA在不同時(shí)間段的表達(dá)量，利用FO-RNA分析技術(shù)進(jìn)行分析研究后發(fā)現(xiàn)，在13周時(shí)雌性黑線倉鼠出現(xiàn)發(fā)情及繁殖現(xiàn)象，而另外兩時(shí)間沒有。雄性倉鼠下丘腦RFRP mRNA的含量在繁殖期間顯著于非繁殖期間。相反，雌性倉鼠RFRP的mRNA在繁殖期的含量最低，無論雌性還是雄性在7周時(shí)GnRH的mRNA的水平最高。表明性別的差異以及是否處于繁殖階段，對于倉鼠的GnIH的合成和表達(dá)都呈現(xiàn)差異性。

Sumit等也通過研究不同年齡段的小鼠免疫反應(yīng)的RFRP-3的活性，發(fā)現(xiàn)下丘腦背內(nèi)側(cè)核的免疫陽性RFRP-3的極度活躍出現(xiàn)在性成熟期前的小鼠，而在繁殖活躍期的小鼠中呈現(xiàn)下降，隨著小鼠年齡增長，繁殖行為減少時(shí)，RFRP-3活性又會(huì)出現(xiàn)增加。在小鼠出生后的一周中RFRP-3沒有調(diào)節(jié)作用，之后RFRP-3才參與性腺的調(diào)節(jié)過程，而且小鼠的年齡與RFRP-3神經(jīng)元和性腺活性呈現(xiàn)相反的相關(guān)性。在豬的發(fā)情周期中，下丘腦中的GnIH及其受體的

表1 日糧配方表

4.5 影響犀鳥繁殖率的其他因素分析

此次犀鳥的繁殖成功是從中藥及食補(bǔ)方面入手研究的，關(guān)于環(huán)境氣候及其他方面的影響因素并未考慮在內(nèi)，從多方面考慮或許可以再次提高犀鳥的繁殖率，這需要進(jìn)一步的總結(jié)研究。

[1]闕騰程，胡艷玲.籠養(yǎng)雄性冠斑犀鳥繁殖期取食與哺育活動(dòng)研究[J].廣西科學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，（1）：23-26.

[2]王什.觀賞鳥催情飼料加工方法[J].農(nóng)村新技術(shù)：加工版，2010，（14）：42-43.

[3]袁劍峰，于柏健.花冠皺盔犀鳥的馴養(yǎng)[J].野生動(dòng)物學(xué)報(bào)，1999，（4）：20-21. mRNA水平在發(fā)情期最低，而在發(fā)情前期及間情期含量最高。可見，無論是倉鼠、小鼠還是豬的GnIH的合成與表達(dá)，與不同生長發(fā)育階段都會(huì)有很大的差異。

3 GnlH對動(dòng)物繁殖活動(dòng)的作用

GnRH的釋放從下丘腦的視前區(qū)到正中隆起，使腦垂體分泌促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）進(jìn)入血液中。LH進(jìn)入性腺，刺激雌激素和雄激素等生殖激素的生成，而FSH則刺激配子的形成，而性激素與大腦和垂體通過丘腦-垂體-性腺軸（HPG）對動(dòng)物生殖及相關(guān)行為進(jìn)行調(diào)節(jié)。而后眾多的研究中也證實(shí)了GnIH對于動(dòng)物繁殖的重要調(diào)節(jié)作用。

3.1 對硬骨魚繁殖的作用

Qi等以金魚為研究對象，通過腹腔內(nèi)注射人工合成的兩種GnIH肽，體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GnIH-II與GnIH-III均可明顯減少下丘腦中GnRH以及垂體中FSHβ的mRNA水平，而只有GnIH-II對LHβ的mRNA有明顯的抑制作用；在體外實(shí)驗(yàn)中則發(fā)現(xiàn)GnIH-III只有對GnRH刺激性的FSHβ的合成起到抑制作用。

3.2 對鳥類繁殖的作用

在雞中，GnIH通過自分泌或旁分泌的方式作用于其受體，可能干擾LH和FSH的信號(hào)傳導(dǎo)，從而影響卵泡的成熟、募集以及精子的發(fā)生。因此，對鳥類的繁殖具有重要的調(diào)控作用。研究表明，在GnIH的影響下，睪丸分泌的睪酮量急劇下降，證明了在雄性家雀中，GnIH可表達(dá)于睪丸，對睪丸分泌睪酮產(chǎn)生抑制作用。

3.3 對哺乳動(dòng)物繁殖的作用

Smith通過對羊的季節(jié)性繁殖發(fā)現(xiàn)，GnIH在羊的繁殖季節(jié)開始顯著地下降，此外與GnRH神經(jīng)元緊密相接的GnIH纖維在此期間也明顯減少。因此，外源注射GnIH可以阻礙在繁殖季節(jié)中LH的脈沖式釋放和排卵期前LH的劇烈升高，從而對羊的季節(jié)性繁殖起到調(diào)節(jié)的作用。Li等就母豬體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)合放射性免疫測定，發(fā)現(xiàn)RFRP-3的作用受體GRP-147在母豬的下丘腦、垂體前葉以及卵巢顆粒細(xì)胞中均有分布。然后以不同濃度的RFRP-3感染體外培養(yǎng)的下丘腦細(xì)胞、垂體細(xì)胞以及顆粒細(xì)胞，并測定其下丘腦細(xì)胞GnRH的釋放量，垂體細(xì)胞LH和FSH的釋放以及顆粒細(xì)胞雌二醇（E2）以及黃體酮（P4）的分泌量，發(fā)現(xiàn)在合適的濃度條件下，GnRH、LH、FSH、E2以及P4的釋放量均會(huì)明顯的下降?？梢奊nIH在動(dòng)物繁殖中的重要調(diào)控作用。

4 GnlH的作用機(jī)制

為了闡明GnIH在鳥類中的作用模式，Yin等從鵪鶉的間腦中分離出GnIH受體，并測定了其表達(dá)與活性。通過與GPR-147的序列對比發(fā)現(xiàn)，GPR-147即為GnIH的受體，并表明GnIH的C末端核苷酸序列LPXRF對于識(shí)別受體具有重要的作用。后來Son等進(jìn)一步利用小鼠促性腺激素細(xì)胞系LβT2為對象，闡述GnIH細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及與GnRH信號(hào)的相互作用的方式，他們通過記錄GnIH受體 mRNA在LβT2的表達(dá)，結(jié)合cAMP的表達(dá)水平的檢測，發(fā)現(xiàn)小鼠的GnIH顯著的抑制了誘導(dǎo)GnRH釋放的信號(hào)。測定cAMP的水平顯示小鼠GnIH是腺苷酸環(huán)化酶（AC）的抑制因子，并且GnIH抑制刺激GnRH活性的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）的磷酸化作用和促性腺激素亞基的基因翻譯過程。AC與cAMP的蛋白激酶A（PKA）通路的抑制因子MDL和H89，可以抑制刺激GnRH促性腺激素的表達(dá)；相反，蛋白激酶C（PKC）的抑制因子GF不能抑制GnRH刺激的促性腺激素的表達(dá)。這表明在小鼠的LβT2細(xì)胞系中，GnIH抑制誘導(dǎo)GnRH促性腺激素亞基因的翻譯，是通過抑制AC/cAMP/ PKA依賴性的ERK活性來完成的。

5 展望

GnIH作為又一種調(diào)節(jié)生殖類激素的神經(jīng)肽，對其在不同物種中的結(jié)構(gòu)、組成、分布以及作用機(jī)理的研究也越來越多，而且對生殖調(diào)控的作用無論是在禽類、魚類還是在哺乳類中都得到了證實(shí)。然而，由于GnIH神經(jīng)元和神經(jīng)纖維以及作用受體在動(dòng)物腦內(nèi)分布廣泛，GnIH的合成、釋放與表達(dá)的過程中，各信號(hào)的傳導(dǎo)過程受到體內(nèi)外各因素的影響，再加上由于物種的差異性，其合成、釋放及表達(dá)的方式也不相同，因此對于GnIH的影響還有很多因素沒有發(fā)現(xiàn)，且這些因素的影響機(jī)制也尚不明確。同時(shí)GnIH的神經(jīng)纖維及其受體的分布表明，GnIH對其他的生理活動(dòng)也會(huì)產(chǎn)生重要的影響，而目前對于GnIH在生殖調(diào)控上的臨床應(yīng)用還很少，有待更進(jìn)一步研究。

曾杰（1990-），男，湖北恩施人，碩士，主要從事動(dòng)物生殖與生理研究。

王水蓮，女，博士，教授，主要從事動(dòng)物生殖調(diào)控與生殖免疫研究。