·生命科學·

尿酸酶突變體的高通量篩選方法

廖娟1,劉紅博2,高昂2,楊曉蘭2,李元麗2,廖飛2

(1.重慶醫(yī)科大學 附屬永川醫(yī)院中心實驗室,重慶402160;2.重慶醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室,重慶400016)

摘要：建立一種尿酸酶突變體的高通量篩選方法。將野生型苛求芽孢桿菌尿酸酶及其突變體的表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌,每個克隆誘導培養(yǎng)后超聲裂解上清液為樣品,全自動酶標儀測定293 nm光吸收,并分析反應啟動后8～28 min的數(shù)據(jù)計算酶活性,Bradford法測定總蛋白; ROC比較用酶活性或比活性識別陽性突變體的可靠性。任2種突變體酶活性或比活性比值>2時,ROC分析曲線下面積接近1;當酶活性或比活性僅增加50%時,分析比活性所得曲線下面積比分析酶活性更大，將ROC分析比活性提高近1倍。突變體敏感度達90%時，比活性為判斷陽性突變體閾值,其相當于以起始物比活性均值加1.7倍標準差;此閾值能用于高通量篩選變體庫中比活性增加1倍以上的陽性突變體。

關鍵詞：尿酸酶;比活性;陽性突變體;通用閾值

收稿日期：2014-10-21

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30672009);教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃基金資助項目(NCET-09-0928),重慶市科委重點基金資助項目(CSTC2011BA5039)

作者簡介：廖娟,女,重慶市人，從事體外診斷與藥物篩選生物技術研究。

中圖分類號：Q55

A high-throughput method for recognizing Uricase

mutants of higher activity

LIAO Juan1, LIU Hong-bo2, GAO Ang2,YANG Xiao-lang2, LI Yuan-li2, LIAO Fei2

(1.Central Laboratory, of Yongchuan Hospital , Chongqing Medical University, Chongqing 402160, China;

2.Key Laboratory of Clinical Laboratory Diagnostics of the Education Ministry, College of Laboratory Medicine,

Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

Abstract:Using an automatic microplate reader, a high-throughput screening method was developed to recognize uricase mutants of higher activity. The expression vectors of wildtype uricase and its three mutants were used to transform Escherichia coli cells separately. After lysis of cells via ultrasonic treatment, crude enzymes in lysates served as samples to measure activity. Uricase activity was estimated by analyzing absorbance at 293 nm from 8 min to 28 min since reaction initiation. The concentrations of total protein in a lysate were determined by the Bradford assay. Uricase activity or specific activity was compared against a threshold to recognize a mutant of higher activity. The reliability of activity and specific activity for recognizing positive mutants were evaluated by Receiver-operation-curve (ROC). Any uricase mutant with> 200% improvement of activity yielded area-under-the-curve (AUC) close to 1.00. For a mutant with about 50% improvement of activity, ROC analysis of specific activity gave AUC close to 1.00 while the analysis of activity gave smaller AUC. The threshold was determined by fixing the sensitivity at 90% in ROC and expressed as the mean plus 1.7-fold standard deviation of specific activity of the starting material. A uricase mutant with>100% improvement of specific activity could be efficiently recognized as a positive candidate by the high-throughput method.

Key words: Uricase； specific activity； positive mutants； universal threshold

人體無尿酸酶,體內(nèi)嘌呤代謝終產(chǎn)物為尿酸,其主要經(jīng)腎臟排泄;體內(nèi)尿酸生成過快或腎臟排泄受阻都會造成尿酸累積,并導致痛風或腫瘤融解綜合征。外源尿酸酶制劑靜脈注射給藥能清除體內(nèi)血清尿酸且?guī)缀鯚o副作用,是臨床治療尿酸積累所致難治性痛風和腫瘤融解綜合征的有效藥物[1-4]。但長期連續(xù)注射外源蛋白制劑會誘發(fā)人體產(chǎn)生抗體而降低其療效,甚至產(chǎn)生難以預計的毒副作用;新近上市的pegloticase連用兩周后就易誘導產(chǎn)生特異性抗體[2,4]。提高尿酸酶催化能力以降低治療劑量,從而減少/避免副作用是蛋白藥物治療應用的關鍵[5]。此外,尿酸酶是體外診斷血清尿酸含量的關鍵工具酶,其比活性越高則應用成本越低[6]。因此,獲得高比活性尿酸酶是其應用于診斷和治療領域的關鍵。

篩選進化生物技術建立的尿酸酶突變體庫是獲得高活性尿酸酶的有效策略,但需高通量方法快速、準確地測定酶活性或比活性,以及可靠識別高活性陽性突變體的方法。課題組所發(fā)現(xiàn)苛求芽孢桿菌尿酸酶序列已獲發(fā)明專利授權,此尿酸酶有超強熱穩(wěn)定性,但對底物親和力低且比活性較低,需進行分子改造以提高其應用價值[7-8]。本文以野生型苛求芽孢桿菌胞內(nèi)尿酸酶及其3種突變體為模型,在全自動酶標儀上建立高通量測定尿酸酶活性和比活性的方法,并建立識別其陽性突變體的通用判斷閾值,為篩選尿酸酶突變體庫奠定基礎。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

光譜掃描多功能讀數(shù)儀(Thermo Scientific Varioskan Flash,賽默飛世爾科技),超聲破碎儀(JY92-Ⅱ,寧波新芝生物科技股份有限公司),96孔酶標板(BIO basic INC),純水器(Classic UVF,法國威立雅),紫外分光光度計(TU-1810,北京普析通用儀器有限責任公司)均按照儀器使用手冊要求進行操作。尿酸、牛血清白蛋白均購買于Sigma-Aldrich?？捡R斯亮藍G250購于上海生工。超純水18.2 MΩ·cm-1?？燎笱挎邨U菌A.T.C.C. 29604野生型胞內(nèi)尿酸酶的pET28a載體為課題組此前構建[7]。大腸桿菌細胞株BL21(DE3)來自上海生工。4種尿酸酶突變體按活性下降順序命名為候選突變體A，B，C和D(表1,基因突變和這些突變體的表達載體構建委托北京泰和基因有限公司完成),具體序列見此前報道[9]。

1.2尿酸酶及其突變體的重組表達、純化和活性測定

尿酸酶及其突變體的重組表達參照文獻[7]。將尿酸酶對應pET28a載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中(大腸桿菌無內(nèi)源性尿酸酶);挑選陽性克隆轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)3 h后,18℃下加入終濃度為1.0 mmol/L的異丙基-β-D-半乳糖苷在18℃誘導尿酸酶表達16 h。收集菌體,150 W超聲間隔2.5 s破碎2.0 min,10 000 r/min，離心10 min的上清液為細胞裂解液。各種尿酸酶突變體分別經(jīng)DEAE-纖維素離子交換層析和制備型電泳純化。在25℃用0.075 mmol/L尿酸在pH 9.2硼酸鹽緩沖液中在全自動酶標儀上測定293 nm光吸收變化的初速度表示尿酸酶活性,按其摩爾消光系數(shù)11.5 (mmol/L)-1cm-1校正尿酸儲備液的濃度[10]。尿酸溶液每天配制,使用前在(25±0.5)℃下預熱20 min。尿酸酶反應體系共150 μL,含尿酸溶液50 μL,加入用50.0 mmol/L的硼酸緩沖液(pH 9.2)稀釋的裂解液100 μL啟動反應,間隔2.0或5.0 min測定293 nm光吸收變化,每份樣品測定3次。用各突變體酶活性與其總蛋白濃度之比表示比活性。每分鐘消耗1微摩爾尿酸的酶量為1單位。

1.3總蛋白測定

用牛血清白蛋白為參考,用Bradford法測定尿酸酶樣品中的蛋白濃度[11]。硼酸緩沖液稀釋裂解液8倍,反應體系共150 μL,尿酸酶溶液50 μL,考馬斯亮藍溶液100 μL,振蕩10 min后檢測595 nm光吸收。

1.4尿酸酶突變體的模擬篩選

在模擬篩選過程中所用4種尿酸酶同此前報道[9];這4種尿酸酶純化后任兩種尿酸酶活性比值在1.3～4.0倍間。每種尿酸酶突變體pET28a載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,平板篩選30個陽性克隆;每個克隆分別轉(zhuǎn)移到含1.0 mL選擇性液體培養(yǎng)基的5.0 mL Ependorf 管中,37℃放大培養(yǎng)3 h;加入異丙基-β-D-半乳糖苷到終濃度為1.0 mmol/L,在18℃ 誘導表達16 h;離心收集濾渣洗滌,加50 mmol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液0.20 mL,冰浴超聲裂解,離心后上清液為裂解液樣品用于測定突變體酶活性。

1.5數(shù)據(jù)分析及尿酸酶陽性突變體的識別

用Microsoft Excel計算均值(χ)、標準差(s)、變異系數(shù)(CV)。用SPSS 17.0進行F檢驗和t檢驗比較各突變體的酶活性、比活性和總蛋白濃度。任選兩種突變體為一對,催化效力低者為起始物,高者為陽性突變體。比較來自單個克隆的裂解液中尿酸酶活性或比活性均值判斷陽性突變體。作受試品工作曲線(receiver-operation-curve,ROC),分析曲線下面積(area under curve,AUC)與酶催化效力比值的關系[12-13]。通過ROC分析得到滿足設定靈敏度和特異性要求的判斷閾值,以起始物的均值和標準差表示,用于測定裂解液中酶活性進行篩選。

2結果

2.1尿酸酶活性的高通量測定

測定80，130和180 μmol/L尿酸在293 nm光吸收(各濃度測定30次,重復測定7批次),其吸收分別為1.186±0.019，1.579±0.032和1.855±0.044,這些尿酸濃度均在吸收的有效測定范圍內(nèi)且精度相當。尿酸濃度越低,所測吸收受儀器噪聲干擾越大?？燎笱挎邨U菌尿酸酶對尿酸米氏常數(shù)高于200 μmol/L,測定其初速度要求尿酸消耗比例盡可能低,故需較高尿酸濃度才能獲得較寬可測范圍。因此,選用130 μmol/L尿酸測定活性。

在25 ℃下用130 μmol/L尿酸,分別以100，150，200，300倍稀釋尿酸酶突變體A的裂解液啟動反應,每隔2 min檢測293 nm吸收,連續(xù)監(jiān)測30 min。結果表明:①啟動反應3 min后,稀釋100，150，200和300倍裂解液的尿酸消耗量分別為11.8%，8.0%，7.4%，4.3%;②反應20 min后,4種稀釋倍數(shù)樣品使反應體系尿酸消耗分別為35%，27%，20%和15%;③稀釋300和200倍裂解液在7～21 min內(nèi)吸收線性下降,稀釋100和150倍的裂解液在3～13 min內(nèi)吸收線性下降。分析啟動反應3 min后數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)5～20 min間的尿酸酶反應初速度對稀釋200倍的突變體A的量呈線性響應(R2=0.989 6,n=5,圖1b),對應初速度可測上限達到1.52 U/L。在130μmol/L尿酸時無尿酸酶作用30 min內(nèi)吸收隨機波動小于0.04,而方法檢測下限為0,則此高通量測定系統(tǒng)對尿酸酶活性檢測下限約為0.04 U/L;此高通量測定尿酸酶活性過程為:裂解液100 μL(稀釋200倍),尿酸50 μL(終濃度為130 μmol/L),持續(xù)振蕩3 min后,以5.0 min間隔連續(xù)監(jiān)測20 min內(nèi)293 nm吸收變化,以啟動反應后8～28 min的數(shù)據(jù)計算初速度。

圖1　尿酸酶活性測定(a,尿酸酶突變體A在不同稀釋倍數(shù)下與130 μmol/L尿酸在293nm光吸收變化;b,尿酸酶突變體的加樣量與酶初速度的線性關系) Fig.1　Assay of uricase activity with microplate reader

2.2陽性突變體的判斷方法

從突變體庫中篩選陽性突變體的靈敏度和特異性越高越好。這需識別陽性突變體的比較指標及其閾值,突變體酶活性指標大于此閾值即為陽性突變體。有限位點突變的突變體催化效力變化有限,從中篩選出催化效力增加1倍的陽性突變體是一個挑戰(zhàn)。本文以催化效力比值在1.3～4.0的4種尿酸酶突變體組合為模型建立識別陽性突變體的判斷閾值。

F檢驗發(fā)現(xiàn)4種突變體裂解液中總蛋白濃度無差異(P>0.05),而酶活性和比活性差異顯著(P<0.05, 見表1)。當兩種突變體的比活性比值大于1.50后,比較其比活性的AUC>0.9，P<0.05且都高于分析酶活性所得 (表2),說明高通量方法測定尿酸酶比活性用于識別其陽性突變體有一定優(yōu)勢[9]?？赡芤驗楹蜻x突變體D表達效率偏低,使另外3種候選突變體與候選突變體D的比活性比值明顯大于純化后樣品所得催化效力比值,但其余3種候選突變體之間比活性比值與純化后測定催化效力比值差異較小。每對尿酸酶突變體間催化效力差異越大,ROC分析所得AUC越高。兩種尿酸酶間催化效力大于3.0后,ROC分析尿酸酶活性或比活性所得AUC都接近1.00。無論分析酶活性還是比活性都無法完全識別催化效力比值小于2.0時陽性突變體,但兩種尿酸酶突變體間催化效力接近或大于2.0后ROC分析比活性的AUC大于0.95。所以,高通量方法測定尿酸酶的初速度進行比較能用于識別催化效力提高接近1倍的陽性突變體,且以突變體的比活性作為識別陽性突變體靈敏度更高。

在篩選突變體庫時需從裂解液所得酶活性判斷其是否為陽性突變體。候選突變體A與C裂解液樣品所得比活性比值與純化后催化效力比值≥1.69且差異較小;兩種突變體裂解液中尿酸酶比活性的變異系數(shù)一致(表1,2),故選A和C成對作ROC分析以確定識別陽性突變體的閾值[15]。用Youden 指數(shù)(Youden index,YI)最大、設定敏感度80%和90%確定識別二者中高比活性者為陽性突變體時所需比活性的閾值,分別為1.01，1.17和1.06 U/mg(表3和圖3)。 在篩選突變體庫時閾值較小會引入太多比活性較低的陽性突變體而增加篩選工作量;設定敏感度過低可能丟失陽性突變體。因此選擇敏感度為90%對應最大特異度的比活性為閾值,即1.06 U/mg可作為識別A和C組合中的陽性突變體的閾值。參照畸異值識別方法,可將此閾值換算成以起始物比活性均值和標準差表示的參數(shù)作為識別陽性突變體的通用閾值;上述閾值就等同于突變體C為起始物的比活性均值+1.7倍起始物比活性標準差,可作為陽性突變體識別的閾值并有望通用于不同的起始物(表3)。

圖2　ROC判斷候選突變體A和C的閾值(n=30) Fig.2　ROC analysis of activities in lysates between uricase A and C (n=30)

突變體總蛋白濃度/mg·mL-1酶活性/U·mL-1比活性/U·mg-1χ±sCV(%)χ±sCV(%)χ±sCV(%)A0.22±0.0315.20.28±0.0516.41.30±0.2820.7B0.21±0.0313.90.24±0.0416.71.16±0.1411.8C0.22±0.0417.60.17±0.0425.20.77±0.1722.1D0.21±0.0522.70.04±0.0243.30.22±0.1565.3F0.859229.637191.147P0.4650.0000.000

用上述閾值,識別酶比活性之比大于1.7的A和C尿酸酶突變體組合中的陽性突變體的敏感度大于90%,特異度大于93%;識別突變體酶比活性之比大于4.6的尿酸酶中的陽性突變體,其敏感度和特異度都滿足篩選要求;識別酶比活性比值為1.5尿酸酶中的陽性突變體,其敏感度接近80%,特異度大于93%,可見此閾值有通用性。

表2　ROC分析配對候選突變體的酶活性和比活性( n=30)

表3　識別尿酸酶突變體A和C陽性突變體的閾值( n=30)

3討論

篩選酶突變體需高通量測定酶活性和準確識別陽性突變體的閾值。全自動酶標儀適合高通量測定酶活性。直接測定尿酸吸收跟蹤尿酸酶反應過程計算尿酸酶初速度的效率最高。測定酶初速度時要求延遲時間內(nèi)底物消耗量盡可能低,用于分析數(shù)據(jù)中底物消耗比例不能超過設定界限,且米氏常數(shù)越高，測定初速度所允許的最大底物消耗比例越低?？燎笱挎邨U菌胞內(nèi)尿酸酶米氏常數(shù)接近0.25 mmol/L,用盡可能高的尿酸濃度測定酶活性有助于提高識別高活性尿酸酶突變體的靈敏度,并允許較寬可測范圍。但最大尿酸濃度受到儀器測量范圍限制。故需優(yōu)化底物濃度、反應時間和樣品稀釋比例建立高通量測定尿酸酶活性方法。

表4　尿酸酶候選突變體的特異度和敏感度

據(jù)裂解液中酶活性識別陽性突變體需要的閾值,酶活性大于此閾值即為陽性突變體;這種識別方法需盡可能高的靈敏度和特異性。在ROC分析中,各種可能cut-off值被嘗試為閾值考察識別陽性突變體的特異性和敏感度。通過ROC分析確定閾值的常用方法包括[12-13]:①設定敏感度最低限對應的最大特異度處cut-off值為閾值,通常設定敏感度的最低限為80～90%;②Youden指數(shù)(Youden index,YI)最大的cut-off值為閾值,YI=敏感度-(1-特異度),即敏感度和特異度的和最大,以最靠左上角的截割點為判斷參考范圍。綜合考慮,選擇敏感度為90%對應最大特異度的比活性為判斷陽性突變體的閾值。上述閾值等同于起始物C比活性均值+1.7倍起始物比活性的標準差;此閾值用于識別酶催化活力提高近1倍的尿酸酶陽性突變體時敏感度和特異度都能滿足要求,可作為候選通用閾值。

參考文獻：

[1]RICHETTE P, BARDIN T. Gout [J]. Lancet, 2010, 375(9711):318-328.

[2]SCHLESINGER N, YASOTHAN U, KIRKPATRICK P. Pegloticase [J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2011, 10(1): 17-18.

[3]TERKELTAUB R. Update on gout: new therapeutic strategies and options [J]. Nature Reviews Rheumatology, 2010,6(1): 30-38.

[4]SHANNON J A, COLE S W. Pegloticase: a novel agent for treatment-refractory gout [J]. The Annals of Pharmacotherapy, 2012,46(3):368-76.

[5]YANG X, YUAN Y, ZHAN C G, et al. Uricases as therapeutic agents to treat refractory gout: Current states and future directions [J]. Drug Development Research, 2012, 73(2):66-72.

[6]ZHAO Y S, YANG X Y, LU W, et al. Uricase based methods for determination of uric acid in serum [J]. Microchim Acta, 2009, 164(1):1-6.

[7]ZHANG C, YANG X L, FENG J, et al. Effects of modification of amino groups with poly(ethylene glycol) on a recombinant uricase from Bacillus fastidiosus [J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2010, 74(6):1298-1301.

[8]FENG J, LI X, YANG X L, et al. A new practical system for evaluating pharmacological properties of uricase as potential drug to handle hyperuricemia [J]. Archives of Pharmacal Research, 2010, 33(11):1761-1769.

[9]FENG J, LIU H B, YANG X L, et al. Comparison of activity indexes for recognizing enzyme mutants of higher activity with uricase as model [J]. Chem Cent J, 2013, 7(1):69.

[10]LIAO F, ZHU X Y, WANG Y M, et al, The comparison of the estimation of enzyme kinetic parameters by fitting reaction curve to the integrated Michaelis-Menten rate equations of different predictor variables [J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2005, 62(1): 13-24.

[11]BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(2): 248～254.

[12]ANTHONY K A. Understanding diagnostic tests 3: receiver operating characteristic curves [J]. Acta Paediatrica, 2007, 96(5):644-647.

[13]CERDA J, CIFUENTES L. Using ROC curves in clinical investigation: theoretical and practical issues [J]. Revista Chilena de Infectología, 2012, 29(2):138-141.

(編輯徐象平)