滿朝來，穆衛(wèi)濤，趙冬雪，常楊

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主要禽源病毒相關(guān)microRNA的研究進(jìn)展

滿朝來，穆衛(wèi)濤，趙冬雪，常楊

哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025

滿朝來, 穆衛(wèi)濤, 趙冬雪, 等. 主要禽源病毒相關(guān)microRNA的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(9): 1289?1300.Man CL, Mu WT, Zhao DX, et al. Progress in microRNAs associated with major avian viruses. Chin J Biotech, 2015, 31(9): 1289?1300.

近年來，禽類病毒性疾病已經(jīng)成為研究病毒感染和致病機(jī)制的重要模型之一，而且病毒與microRNA的調(diào)控關(guān)系和機(jī)制研究也成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。本文簡(jiǎn)要總結(jié)禽源皰疹病毒編碼microRNA的概況，以及禽源皰疹病毒的致瘤性與microRNA的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，同時(shí)探討了利用microRNA靶向調(diào)控機(jī)制在病毒疾病(如傳染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽流感病毒等) 防治中的可能應(yīng)用。

雞，病毒，microRNA，腫瘤，馬立克氏病毒

禽業(yè)生產(chǎn)是當(dāng)今世界主要的肉蛋供應(yīng)來源之一，但近年來禽類疾病呈現(xiàn)出多發(fā)趨勢(shì)，其中病毒性疾病是導(dǎo)致禽類病死的最主要原因之一，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)microRNA (miRNA) 在動(dòng)物機(jī)體免疫反應(yīng)和抗病毒過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，有趣的是有些病毒不但可以編碼miRNA，而且還可以調(diào)控宿主細(xì)胞miRNA的表達(dá)活性，這些差異表達(dá)miRNA對(duì)于病毒的感染、潛伏、復(fù)制和致病性起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。目前，禽類病毒(如雞馬立克氏病毒等皰疹病毒) 已經(jīng)成為研究病毒與miRNA相互調(diào)控與作用機(jī)制的重要模型，本文簡(jiǎn)要總結(jié)近年來主要禽源病毒與miRNA相互作用的研究進(jìn)展，以期為后續(xù)深入研究提供參考。

1 MicroRNA

MicroRNA (miRNA) 是一類長(zhǎng)約22 nt，被植物和動(dòng)物廣泛表達(dá)，用于基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的一類小RNA分子，miRNA在許多生理和病理過程(如發(fā)育、造血、抗逆和疾病等) 中呈現(xiàn)差異表達(dá)，發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[1]。由于病毒完全依賴宿主細(xì)胞，許多病毒已經(jīng)進(jìn)化出了調(diào)控宿主細(xì)胞環(huán)境的能力。例如，禽類皰疹病毒在感染和復(fù)制過程中能夠表達(dá)自身的miRNA，并參與病毒的感染、潛伏和復(fù)制等過程[2]。而有些病毒(如禽白血病病毒[3-5]) 在感染過程中也能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞miRNA的表達(dá)改變，進(jìn)而為病毒的復(fù)制和增殖創(chuàng)造條件?？傊?，人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到miRNA是宿主-病毒間相互作用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的一個(gè)重要效應(yīng)因子。

2 禽類皰疹病毒與miRNA

禽類病毒中的皰疹病毒家族成員是迄今研究發(fā)現(xiàn)編碼miRNA最多的一類病毒。常見的禽類皰疹病毒包括致瘤性馬立克氏病病毒(Oncogenic Marek's disease virus，MDV1)、非致瘤性馬立克氏病病毒(Non-oncogenic Marek's disease virus，MDV2)、火雞皰疹病毒(Herpesvirus of turkeys，HVT)、傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)和鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV) 等。利用新一代測(cè)序技術(shù)(如454和Illumina等) 分析雞皰疹病毒MDV1、MDV2、HVT、ILTV和DEV等，發(fā)現(xiàn)每種皰疹病毒成員都能編碼多種miRNA。根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(Http://www. mirbase.org/) 公布的最新數(shù)據(jù)表明，常見的禽類皰疹病毒編碼miRNA的數(shù)量分別為：MDV1 (編碼14種pre-miRNA和26種miRNA成熟體)、MDV2 (編碼18種pre-miRNA和36種miRNA成熟體)、HVT (編碼17種pre-miRNA和28種miRNA成熟體)、ILTV (編碼7種pre-miRNA和10種miRNA成熟體) 和DEV (編碼24種pre-miRNA和33種miRNA成熟體)[2]。

雖然每種禽類皰疹病毒編碼的miRNA都具有唯一序列，而且沒有明顯的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系存在于禽類皰疹病毒各miRNA之間，但是禽類皰疹病毒編碼miRNA的基因組定位卻具有保守性和相似性，即miRNA常定位于病毒基因組的重復(fù)序列區(qū)域[2,6]。另外，同一種屬病毒的不同毒株miRNA序列常具有高度保守性，例如，MDV1不同毒力的分離株通常具有高度保守的miRNA，而堿基變異主要發(fā)生在假定啟動(dòng)子區(qū)域[7]。有趣的是，一些病毒編碼的miRNA表現(xiàn)出與宿主細(xì)胞miRNA序列相似性的特征，例如，mdv1-miR-M4與gga-miR-155，mdv2-miR-M21 與gga-miR-29b，以及hvt-miR-H14與gga-miR-221等都具有共同的種子序列，表明這些病毒來源的miRNA可能具有細(xì)胞內(nèi)源相應(yīng)miRNA的功能[7]。

2.1 馬立克氏病病毒(MDV)

MDV是雞的一種嗜淋巴細(xì)胞皰疹病毒，引起的疾病以CD4+T細(xì)胞淋巴瘤形成、免疫抑制和神經(jīng)障礙等癥狀為主要特征。通過鑒定MDV編碼miRNA的基因組區(qū)域，人們發(fā)現(xiàn)兩簇miRNA轉(zhuǎn)錄區(qū)分別位于該病毒原癌基因的側(cè)翼，另一簇miRNA位于基因組的潛在相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(Latency associated transcript，LAT) 區(qū)域內(nèi)[8-9]。雖然MDV-1和MDV-2編碼的miRNA序列之間缺乏序列同源性，但是不同來源MDV編碼miRNA的基因組區(qū)域卻具有高度保守 性[10]。值得一提的是，定位于MDV1基因組基因上游的這一簇miRNA通常在高致病力病毒株比低致病力病毒株誘導(dǎo)的腫瘤組織中高表達(dá)。例如，來自于強(qiáng)毒株(615K，也稱T. King) meq簇的miRNA在誘導(dǎo)的淋巴瘤中比弱毒株(RB1B) 高表達(dá)。其中，具有g(shù)ga-miR-155相同種子序列的mdv1-miR-M4在強(qiáng)毒株中的表達(dá)能力是弱毒株的3倍，而且mdv1-miR-M4占MDV1所有miRNA表達(dá)水平的72%；另mdv1-miR-M2*/3p的表達(dá)水平也是弱毒株的6倍，所以來源于meq簇的miRNA在MDV致病過程中可能發(fā)揮著重要作用。對(duì)比而言，來自LAT簇的miRNA在強(qiáng)弱毒株中表達(dá)水平是相當(dāng)?shù)腫11]。

2.1.1 MDV致瘤性與miRNA

人類15%的腫瘤是由病毒導(dǎo)致的，但病毒誘導(dǎo)腫瘤的分子機(jī)制仍是復(fù)雜和需要深入研究的領(lǐng)域[12]。雖然人們已經(jīng)確定MDV能夠編碼miRNA并參與病毒的潛伏和致瘤，但是關(guān)于MDV誘導(dǎo)淋巴瘤中病毒-宿主間的相互作用機(jī)制仍不十分清楚，例如，病毒的潛伏感染如何與腫瘤階段界定？潛伏感染是否為腫瘤階段的必要條件等問題仍需要回答，所以研究miRNA對(duì)MDV的致瘤作用對(duì)于防治病毒性腫瘤疾病具有重要的科學(xué)價(jià)值。目前，越來越多的證據(jù)表明病毒感染過程中差異表達(dá)的miRNA與病毒感染、復(fù)制和腫瘤形成有關(guān)。雞馬立克氏病淋巴瘤作為優(yōu)秀的天然腫瘤模型為檢測(cè)病毒利用miRNA在致瘤方面的功能和機(jī)制提供方便。

首先，在MDV1感染方面，越來越多的證據(jù)表明：差異表達(dá)的miRNA與病毒感染和復(fù)制有關(guān)(表1和圖1)。例如，Strassheim等[9]利用MDV感染淋巴細(xì)胞系MSB-1研究發(fā)現(xiàn)，在MDV病毒活化過程中ICP27蛋白(ICP27被認(rèn)為在病毒的激活過程中起重要作用) 水平與mdv1-miR-M7-5p呈負(fù)相關(guān)，說明這些來自LAT轉(zhuǎn)錄而來的miRNA可能促進(jìn)了病毒的建立或維持潛伏。Tian等[13]研究發(fā)現(xiàn)靶向調(diào)控基因(Activating transcription factor 2為轉(zhuǎn)錄激活子，參與調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，并影響抗凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)和DNA損傷反應(yīng)等過程) 的gga-miR-15b在MDV易感雞脾臟腫瘤中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致ATF2顯著上調(diào)，這可能與雞對(duì)MDV是否具有抗性和易感性有關(guān)?？傊?，MDV1通過自身編碼miRNA或影響細(xì)胞內(nèi)源miRNA，直接或間接地改變宿主細(xì)胞環(huán)境，為病毒的感染、潛伏和復(fù)制等過程創(chuàng)造條件。

其次，在MDV1致瘤方面，一方面病毒編碼基因能夠影響病毒的致瘤性(圖1和表1)。例如，MDV1編碼的Meq為AP-1家族的一種堿性亮氨酸拉鏈(bZIP) 蛋白，Meq通過與c-Jun形成同源或異源二聚體可以誘導(dǎo)病毒和細(xì)胞基因的表達(dá)并參與腫瘤形成[14]。

圖1 miRNA與基因在MDV1感染與致瘤中作用機(jī)制示意圖

另一方面，MDV1編碼的miRNA也能顯著影響MDV1的致瘤性[15]。例如，Li等[16]利用微陣列來篩選對(duì)MDV感染敏感的雞脾臟細(xì)胞和病毒編碼miRNA，結(jié)果表明有79種miRNA表達(dá)存在顯著差異，這些miRNA可能在MDV感染和腫瘤形成的信號(hào)分子領(lǐng)域發(fā)揮功能。Goher等[17]利用miRNA深度測(cè)序技術(shù)對(duì)MDV毒株(MD5) 和疫苗株(Herpesvirus of turkeys，HVT) 混合感染和單獨(dú)感染的病毒編碼miRNA分別進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)mdv1-miR-M4-5p和mdv1- miR-M2-3p在感染過程中表現(xiàn)為最高表達(dá)，但在感染的不同時(shí)期(感染后7 d和42 d) 的脾臟中，兩種病毒編碼的miRNA呈現(xiàn)出表達(dá)活性差異和相互干擾的現(xiàn)象，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的miRNA可能在調(diào)控多種細(xì)胞過程，如細(xì)胞增生和天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。Luo等[18]利用MDV-GX0101毒株感染雞后檢測(cè)已知的病毒編碼miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA在疾病發(fā)展的不同階段呈現(xiàn)差異表達(dá)，說明這些miRNA在疾病發(fā)展過程中可能執(zhí)行著不同的調(diào)控作用。

另外，MDV1編碼的mdv1-miR-M4-5p具有與gga-miR-155相同的種子序列，并在MDV1誘導(dǎo)的腫瘤中高表達(dá)，而gga-miR-155卻低表達(dá)，這種MDV1編碼的miRNA表達(dá)上調(diào)，并伴有g(shù)ga-miR-155特異性下調(diào)，是MD腫瘤細(xì)胞所特異的[6,19]。Yu等[20]研究發(fā)現(xiàn)MDV1強(qiáng)毒株(GX0101) 在致瘤過程中，mdv1-miR-M4是一個(gè)重要的調(diào)控子，參與了MDV的腫瘤形成過程，但不是致瘤必需的，而且Meq-簇編碼的其他miRNA可能在MDV強(qiáng)毒株的致瘤過程中也起了關(guān)鍵作用。

總之，miRNA在MDV致瘤過程中的作用已經(jīng)被人們發(fā)現(xiàn)，病毒編碼的miRNA對(duì)病毒的免疫逃避、抗凋亡和增殖可能都具有重要作用，相信隨著研究的深入，miRNA的致瘤機(jī)制將被逐漸揭開。

在進(jìn)行內(nèi)江地區(qū)花萼濕地公園的休閑園區(qū)布局時(shí)：（1）進(jìn)行了鄉(xiāng)土花園的空間布局，通過設(shè)置鄉(xiāng)土花果植物的搭配，形成在曲線綠地中極富地域特色的景觀環(huán)境，并向北江岸自然延展；（2）進(jìn)行了感官花園的空間布局，在逐層跌落的臺(tái)地花園中布置芳香類植物，結(jié)合疊泉等動(dòng)態(tài)景觀，打造親近游覽者的柔性景觀界面；（3）設(shè)置了兒童游戲場(chǎng)、老人健步道，結(jié)合橋下空間設(shè)置極限運(yùn)動(dòng)場(chǎng)和運(yùn)動(dòng)球場(chǎng)，布置觀賞植物群落形成輕松愉悅的環(huán)境氛圍；（4）進(jìn)行了星空花園的空間布局，利用原始較高的地形，在山丘頂部設(shè)置戶外露營(yíng)區(qū)。

最后，MDV1利用宿主細(xì)胞編碼的miRNA或宿主基因?yàn)橹铝鰟?chuàng)造條件(圖1和表1)。在體內(nèi)研究方面，Li等[21]通過分析MDV誘導(dǎo)的淋巴瘤miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，gga-miRNA-26a在被感染雞脾臟的溶細(xì)胞感染、潛伏和腫瘤轉(zhuǎn)化等階段中均表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)gga-miR-26a能夠靶向調(diào)控基因(Never in mitosis gene A (NIMA)-related kinase 6，NEK6與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)有關(guān)) 的表達(dá)，而NEK6在MDV感染組織(如脾臟腫瘤和肝臟淋巴瘤) 中呈現(xiàn)高表達(dá)，表明gga-miR-26a和NEK6在MDV感染和致瘤過程中可能發(fā)揮重要作用。Lian等[22]利用深度測(cè)序技術(shù)分析MDV感染的樣品(脾臟腫瘤和肝臟淋巴瘤)，共發(fā)現(xiàn)187種已知的雞miRNA和16種MDV的miRNA，他們利用qPCR對(duì)其中17種新發(fā)現(xiàn)的miRNA進(jìn)行了定量驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)gga-miR-181a、gga-miR-26a、gga-miR-221、gga-miR-222、gga-miR-199*和gga-miR-140*表達(dá)下調(diào)，而gga-miR-146c上調(diào)，熒光素酶檢測(cè)分析表明gga-miR-181a與MYBL1 (V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog-like 1) 和IGF2BP3 (Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3)，gga-miR-26a與EIF3A (EIF3A在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中起重要的調(diào)控作用) 之間分別存在靶向調(diào)控作用，并可能參與促進(jìn)了MDV誘導(dǎo)淋巴瘤的形成。

在體外細(xì)胞水平研究方面，Lambeth等[23]通過分析MDV轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞MSB-1的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)gga-miR-221和gga-miR-222顯著上調(diào)，并能夠靶向雞p27 (Kip1)(細(xì)胞周期依賴激酶抑制子Cyclin-dependent kinase (cdk) inhibitor p27 (Kip1))的3'-UTR，因?yàn)樵诙喾N腫瘤中miR-221和miR-222表達(dá)上調(diào)能夠影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p27 (Kip1)的表達(dá)，進(jìn)而參與腫瘤形成，所以在T-細(xì)胞淋巴瘤的誘導(dǎo)和發(fā)展中，MDV可利用細(xì)胞miRNA機(jī)制來調(diào)控宿主細(xì)胞周期。Stik等[14]利用MDV1強(qiáng)毒株(RB-1B) 和疫苗株(CVI988) 感染MSB-1細(xì)胞來研究細(xì)胞miRNA的表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)gga-miR-21只在RB-1B感染組過表達(dá)，而在CVI988感染組不表達(dá)。gga-miR-21基因的啟動(dòng)子位于TMEM49基因的第10個(gè)內(nèi)含子中，由AP-1和Ets元件驅(qū)動(dòng)，病毒致瘤蛋白Meq能夠結(jié)合到這一啟動(dòng)子上，并轉(zhuǎn)錄激活gga-miR-21的表達(dá)，gga-miR-21能夠靶向雞的基因(Programmed death cell 4，PDCD4為細(xì)胞凋亡相關(guān)基因)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡逃避。

在病毒影響宿主基因方面，Parnas等[24]分別利用致瘤病毒MDV-1和非致瘤病毒MDV-2感染MSB1細(xì)胞來分析病毒編碼miRNA的靶標(biāo)mRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDV-1編碼基因能夠被4個(gè)MDV-1編碼的miRNA (mdv1-miR- M2、mdv1-miR-M3、mdv1-miR-M4和mdv1-miR- M12) 所靶向，而且細(xì)胞內(nèi)源基因IL-18也能夠被MDV-1和MDV-2編碼的miRNA (mdv1- miR-M2-3p、mdv1-miR-M9-5p、mdv2-miR-M18- 5p、mdv2-miR-M18-5p-1、mdv2-miR-M26-5p、mdv2-miR-M28-5p和mdv2-miR-M30-3p) 共同靶向。Mdv1-miR-M4是細(xì)胞miR-155的功能類似物[7]，而miR-155在多種生理和病理過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用[25]。Muylkens等[26]利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，mdv1-miR-M4-5P和miR-155均能高效靶向6個(gè)細(xì)胞內(nèi)源基因(GPM6B、RREB1、c-Myb、MAP3K7IP2、PU.1和C/EBP) 的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR) 的相同序列區(qū)域，而且mdv1-miR-M4也能特異性地抑制MDV-1編碼的2種參與病毒DNA解離或包裝功能蛋白(UL28和UL32) 的翻譯。

綜上所述，MDV不但可以通過影響宿主細(xì)胞miRNA的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞功能蛋白基因的表達(dá)活性，而且也可以通過自身編碼的miRNA來直接或間接影響宿主細(xì)胞功能基因的活性，從而間接地為MDV的復(fù)制與致瘤創(chuàng)造有利的細(xì)胞環(huán)境。

表1 MDV-1致瘤相關(guān)miRNA的作用

2.1.2 MDV的防治

既然MDV的感染和致瘤性與miRNA密切相關(guān)，那么通過影響或調(diào)控相關(guān)miRNA的表達(dá)活性可能實(shí)現(xiàn)對(duì)MDV的防治。例如，Zhao等[27]利用反向遺傳技術(shù)，從MDV1基因組中刪除6個(gè)miRNA簇序列，這導(dǎo)致MDV1喪失了致瘤性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MDV1致瘤性的喪失是由于mdv1-miR-M4的缺失導(dǎo)致的，所以可以利用缺失miRNA編碼序列的修飾后病毒作為弱毒疫苗用于預(yù)防馬立克氏病。此外，Chen等[28]發(fā)現(xiàn)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)miRNA來靶向MDV的功能基因，也能夠顯著抑制病毒復(fù)制，而且如果利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來表達(dá)多個(gè)miRNA，這些miRNA可同時(shí)靶向目的基因的多個(gè)靶點(diǎn)，不但能夠放大抗病毒效應(yīng)，并且也能夠有效避免病毒進(jìn)化突變而造成的逃避。此外，研究抗腫瘤藥物與miRNA的關(guān)系，也可能為病毒性腫瘤疾病的防治提供指導(dǎo)方向。Xu等[12]利用抗腫瘤藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來鑒定MDV-1編碼的靶向miRNA，結(jié)果表明在化療藥物Cisplatin作用下mdv1-miR-M3通過直接靶向下調(diào)Smad2蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，并且能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞存活，所以開發(fā)和利用病毒miRNA的抗凋亡能力可能為改善化療效果，特別是為病毒性腫瘤的化療提供有力的方向性理論指導(dǎo)。

2.2 其他禽類皰疹病毒與miRNA

雞傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT) 是由ILTV引起的上呼吸道疾病。2009年，Rachamadugu 等[29]利用454 FLX基因組測(cè)序方法研究發(fā)現(xiàn)在雞胚腎細(xì)胞中ILTV可編碼7種miRNA，分別是iltv-miR-I1-5p、iltv-miR-I1-3p、iltv-miR-I2-5p、iltv-miR-I3-3p、iltv-miR-I4-5p、iltv-miR-I5-5p、iltv-miR-I5-3p、iltv-miR-I6-5p、iltv-miR-I6-3p和iltv-miR-I7-3p，至今ILTV編碼的miRNA共發(fā)現(xiàn)7種pre-miRNA和10種成熟的miRNA。

DEV是一種能夠引起水禽急性致死性疾病的皰疹病毒。Yao等[30]利用深度測(cè)序技術(shù)分析DEV感染的雞胚胎成纖維細(xì)胞的RNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾種DEV編碼新miRNA，而且DEV編碼miRNA主要來源于基因組的唯一長(zhǎng)區(qū)(Unique long region)，并發(fā)現(xiàn)DEV-miR-D18和DEV-miR-D19的前體序列互相重疊，表現(xiàn)出與moRNA (miRNA-offset RNA)的相似性。這些miRNA的發(fā)現(xiàn)不但豐富了皰疹病毒家族成員編碼miRNA的列表，而且對(duì)于深入理解miRNA在病理生理中的作用具有積極的意義。

3 傳染性法氏囊病毒與miRNA

此外，人們利用重組載體表達(dá)miRNA來靶向病毒功能基因，也取得了良好的抗病毒效果。例如，Wang等[33]利用重組腺相關(guān)病毒(Avian adeno-associated virus，rAAAV) 載體來構(gòu)建 抗-VP1和抗-VP2基因的重組miRNA表達(dá)載體用于研究抗IBDV的復(fù)制能力，結(jié)果表明，rAAAV是一種禽類細(xì)胞miRNA傳遞的有效載體，并且發(fā)現(xiàn)VP1基因更適合作為RNAi靶標(biāo)用于干擾IBDV的復(fù)制。隨后，Wang 等[34]利用構(gòu)建抗-VP2的miRNA重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染雞成纖維細(xì)胞(DF-1)，再利用IBDV感染細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA重組載體的對(duì)VP2基因表達(dá)抑制率達(dá)到76%?82%，并顯著降低病毒感染滴度，表明靶向病毒VP2基因的miRNA重組載體也能夠有效抑制IBDV的復(fù)制。

值得一提的是，人們也發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)源miRNA的抗IBDV復(fù)制能力。Wang等[35]將雞pri-gga-miRNA-21構(gòu)建到慢病毒載體中，利用重組慢病毒來感染雞DF-1細(xì)胞并結(jié)合IBDV感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，gga-miR-21能夠靶向和下調(diào)IBDV的VP1基因，顯著降低IBDV的復(fù)制能力，這表明宿主細(xì)胞內(nèi)源的gga-miR-21能夠通過下調(diào)IBDV的VP1基因進(jìn)而抑制IBDV的復(fù)制。

總之，利用miRNA原理和基因重組技術(shù)，通過調(diào)控宿主細(xì)胞或IBDV相關(guān)基因的表達(dá)活性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)IBDV感染或復(fù)制的有效抑制，這為IBDV的防治提供有價(jià)值的策略與方向。

4 禽白血病病毒與miRNA

J亞群禽白血病病毒(Avian leucosis virus-J subgroup，ALV-J) 能夠引起感染雞的多組織腫瘤發(fā)生，已經(jīng)成為我國(guó)禽業(yè)生產(chǎn)中流行和爆發(fā)的常見疫病之一，目前仍無有效的疫苗防治，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。在ALV-J致瘤機(jī)制探索方面，人們從ALV-J感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞內(nèi)源miRNA表達(dá)變化方面進(jìn)行了有意義的探索。例如，Wang等[3]利用miRNA芯片平臺(tái)來檢測(cè)ALV-J感染雞誘導(dǎo)的肝臟腫瘤細(xì)胞中miRNA的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4個(gè)miRNA發(fā)生顯著的表達(dá)改變，生物信息學(xué)分析表明這些差異表達(dá)miRNA可能參與了腫瘤形成的信號(hào)通路，如MAPK和Wnt信號(hào)通路。Li 等[4]利用ALV-J感染10周齡雞并檢測(cè)肝臟miRNA的表達(dá)，結(jié)果表明，有12種miRNA存在差異表達(dá)(<0.01)，其中感染組7種miRNA (gga-mir-221、gga-mir-222、gga-mir-1456、gga-mir-1704、gga-mir-1777、ga-mir-1790和gga-mir-2127) 表達(dá)上調(diào)并可能參與致瘤作用，而下調(diào)的miRNA可能在腫瘤抑制中起重要作用。Xu等[5]利用3種不同的禽類病毒MDV、ALV和網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV) 制備雞的轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)gga-miR-26a表達(dá)水平都一致下調(diào)，并且miR-26a的下調(diào)與其腫瘤抑制作用相一致，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-26a能夠直接靶向IL-2，miR-26a下調(diào)能夠降低對(duì)IL-2表達(dá)的抑制效應(yīng)，而雞IL-2可以促進(jìn)T-細(xì)胞增生和細(xì)胞毒性，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的增生，這些miRNA的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究ALV-J感染的致瘤作用奠定基礎(chǔ)。

有趣的是，ALV-J雖然具有與MDV1相似的致瘤能力，那么ALV-J是否也能夠編碼miRNA用于病毒的感染和致病過程呢？2006年，Chesters等[36]研究發(fā)現(xiàn)ALV-J的HPRS-103毒株3'-UTR存在一個(gè)E元件(也稱XSR元件) 的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)E元件不是病毒致瘤性完全必需的，但該E元件確實(shí)可以促進(jìn)一定遺傳品系雞的腫瘤發(fā)生。為確認(rèn)E元件是否可以編碼有功能的miRNA，Yao等[37]利用深度測(cè)序技術(shù)分析了ALV-J轉(zhuǎn)化細(xì)胞系IAH30，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的E元件(具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的148個(gè)核苷酸非編碼RNA) 確實(shí)可以編碼一種新的小RNA，并將其稱為E (XSR) miRNA，而且該miRNA在IAH30細(xì)胞系中高表達(dá)，暗示其在ALV-J的致病性和腫瘤性轉(zhuǎn)化中可能具有重要作用；在另一方面，E (XSR) miRNA的發(fā)現(xiàn)對(duì)于解釋不同遺傳品系雞對(duì)ALV-J致瘤的差異敏感性也具有重要的理論 價(jià)值。

截至目前，人們已經(jīng)確認(rèn)ALV-J不但可以調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)源miRNA表達(dá)活性改變[3-5]，而且ALV-J也可以表達(dá)自身的miRNA[37]，這些功能miRNA發(fā)現(xiàn)對(duì)于深入理解ALV的致病機(jī)制和禽白血病的防治必然發(fā)揮核心作用。當(dāng)然，人們也嘗試?yán)胢iRNA原理和重組技術(shù)進(jìn)行抗ALV-J研究，并取得較好的抗病毒效果。例如，Wang 等[38]設(shè)計(jì)并構(gòu)建了靶向基因保守序列的miRNA重組真核表達(dá)載體，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，再利用ALV-J感染細(xì)胞，結(jié)果表明靶向基因的miRNA能夠有效抑制ALV-J的復(fù)制，這對(duì)預(yù)防ALV感染可能是一個(gè)潛在的有用工具。

5 禽流感病毒與miRNA

高致病性禽流感(Highly pathogenic Avian influenza，HPAI) 是由正粘病毒科A型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV) 導(dǎo)致一類重要的病毒性禽類疾病，不但給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，而且也給人類健康也帶來重大威脅。A型流感病毒基因組包含8段負(fù)鏈RNA，其中RNA片段2編碼3種蛋白：PB1、PB1-F2和N40[39]。由于這幾種蛋白對(duì)于病毒的復(fù)制和致病性是關(guān)鍵的，所以靶向它們的表達(dá)可能成為控制和抗HPAI的方法。Kumar等[40]選取300個(gè)在雞肺中表達(dá)的miRNA用于篩選靶向H5N1病毒株片段2的miRNA，結(jié)果表明gga-miR-133c、gga-miR-1710和gga-miR-146c*被預(yù)測(cè)能夠靶向這3種蛋白(PB1、PB1-F2和N40) 基因，這些miRNA的發(fā)現(xiàn)使其在禽流感疾病的防治中可能具有一定的參考應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也暗示了雞可能具有遺傳潛能來抵抗或忍受H5N1感染。

此外，人們對(duì)AIV感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞miRNA表達(dá)變化也進(jìn)行了有意義的嘗試。例如，Wang等[41]通過深度測(cè)序分析低致病性禽流感病毒株(H5N3) 感染后蛋雞的肺和氣管組織表達(dá)的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺組織有73種、氣管組織有36種miRNA分別在感染組與SPF對(duì)照組之間存在差異表達(dá)，而且對(duì)照組具有更多的miRNA高表達(dá)，其中包括免疫相關(guān)的miRNA，如miR-146。為進(jìn)一步驗(yàn)證遺傳背景是否對(duì)雞AIV感染后的miRNA調(diào)控中起基本作用，肉雞和蛋雞AIV感染后的差異表達(dá)miRNA是否具有相同的調(diào)控模式，該課題組[42]利用相同的平臺(tái)技術(shù)對(duì)肉雞的AIV感染進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉雞具有更多的miRNA (108種miRNA) 在感染組的肺中高表達(dá)(其中g(shù)ga-miR-34a、gga-miR-122-1、gga-miR-122-2、gga-miR-146a、gga-miR-155、gga-miR-206、gga-miR-1719、gga-miR-1594、gga-miR-1599和gga-miR-451等可能在AIV感染的宿主反應(yīng)中發(fā)揮主要的調(diào)控作用)，而對(duì)照組僅為13個(gè)miRNA，這一結(jié)果與蛋雞的相反，所以，該研究表明肉雞中可能存在對(duì)AIV感染反應(yīng)不同于蛋雞的miRNA調(diào)控機(jī)制。

通過研究AIV感染與miRNA間的調(diào)控關(guān)系，人們不僅發(fā)現(xiàn)雞體內(nèi)存在對(duì)AIV具有抗性的miRNA[40]，也發(fā)現(xiàn)了肉雞和蛋雞間對(duì)AIV感染的miRNA反應(yīng)差異[41-42]，這些研究不僅暗示AIV感染不同品系雞致病機(jī)制的復(fù)雜性，同時(shí)也為深入理解宿主細(xì)胞miRNA與AIV感染之間的調(diào)控關(guān)系奠定基礎(chǔ)，這對(duì)于開發(fā)新策略用于防治AIV具有重要的理論和實(shí)踐意義。

6 新城疫病毒與miRNA

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) 屬于副黏病毒科副黏病毒屬的一種病毒。該病毒主要危害雞、珠雞和火雞，在被侵襲的雞群中迅速傳播，強(qiáng)毒株可使雞全群毀滅。本課題組利用NDV LaSota弱毒株疫苗免疫7日齡海蘭褐雛雞，分別在免疫后7 d和14 d回收免疫組和對(duì)照組雛雞的主要免疫組織器官(如法氏囊、胸腺和肝臟等)，分析免疫相關(guān)pri-miR-181b1的表達(dá)活性變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在免疫后14 d的免疫組雛雞法氏囊組織中pri-miR-181b1表達(dá)活性上調(diào)，而其他免疫組織未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性改變，而miR-181b具有促進(jìn)NK細(xì)胞(Natural killer cell) 的發(fā)育和功能活性的能力[43-45]。本研究表明新城疫弱毒株疫苗免疫后可能會(huì)誘導(dǎo)免疫相關(guān)miRNA的表達(dá)活性改變，進(jìn)而參與免疫應(yīng)答，后續(xù)研究仍有待于深入開展。

7 展望

目前，研究多發(fā)現(xiàn)于禽類皰疹病毒感染宿主細(xì)胞引起細(xì)胞內(nèi)源miRNA、病毒編碼miRNA或編碼基因的表達(dá)活性改變，其他科屬病毒編碼miRNA和誘導(dǎo)宿主細(xì)胞miRNA表達(dá)活性改變的特性還知之甚少，而且具體的miRNA表達(dá)改變機(jī)制和原因仍需要深入研究。雞作為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的重要模式動(dòng)物之一，具有基因背景簡(jiǎn)單、便于操作、研究結(jié)果對(duì)禽類疾病防治和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究參考價(jià)值大等諸多優(yōu)勢(shì)，相信隨著研究的深入，禽類病毒疾病模型將為揭開“病毒-miRNA-細(xì)胞”這一博弈領(lǐng)域的機(jī)制面紗發(fā)揮更大的作用。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Progress in microRNAs associated with major avian viruses

Chaolai Man, Weitao Mu, Dongxue Zhao, and Yang Chang

College of Life Science and Technology, Harbin Normal University, Harbin 150025, Heilongjiang, China

Recently, avian viral diseases have become one of the main models to study mechanisms of viral infections and pathogenesis. The study of regulatory relationships and mechanisms between viruses and microRNAs has also become the focus. In this review, we briefly summarize the general situations of microRNAs encoded by avian herpesviruses. Also, we analyze the regulatory relationships between tumorigenicity of avian herpesviruses and microRNAs. Additionally, the possible applications for prevention and treatment of viral diseases (such as infectious bursal disease, avian influenza and avian leucosis) using the regulatory mechanisms of microRNAs are also discussed.

chicken, virus, microRNAs, tumor, Marek's disease virus

10.13345/j.cjb.140538

November 11, 2014; Accepted: February 10, 2015

Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (No. C201135),Pre-research Project of Harbin Normal University (No. 12XYG-08).

Chaolai Man. Tel/Fax: +86-451-88060576; E-mail: manchaolai@126.com

黑龍江省自然科學(xué)基金 (No. C201135)，哈爾濱師范大學(xué)科技發(fā)展預(yù)研項(xiàng)目 (No. 12XYG-08) 資助。