鐘澤民，賴強，余希堯，劉德輝，黃毓茂

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豬表皮生長因子在植物乳桿菌中的表達及其活性檢測

鐘澤民1*，賴強1*，余希堯1，劉德輝2，黃毓茂1

1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642 2 廣州沃德生物科技有限公司，廣東 廣州 510663

鐘澤民, 賴強, 余希堯, 等. 豬表皮生長因子在植物乳桿菌中的表達及其活性檢測. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(9): 1325–1334.Zhong ZM, Lai Q, Yu XY, et al. Expression and characterization of porcine epidermal growth factor in Lactobacillusplantarum. Chin J Biotech, 2015, 31(9): 1325–1334.

為獲得一株高效表達豬表皮生長因子 (pEGF) 的重組植物乳桿菌，并檢測其生物活性，從仔豬腸道內(nèi)容物中分離植物乳桿菌，選擇其中生物活性最強的一株 (Lp-1) 為宿主。以商品化乳桿菌表達載體pIAβ8為骨架，干酪乳桿菌超強組成型啟動子SCP、M6前體蛋白信號肽SP、豬表皮生長因子pEGF等為元件，構(gòu)建表達pEGF的植物乳桿菌重組表達載體pSCPSE。用電轉(zhuǎn)化方法 (2.0 kV，2 000 Ω，25 μF，4.0 ms) 將重組載體pSCPSE轉(zhuǎn)化入宿主菌Lp-1中獲得重組植物乳桿菌Lp-pSCPSE。以Tricine-SDS-PAGE法和pEGF ELISA特異性檢測試劑盒檢測目的蛋白的表達；用培養(yǎng)12 h的陽性轉(zhuǎn)化子菌體給剛斷奶的BALB/c小鼠灌胃，2次/d，連續(xù)10 d，以斷奶小鼠的體重、腸絨毛長度和隱窩深度的變化為指標，檢測目的蛋白的生物活性。Tricine-SDS-PAGE檢測和小鼠實驗結(jié)果顯示，重組植物乳桿菌的培養(yǎng)上清中出現(xiàn)6 kDa左右pEGF的特異性條帶，且表達pEGF的重組植物乳桿菌能顯著增加(<0.05) 斷奶小鼠的體重、腸絨毛高度和腸隱窩深度。結(jié)果表明，pEGF在植物乳桿菌中成功表達，且具有良好的生物學(xué)活性。

豬源乳酸桿菌，豬表皮生長因子 (pEGF)，斷奶小鼠，絨毛高度，隱窩深度

表皮生長因子 (Epidermal growth factor，EGF) 是一種高效的有絲分裂原，能刺激細胞增殖、分化，促進離子交換和細胞外基質(zhì)合成，是哺乳動物乳中含量最高的生長因子之一。研究表明，豬表皮生長因子 (pEGF) 不僅能刺激初生仔豬的腸上皮發(fā)育[1]，而且有利于豬早期胚胎的發(fā)育，提高仔豬的成活率[2]。Lee等的研究表明，pEGF能有效地刺激早期斷奶仔豬的腸道發(fā)育及修復(fù)受損的腸道上皮細胞[3]。Chuang等發(fā)現(xiàn)，pEGF不僅能促進早期斷奶仔豬的腸道發(fā)育，而且能促進空腸消化酶基因的表達和增強消化酶的活性[4]。為縮短母豬生育周期，生產(chǎn)中一般對仔豬進行早期斷奶，而斷奶應(yīng)激是影響早期斷奶仔豬的生產(chǎn)性能的主要原因之一。通過在日糧中添加適量的pEGF可有效緩解早期斷奶仔豬的斷奶應(yīng)激，有利于仔豬生產(chǎn)性能的提高[5]。

植物乳桿菌作為腸道正常菌群，能粘附于消化道上皮細胞[6]，產(chǎn)生各種抑菌活性物質(zhì)[7-8]，改善腸道環(huán)境。由于其安全性和多種益生特點，近年來，乳桿菌作為外源蛋白的表達宿主，已被國內(nèi)外研究人員廣泛用于各項研究。庾慶華等[9]分離雞源乳桿菌，并以其為載體宿主，成功表達了綠色熒光蛋白；李一經(jīng)等[10]利用短乳桿菌S層啟動子構(gòu)建乳酸桿菌表達系統(tǒng)成功表達了TGEV的N蛋白；Sasikumar等[11]在植物乳桿菌中表達草酸脫羧酶，能有效降解小鼠的腎結(jié)石。

基于乳桿菌的諸多優(yōu)點，若以乳桿菌為表達宿主表達pEGF，并將其應(yīng)用到臨床上，則可能對斷奶仔豬的生產(chǎn)性能的提高具有重大意義。本研究為獲得高效表達pEGF的重組乳桿菌，分離鑒定了一株具有較廣譜抑菌活性的植物乳桿菌為宿主，以pIAβ8為載體骨架構(gòu)建表達載體，成功表達了pEGF，為生產(chǎn)上緩解仔豬斷奶應(yīng)激、促進斷奶仔豬生長提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮仔豬腸道內(nèi)容物于中山市某農(nóng)場采集；SPF 級BALB/c小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；MRS培養(yǎng)基為海博公司產(chǎn)品；乳桿菌鑒定試劑盒為環(huán)凱公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)mega公司；各種基因克隆試劑購于TaKaRa公司；載體質(zhì)粒購于Biovector公司；指示菌株為本實驗室保存；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 植物乳桿菌的初步分離

取28 日齡新鮮斷奶仔豬腸道內(nèi)容物0.5 g置于4.5 mL滅菌生理鹽水中，搖勻。進行梯度稀釋，稀釋至第7個梯度，吸取10–5、10–6、10–7梯度稀釋液100 μL于固體MRS培養(yǎng)基平板上均勻涂布。將上述平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，挑選形狀規(guī)則、活性高的單菌落10株，反復(fù)劃線純化獲得純菌株。分別將單菌落接入MRS液體培養(yǎng)基中標號L1–L10，37 ℃培養(yǎng)24 h后，分別取各菌株的10–7梯度稀釋液100 μL，置于無菌平皿中，傾入已經(jīng)融化并冷卻至45 ℃左右的MC培養(yǎng)基13–15 mL，立即混勻，待凝固后倒置培養(yǎng)。溶鈣檢測后，將分離純化出來的菌株接種于凍存液中，編號后收存于–80 ℃冰箱。對產(chǎn)溶鈣環(huán)的菌株進行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌體特征。

1.3 植物乳桿菌的初步鑒定

參照乳桿菌生化鑒定試劑盒說明，對鏡檢為革蘭氏陽性桿菌的菌株進行鑒定。對鑒定陽性的菌株進行編號保存，并以Excel 2010軟件繪制其菌液值和pH值隨時間的變化曲線 (圖1)。

1.4 抑菌活性菌株的篩選

將鑒定為乳桿菌陽性的菌株分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，取菌液20 mL，5 000×g離心10 min，取其上清液，以管-碟法測試菌液上清對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性。挑選抑菌活性最強的一株乳桿菌，命名為Lp-1。

1.5 16S rRNA鑒定

根據(jù)乳桿菌的16S rRNA基因序列的保守區(qū)域，設(shè)計16S rRNA擴增引物P1、P2 (表1)，對Lp-1進行16S rRNA鑒定。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司測序，測序結(jié)果與GenBank中同源序列 (Accession No. NC_004567.2) 進行比對后確定Lp-1的種屬。

圖1 宿主菌Lp-1菌液在24 h內(nèi)OD值和pH值的變化趨勢

表1 本研究所用PCR引物序列

Primers utilized in this study. Underlined regions of the primer sequences represent the restriction endonuclease sites.

1.6 重組表達載體的構(gòu)建

從GenBank中獲得超強啟動子序列 (Accession No. FW501695) SCP，根據(jù)其序列用軟件Primer premier 6.0設(shè)計PCR引物P3、P4，并在P3的5?端引入酶切位點Ⅰ，在P4的5?端引入酶切位點HⅠ。以干酪乳桿菌CETC5276的基因組為模板，P3、P4為引物擴增出超強啟動子SCP，將其克隆入pMD-19T載體中構(gòu)建克隆載體pT-SCP。利用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和HⅠ對pT-SCP進行雙酶切后，回收目的片段SCP，轉(zhuǎn)而克隆入經(jīng)過相同酶切處理的表達載體pIAβ8中[12]，成功構(gòu)建載體pSCP。

從文獻[13]中獲得M6前體蛋白信號肽序列 (SP)，該信號肽由141個堿基組成，能有效地將目的蛋白轉(zhuǎn)移到胞外。從GenBank中獲取豬表皮生長因子 (pEGF) 的基因序列 (Accession No. X59516)。在片段SP的5?端和3?端分別引入酶切位點Ⅰ和Ⅰ，在片段pEGF的5?端和3?端分別引入酶切位點Ⅰ和RⅠ，然后根據(jù)植物乳桿菌的密碼子偏嗜性對上述兩段序列進行密碼子優(yōu)化后送Invitrogen公司合成。

將合成片段通過常規(guī)的基因克隆方法依次克隆入表達載體pSCP中，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞中，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，進行酶切鑒定和測序鑒定，最后獲得表達pEGF的重組載體pSCPSE，用于植物乳桿菌的電 轉(zhuǎn)化。

1.7 植物乳桿菌感受態(tài)細胞的制備及電轉(zhuǎn)化

植物乳桿菌Lp-1的感受態(tài)細胞的制備參考Mason[14]和Luchansky[15]的方法，并改進如下：挑取新鮮培養(yǎng)Lp-1的單菌落，接種于5 mL的MRS培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)過夜；吸取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液，接種于含2%甘氨酸 (/) 的99 mL的MRS液中，37 ℃培養(yǎng)至590為0.6左右，再冰浴10 min，使細菌停止生長。4 ℃、8 000×g離心5 min收集菌體，然后以冰冷的SMEB (1 mol/L蔗糖、25 mmol/L MgCl2) 緩沖液洗滌菌體3次，最后用SMEB緩沖液將菌體重懸至原菌液濃度的50倍，每管100 μL分裝置冰中備用。

將7 μL (10 ng/μL) 重組載體pSCPSE與100 μL上述感受態(tài)細胞混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 2 mm電轉(zhuǎn)杯 (Bio-Rad) 中，靜置30 min，然后以Bio-Rad 電轉(zhuǎn)儀進行電擊轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)參數(shù)為2.0 kV，2 000 Ω，25 μF[16]，脈沖時間約為4.0 ms。電轉(zhuǎn)后以900 μL預(yù)冷的MRS液重懸，冰浴20 min后置37 ℃孵育3 h。

1.8 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及表達產(chǎn)物的鑒定

取適量的電轉(zhuǎn)-孵育后菌液涂布于20 μg/mL的氯霉素抗性MRS平板中，37 ℃培養(yǎng)24–48 h，參照庾慶華等[9]的方法挑取單菌落，以P5、P6 (表1) 為引物做菌落PCR鑒定。鑒定為陽性的菌株命名為Lp-pSCPSE。將轉(zhuǎn)化了空載體EV和重組載體pSCPSE的植物乳桿菌分別接種于含氯霉素抗性的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日將上述過夜培養(yǎng)的菌液按2%的比例接種于適量MRS液中，37 ℃培養(yǎng)24 h后取其上清。用截留分子量為10 kDa的超濾離心管過濾上清后取≤10 kDa的濾過液，置于真空干燥箱中濃縮20倍。以Tricine-SDS-PAGE法對上述濃縮液中的目的蛋白進行檢測，同時設(shè)立相應(yīng)濃度的空載體組和標準品陽性對照組。

以豬表皮生長因子 (pEGF) ELISA特異性檢測試劑盒 (環(huán)凱公司) 分別檢測Lp-pSCPSE 在37 ℃培養(yǎng)12、24、36、48 h后上清中pEGF的含量。用曲線擬合軟件Cruver Expert 1.3選擇擬合度最高的濃度-值曲線，得出擬合方程，然后計算出相應(yīng)樣品濃度。

1.9 目的蛋白生物活性的檢測

將37 ℃培養(yǎng)12 h的重組植物乳桿菌Lp-pSCPSE菌液離心取菌體，以無菌PBS洗滌2次后重懸至濃度約為2.0×109CFU/mL備用，以相同方法制備空載體重組植物乳桿菌Lp-EV備用。19–21日齡BALB/c斷奶小鼠隨機分為PBS、空載體 (EV)、重組pEGF植物乳桿菌 (pEGF)、重組人源EGF (rhEGF) 4組，每組10只，并記錄各組每只小鼠的體重。

每組灌胃給藥量如下：PBS組、EV組和EGF組各300 μL/只，rhEGF標準品對照組按 50 μg/kg[17]給藥，2次/d，持續(xù)10 d。實驗第10天處死所有實驗小鼠，稱重后分別在距小腸各段 (十二指腸、空腸、回腸) 起始處1–2 cm間各取0.5 cm腸道為樣品，以無菌PBS沖洗后置于10%甲醛溶液中固定過夜。固定后的組織以石蠟包埋后切片 (5 μm)，再以蘇木精和伊紅 (HE) 染色做組織學(xué)檢查，測定各實驗組腸絨毛高度和隱窩深度[17]。

2 結(jié)果

2.1 有抑菌活性的植物乳桿菌的分離和鑒定

生化鑒定結(jié)果顯示，本研究分離的革蘭氏陽性桿菌菌株對七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露糖、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖等均呈陽性反應(yīng)，初步鑒定為植物乳桿菌。管-碟法檢測該菌37 ℃培養(yǎng)24 h上清對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果分別為19 mm和20 mm抑菌圈 (牛津杯外徑為8 mm) (圖2)。

Lp-1的16S rRNA測序結(jié)果經(jīng)Blast序列比對后顯示，該菌株與WCFS1株同源性最高，即本研究分離的菌株屬于植物乳桿菌。16S rRNA測序結(jié)果略。

2.2 重組表達載體的構(gòu)建

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，超強啟動子SCP的PCR產(chǎn)物長度約為400 bp，M6前體蛋白信號肽SP的基因片段長度約為150 bp，豬表皮生長因子pEGF的基因片段長度約為170 bp，均與預(yù)期片段長度相符。將上述各片段分別通過相應(yīng)的酶切位點克隆到骨架質(zhì)粒中構(gòu)建重組載體，再對重組載體進行雙酶切鑒定，結(jié)果在750 bp左右出現(xiàn)條帶，與插入的目的條帶SCP、SP和pEGF總長一致(圖3)。測序鑒定結(jié)果與實驗設(shè)計序列完全一致，證明表達pEGF的重組表達載體pSCPSE構(gòu)建成功。

圖2 管-碟法檢測Lp-1 37 ℃培養(yǎng)24 h的菌液上清對大腸桿菌K99和金黃色葡萄球菌ATCC29213的抑菌效果

圖3 重組載體pSCPSE的雙酶切鑒定

2.3 電轉(zhuǎn)后陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

用pSCPSE電轉(zhuǎn)Lp-1的感受態(tài)，涂布于氯霉素抗性MRS平板培養(yǎng)，獲得多個單菌落。以溶菌液[9]預(yù)先處理單菌落后取之為模板，以P5、P6為引物做菌落PCR鑒定，PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定與預(yù)期條帶大小相符 (結(jié)果未顯示)。表明重組載體成功電轉(zhuǎn)入宿主菌Lp-1中。

2.4 陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清表達產(chǎn)物的分析

在陽性轉(zhuǎn)化子Lp-pSCPSE的培養(yǎng)上清中檢測出特異性條帶，大小約為6 kDa左右，與標準品陽性對照組大小相同，而空載體組的培養(yǎng)上清未檢測到特異性條帶(圖4)。表明重組載體pSCPSE成功電轉(zhuǎn)化入植物乳桿菌Lp-1中，且在信號肽SP的引導(dǎo)下，目的蛋白成功分泌到胞外。用豬表皮生長因子 (pEGF) ELISA特異性檢測試劑盒檢測Lp-pSCPSE在37 ℃培養(yǎng)12、24、36、48 h后上清中的pEGF (表2)。以曲線擬合軟件Curve Expert 1.3分析ELISA數(shù)據(jù)后得到擬合度最高的濃度-值曲線，擬合方程為=a+b+c2+d3(a、b、c、d為擬合方程常數(shù)，為樣品值，為樣品濃度)。經(jīng)計算，重組植物乳桿菌Lp-pSCPSE培養(yǎng)24 h后上清中pEGF的濃度達最大值為280 ng/mL。

圖4 重組植物乳桿菌培養(yǎng)上清濃縮液的Tricine- SDS-PAGE鑒定

表2 重組植物乳桿菌菌液ELISA檢測結(jié)果

2.5 重組植物乳桿菌生物活性的檢測

以表達pEGF的重組植物乳桿菌Lp-pSCPSE、電轉(zhuǎn)化空載體質(zhì)粒的植物乳桿菌Lp-EV、rhEGF標準品和PBS分別對斷奶的BALB/c小鼠進行灌胃實驗。結(jié)果表明重組乳桿菌Lp-pSCPSE能有效促進斷奶小鼠體重的增加，數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，與Lp-EV組和PBS組相比，Lp-pSCPSE組和rhEGF組增重差異顯著 (字母不同表示差異顯著) (圖5)。

石蠟切片后，參考Cheung等[17]的方法，用Leica LAS Extended Annotation顯微圖像分析軟件對各實驗組小鼠的十二指腸、空腸、回腸進行組織學(xué)檢查及數(shù)據(jù)測量，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示Lp-pSCPSE組和rhEGF組的各腸段腸絨毛長度和隱窩深度與Lp-EV組和PBS組相比差異顯著 (字母不同表示差異顯著) (圖6)。

圖5 不同處理組10 d后實驗小鼠增重的對比(字母不同表示差異顯著，P＜0.05)

圖6 表達pEGF的重組植物乳桿菌Lp-pSCPSE對BALB/c早期斷奶小鼠腸絨毛高度 (A) 及腸隱窩深度 (B)的影響

3 討論

pEGF作為一種活性小肽，在促使腸道上皮細胞的正常分裂增殖過程中的作用不可或缺[18-19]。其在畜牧業(yè)生產(chǎn)，尤其是在提高斷奶仔豬生產(chǎn)性能中有良好的應(yīng)用前景。近年來，隨著國內(nèi)外研究的深入，已經(jīng)實現(xiàn)了pEGF在大腸桿菌、酵母菌、乳酸乳球菌等多種宿主菌中的表達和應(yīng)用[3,5]。但pEGF在這些宿主中表達存在各自的不足之處：大腸桿菌表達系統(tǒng)表達小肽易形成包涵體，且產(chǎn)物中內(nèi)毒素的去除過程繁復(fù)；酵母表達系統(tǒng)表達pEGF后雖純化過程相對簡易，但酵母菌不是豬腸道正常定殖菌，無法持續(xù)為斷奶仔豬提供pEGF，給實際生產(chǎn)操作帶來不便；乳酸乳球菌雖為豬腸道內(nèi)正常菌群，但其對豬腸道黏膜的粘附性和產(chǎn)乳酸能力不佳。為克服上述表達系統(tǒng)的不足，本研究以分離的仔豬源植物乳桿菌為宿主表達pEGF；該菌分離自仔豬腸道，對豬腸道黏膜有很強的粘附性，其發(fā)酵液中乳酸濃度高，pH值可達3.8，在降低仔豬消化道pH值，限制腸道內(nèi)嗜堿性細菌數(shù)量起重要作用。此外，Park等[20]研究發(fā)現(xiàn)，以植物乳桿菌喂養(yǎng)小鼠能有效緩解小鼠因高脂食物而導(dǎo)致的肥胖癥狀；將植物乳桿菌與多重耐藥的銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時，能降低銅綠假單胞菌的毒性[21]；還有研究表明植物乳桿菌能對內(nèi)毒素引起的肝損傷和小鼠急性鎘中毒起保護作用[22]。

pEGF作為一種生長因子，僅需微量便可在機體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)功能。Cheung等[17]研究發(fā)現(xiàn)，1 ng/mL濃度的EGF與25 ng/mL濃度的EGF對小鼠的腸絨毛的促生長作用無顯著差異。而本研究構(gòu)建的重組植物乳桿菌表達的pEGF可達280 ng/mL，滿足機體對該生長因子的需要。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的抗生素相比，表達EGF的乳酸菌不僅能有效地控制豬腸道內(nèi)的大腸桿菌、腸球菌等有害菌的數(shù)量，而且能促進腸道內(nèi)其他益生菌的生長，從而改善腸道菌群。以本研究構(gòu)建的重組植物乳桿菌飼喂小鼠，小鼠的腸絨毛高度和隱窩深度與對照組相比都有明顯差別，說明重組植物乳桿菌進入小鼠消化道后能在消化道內(nèi)正常生長并分泌表達pEGF，有效促進腸上皮細胞的增生。在停止飼喂重組乳桿菌后的第10天，仍能從小鼠糞便分離的植物乳桿菌中檢測到pEGF目的基因存在，證明本研究構(gòu)建的重組植物乳桿菌能有效地在小鼠消化道內(nèi)定殖，且持續(xù)性地產(chǎn)生pEGF，有助于修復(fù)腸道損傷，促進腸道發(fā)育。因此，表達pEGF的植物乳桿菌作為一種減緩仔豬斷奶應(yīng)激的微生態(tài)制劑，具有重大的臨床推廣意義。傳統(tǒng)的抗仔豬斷奶應(yīng)激劑主要由微量元素、微量元素氨基酸螯合物及各種稀釋劑和載體物質(zhì)組成，對仔豬的生長發(fā)育存在一定影響，且抗應(yīng)激效果不理想。本研究采用益生型植物乳桿菌為宿主表達pEGF，不僅有利于豬腸道內(nèi)菌群穩(wěn)態(tài)的維持，而且能有效抗仔豬斷奶應(yīng)激。本研究的開展對益生型植物乳桿菌的臨床應(yīng)用及其潛力開發(fā)提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Expression and characterization of porcine epidermal growth factor in

Zemin Zhong1*, Qiang Lai1*, Xiyao Yu1, Dehui Liu2, and Yumao Huang1

1College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China 2 Guangzhou Well Biotechnology Co. LTD, Guangzhou 510663, Guangdong, China

Epidermal growth factor (EGF) is an epithelial cell growth factor that can stimulate intestinal development, repair the damage of epidermal cells as well as reduce the incidence of pathogen infection and diarrhea. In order to produce a recombinantexpressing porcine epidermal growth factor (pEGF), we constructed a recombinant vector stably expressing pEGF instrainsFirst,strain Lp-1 was isolated from intestinal contents of piglets. Then the functional domain of pEGF, M6 precursor protein signal peptide (SP) and super strong constitutive promoter (SCP) were connected with the backbone plasmid pIAβ8 to construct the recombinant vector that was transformed intoLp-1 by electroporation. Afterwards, pEGF was expressed in Lp-1 and detected by Tricine-SDS-PAGE and ELISA. After orally irrigated early-weaned BALB/c mice with the recombinantevery morning and late afternoon for 10 consecutive days, body weight, villous height and crypt depth in the intestine were measured to examine the influence of the recombinant bacteria on the intestinal development of early-weaned mice. Finally, the results of our experiments demonstrated that pEGF was successfully expressed in Lp-1 and the molecular weight of pEGF was 6 kDa. In addition, the recombinant pEGF can enhanced the daily gain and exerted significance influence (<0.05) to the small intestinal morphology of early-weaned BALB/c mice. In conclusion, pEGF could be expressed inand the recombinant pEGF possesses good biological activity.

, porcine epidermal growth factor (pEGF), early-weaned mice, villus height, crypt depth

10.13345/j.cjb.140544

November 11, 2014; Accepted:March 25, 2015

Yumao Huang. E-mail: ymaohuang@scau.edu.cn

*These authors contributed equally to this study.