閆冬，韓金志，別小妹，陸兆新，呂鳳霞，趙海珍，張充

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原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)脂肽LI-F多粘類芽胞桿菌及融合菌株表達差異分析

閆冬，韓金志，別小妹，陸兆新，呂鳳霞，趙海珍，張充

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210095

閆冬, 韓金志, 別小妹, 等. 原生質(zhì)體融合選育高產(chǎn)脂肽LI-F多粘類芽胞桿菌及融合菌株表達差異分析. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(9): 1401–1407.Yan D, Han JZ, Bie XM, et al. Breeding of high-producing LI-F lipopeptide Paenibacillus polymyxa by protoplast fusion and differential expression analysis of fusion strains. Chin J Biotech, 2015, 31(9): 1401–1407.

本研究以多粘類芽胞桿菌JSa-9前期誘變獲得的兩株帶有營養(yǎng)缺陷型標記的菌株N1-37(Phe–)和N2-27(His–)作為親本菌株，采用聚乙二醇作為促融劑，進行原生質(zhì)體融合，篩選出高產(chǎn)LI-F類抗菌脂肽的融合菌株。通過HPLC對融合菌株和原始菌株產(chǎn)LI-F類抗菌脂肽進行定量檢測，并利用實時熒光定量PCR對菌株JSa-9和融合菌株中LI-F類抗菌脂肽合成酶的關(guān)鍵基因A1、A2、C1和C2的差異性表達進行分析。結(jié)果表明，經(jīng)過原生質(zhì)融合獲得一株LI-F類抗菌脂肽高產(chǎn)菌株F5-15。菌株F5-15的LI-F類抗菌脂肽產(chǎn)量為原始菌株產(chǎn)量的3.1倍，LI-F類抗菌脂肽合成酶的4個關(guān)鍵基因在融合菌株F5-15中的表達量分別是其在原始菌株JSa-9中的10.48、2.48、2.1和11.8倍。

原生質(zhì)體制備，原生質(zhì)體融合，實時熒光定量PCR

LI-F類抗菌脂肽是一類由多粘類芽胞桿菌通過非核糖體途徑合成的縮酚肽類環(huán)狀多肽。它是由6個氨基酸殘基和1個脂肪酸鏈 (2-胍基-3-羥基十五烷酸，簡稱GHPD) 組成的環(huán)狀脂肽類抗生素，對革蘭氏陽性細菌特別是金黃葡萄球菌具有顯著的殺菌活性，且能有效地抑制串珠鐮刀菌、黃曲霉菌等絲狀真菌[1-2]。

原生質(zhì)體融合技術(shù)是通過酶解除去微生物的細胞壁，形成由半透性質(zhì)膜包裹著的原生質(zhì)體，隨后在高滲溶液環(huán)境下，借助促融劑或者誘導(dǎo)劑的作用，使2個或以上的種、屬間異源的原生質(zhì)體互相融合，并可以再生出細胞壁以及形成完整的細胞[3]。1974年，F(xiàn)erenczy等[4]通過離心誘導(dǎo)使白地霉營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)生融合。微生物原生質(zhì)體融合技術(shù)是目前細胞工程領(lǐng)域內(nèi)研究的一大熱點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于育種工作中[5]。

在前期研究中，以多粘類芽胞桿菌JSa-9為親本，通過亞硝基胍 (NTG) 誘變育種，獲得了兩株帶有組氨酸營養(yǎng)缺陷型標記的突變菌株N1-37和N2-27，該兩株突變菌株與原始菌株相比較具有高產(chǎn)LI-F類抗菌肽的優(yōu)勢。本研究擬將該兩株突變株作為親本菌株，采用聚乙二醇 (PEG) 作促融劑，以期篩選出高產(chǎn)LI-F類抗菌脂肽的融合菌株。并采用實時熒光定量PCR技術(shù)對融合菌株與原始菌株中LI-F類抗菌肽合成酶關(guān)鍵基因、在轉(zhuǎn)錄水平上的差異性表達進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

多粘類芽胞桿菌JSa-9、N1-37 (Phe–) 和N2-27 (His–)，LB斜面培養(yǎng)基30 ℃條件下生長12 h；金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003，LB斜面培養(yǎng)基37 ℃條件下生長12 h；串珠鐮孢菌ACCC 30174、尖鐮孢菌黃瓜?；蚮. sp.J.H.Owen，均在PDA斜面培養(yǎng)基上28 ℃條件下生長36 h。

1.1.2 主要試劑

溶菌酶 (Lysozyme)，Sigma公司；聚乙二醇 (PEG) 6 000、順丁烯二酸及其他試劑，國藥集團；RNA提取試劑盒、Trizol試劑，上海生物工程股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Perfect real time)，TaKaRa公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與緩沖液

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，Landy 培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基，原生質(zhì)體高滲再生培養(yǎng)基，融合子篩選再生基本培養(yǎng)基，SMM高滲溶液[6]，溶菌酶液；PEG6 000溶液：PEG6 000溶解于不同體積SMM高滲溶液配制成不同濃度的PEG6 000溶液，利用5 mol/L HCl 溶液將PEC6 000溶液調(diào)至工作pH。

1.2 原生質(zhì)體融合方法

1.2.1 原生質(zhì)體的制備

菌株N1-37和N2-27培養(yǎng)至對數(shù)后期，參考韓璞等[7]報道的菌體原生質(zhì)體制備方法進行制備并計算原生質(zhì)體形成率。

原生質(zhì)體形成率 (%) = (?) /′100%。

其中，為總菌落數(shù)，即溶菌酶處理前NA固體平板上的菌落數(shù)；為未原生質(zhì)體化的菌落數(shù)，即溶菌酶處理后NA固體平板上的菌落數(shù)。

1.2.2 原生質(zhì)體的再生

將上述得到的原生質(zhì)體分別用高滲SMM和無菌水梯度稀釋，分別涂布于再生高滲平板和NA固體平板。30 ℃恒溫培養(yǎng)1?2 d，進行菌落計數(shù)，計算原生質(zhì)體再生率。

再生率 (%) = (?) / (?)×100。

其中，為酶解后的再生菌落數(shù) (CFU/mL)；為未形成原生質(zhì)體菌落數(shù)，即未被酶裂解的剩余細胞數(shù) (CFU/mL)；為酶解前的總菌落數(shù) (CFU/mL)。

1.2.3 PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合

參考嚴蔚東[6]報道的芽胞桿菌融合方法進行PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，菌落計數(shù)后計算原生質(zhì)體融合率[8]：

融合率 (%) =2/′100。

其中，為融合株數(shù)；為加入的原生質(zhì)體數(shù)。

根據(jù)原生質(zhì)體的融合率，研究PEG 6 000濃度、PEG6 000 pH、作用時間對原生質(zhì)體融合的影響。

1.2.4 融合子發(fā)酵液的抑菌活性

再生基本培養(yǎng)基平板上挑取單菌落接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)48 h后，5 mm打孔器滅菌后于菌落周圍打孔，挑取瓊脂塊平貼在指示菌平板上。指示菌培養(yǎng)條件為：金黃色葡萄球菌接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h；串珠鐮孢菌和尖鐮孢菌接種于PDA固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3 d，選擇產(chǎn)生最大抑菌圈所對應(yīng)的菌株作為初篩菌株。將初篩菌株接種至Landy培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)72 h，4 ℃、12 000 r/min離心20 min。取上清液50 μL采用瓊脂板打孔加樣法，測定菌液上清的抑菌活性。

1.2.5 融合子產(chǎn)LI-F類抗菌脂肽產(chǎn)量測定

融合子Landy發(fā)酵液12 000 r/min離心20 min，取上清，按1∶1比例加入乙酸乙酯，振蕩混勻，于分液漏斗中靜置過夜。分取上層有機相，下層水相以相同的方法進行二次萃取。兩次得到的有機相50?55 ℃旋蒸至干燥，以發(fā)酵液與甲醇50∶1 (/) 的比例加入甲醇復(fù)溶，離心取上清，0.45 μm濾膜過濾后，經(jīng)高效液相色譜檢測[9]。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性實驗

將篩選的融合子連續(xù)傳代10代并進行液體搖瓶發(fā)酵，提取LI-F類抗菌脂肽并進行HPLC測定 (方法同1.2.5)，考察突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3 融合菌株脂肽合成酶基因表達分析

參照GenBank多粘類芽胞桿菌E681[10]LI-F類抗菌脂肽合成酶基因基因序列，利用Primer premier 5軟件設(shè)計引物序列(表1)。

通過Trizol法提取菌體RNA，將所得到的 RNA 溶液置于–70℃保存或用于后續(xù)試驗。采用SYBRExScriptTMRT-PCRKit(Perfectrealtime)(TaKaRa)試劑盒進行熒光定量實驗。RT-PCR程序為：95 ℃ 30 s，預(yù)變性；95 ℃5 s，變性；60 ℃30 s，復(fù)性；40個循環(huán)。

表1 LI-F類抗菌肽關(guān)鍵合成基因引物設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株N1-37原生質(zhì)體制備和再生條件的選擇

如表2所示，溶菌酶濃度為0.1 mg/mL時再生率明顯高于0.2 mg/mL試驗組。溶菌酶作用7 min時，原生質(zhì)體再生率最高。結(jié)果表明，采用0.1 mg/mL溶菌酶，37 ℃下處理7 min可獲得100%的原生質(zhì)體，再生率分別達到39.52%和31.92%。

2.2 最佳融合條件的選擇

影響原生質(zhì)體融合的因素很多，根據(jù)文獻[11]，初始實驗條件定為pH 9.0，作用時間10 min。

根據(jù)文獻報道[12]，PEG的濃度在30%?50% (/) 更有利于融合。由表3可知，PEG6 000濃度為40%時，融合率達到最大值。當PEG6 000濃度為30%時，濃度較低，不利于雙親原生質(zhì)體進行充分接觸進而融合。PEG6 000濃度為50%時，溶液過于粘稠，同時可能對原生質(zhì)體產(chǎn)生毒害作用，影響融合率[13]。PEG6 000溶液pH為9.0時，融合率高于pH 7.0和pH 8.0試驗組，與相關(guān)文獻報道一致[14]。融合時間從10 min到20 min，在15 min時，融合率達到最大，之后開始迅速下降?？赡苁亲饔脮r間延長，PEG對原生質(zhì)體產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致部分融合子死亡，融合率下降。因此，融合結(jié)束后應(yīng)立即對溶液進行稀釋并離心去除PEG。

綜上所述，進行原生質(zhì)體融合的最佳條件為：PEG6 000濃度為40%，最佳pH值為9.0，最佳融合時間為15 min。

2.3 融合子發(fā)酵液抑菌活性及LI-F類抗菌肽含量的測定

經(jīng)過初篩和復(fù)篩，得到一株抗菌物質(zhì)產(chǎn)量提高的融合子，命名為F5-15，其發(fā)酵液對3種指示菌的抑菌效果見圖1和表4，經(jīng)融合獲得融合子F5-15發(fā)酵液對3種指示菌的抑制效果顯著高于野生菌株JSa-9、親本菌株N1-37和N2-27。

表2 不同酶濃度和酶解時間的組合對N1-37、N2-27原生質(zhì)體再生率的影響

Note: marked with different letters indicate significant difference (<0.05).

表3 不同試驗因素對融合率的影響

Note: marked with different letters indicate significant difference (<0.05).

圖1 融合子F5-15發(fā)酵液對指示菌的抑制效果

將融合子F5-15與親本菌株以及野生型菌株經(jīng)發(fā)酵后提取LI-F類抗菌肽。經(jīng)檢測，以上4株菌LI-F類抗菌肽產(chǎn)量分別為：88.251、50.37、123.83和273.68 mg/L。由此可見，F(xiàn)5-15發(fā)酵液產(chǎn)LI-F類抗菌脂肽的產(chǎn)量為野生菌JSa-9的3.1倍，為親本菌株N1-37和N2-27的1.82倍和2.21倍，具有較高的應(yīng)用價值。

2.4 融合子F5-15傳代遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果

融合子F5-15傳10代培養(yǎng)的結(jié)果如圖2所示， LI-F類抗菌脂肽的產(chǎn)量波動較小，表明經(jīng)篩選得到的融合菌株具有優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性，可作為工業(yè)化生產(chǎn)菌株應(yīng)用。

2.5 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板擴增目的基因

細菌RNA中70%?80%為rRNA，提取得到的RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3A，5S rRNA、 16S rRNA及23S rRNA 三條帶清晰明亮，可以確定RNA的完整性是好的。用260/280(Ratio，R)來確定所提取RNA的純度，實驗測定=1.93，說明所提取的RNA純度較高，可以用于下一步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板用。

表4 融合子F5-15發(fā)酵液對指示菌的抑制效果

Note: marked with different letters indicate significant difference (<0.05).

將所提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并將其作為模板對4個目的基因進行PCR擴增，電泳圖譜如圖3B所示，cDNA作為模板擴增出4個靶基因條帶單一清晰，說明合成的cDNA可以作為模板進行實時熒光定量PCR檢測。

圖2 突變菌株傳代穩(wěn)定性

2.6 樣本中靶基因的相對定量

對原始菌株JSa-9和融合菌株F5-15中的 16S rDNA和目的基因、、、進行實時定量PCR擴增，選取16S rDNA 作為內(nèi)參基因用于校對目的進行ΔΔCT分析，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示、、、在融合菌株F5-15中的表達分別為其在原始菌株JSa-9中表達量的10.48、2.48、2.1和11.8倍。LI-F類脂肽合成酶基因轉(zhuǎn)錄水平的變化與脂肽產(chǎn)量的變化一致。說明原生質(zhì)體融合導(dǎo)致LI-F類脂肽合成的關(guān)鍵酶基因、、、在轉(zhuǎn)錄水平表達量 提高。

圖3 多粘類芽胞桿菌RNA (A)和C2 cDNA作為模板擴增靶基因序列(B)電泳圖譜

表4 多粘類芽胞桿菌融合菌株與原始菌株的ΔΔCT相對定量分析

3 討論

原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物育種中占有重要的地位，該技術(shù)發(fā)展于20世紀70年代，具有很多優(yōu)點，如能夠完整地傳遞遺傳物質(zhì)、有較高的重組頻率等，因此發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛，尤其在提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和改良菌種遺傳性狀方面，發(fā)揮著重要 作用[15]。

在原生質(zhì)體制備、再生和融合過程中，有多重因素影響著每個環(huán)節(jié)。相關(guān)文獻[16]報道，在實驗過程中大多采用對數(shù)生長期或生長中后期的菌株，此時細胞壁中肽聚糖含量最低，細胞對溶菌酶作用最敏感，有利于原生質(zhì)體的形成。制備原生質(zhì)體的最大障礙是細胞壁的存在，通過適當?shù)拿柑幚恚ゼ毎谑顷P(guān)鍵步驟之一[17]。由于不同微生物細胞壁組成成分的差異，制備原生質(zhì)體所用酶種類、濃度以及酶解時間大不相同。陳海昌等[18]認為在一定范圍內(nèi)，酶濃度和酶解時間都與原生質(zhì)體的形成率成正相關(guān)，而當提高酶濃度以及酶作用時間時，原生質(zhì)體再生率顯著下降，與本研究結(jié)果相符合。在融合過程，受到很多種因素影響，如PEG的分子量、濃度、pH、融合時間等[19]。融合中PEG濃度需要控制在適宜范圍之內(nèi)，濃度過低會導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂，濃度過高則對原生質(zhì)體毒害加大。PEG融合時間也不宜過長，否則會導(dǎo)致原生質(zhì)體失活。

SYBR GreenⅠ方法是一種常用的熒光標記方法。由于SYBR GreenⅠ能與所有的雙鏈 DNA相結(jié)合，所以通用性相當好，并且相對探針來說價格低廉，因此在科研中使用比較普遍。但是，也恰恰由于它沒有特異性，只要是和雙鏈結(jié)合就會發(fā)光，因此對PCR反應(yīng)中的引物二聚體或者非特異性擴增也會產(chǎn)生熒光，結(jié)果可能會發(fā)生假陽性[20-21]。所以在引物設(shè)計時應(yīng)特別注意，以避免非特異性擴增的發(fā)生。在本研究中采用SYBR Green I檢測方法，30個循環(huán)內(nèi)沒有非特異性產(chǎn)物擴增，35個循環(huán)內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生，從而可以確定熒光定量PCR反應(yīng)的有效性。2-ΔΔCT法分析結(jié)果顯示該LI-F脂肽合成酶基因轉(zhuǎn)錄水平的變化與脂肽產(chǎn)量的變化一致。

綜上所述，本文對多粘類芽胞桿菌原生質(zhì)體的制備、再生、融合及表達進行了研究。結(jié)果表明原生質(zhì)體融合導(dǎo)致脂肽合成的關(guān)鍵酶基因在轉(zhuǎn)錄水平表達量提高，LI-F類抗菌肽產(chǎn)量增加。這一結(jié)果為研究多粘類芽胞桿菌產(chǎn)LI-F類脂肽的高產(chǎn)菌株的選育，以及為其他種類工業(yè)微生物菌種改良等方面提供了技術(shù)參考。

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(本文責編 郝麗芳)

Breeding of high-producing LI-F lipopeptideby protoplast fusion and differential expression analysis of fusion strains

Dong Yan, Jinzhi Han, Xiaomei Bie, Zhaoxin Lu, Fengxia Lü, Haizhen Zhao, and Chong Zhang

College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

Auxotrophic strains of N1-37 (Phe–) and N2-27 (His–), screened from mutations ofJSa-9 previously, were used as the parent strains to screen high-producing LI-F antibacterial lipopeptide fusion strain through protoplast fusion with polyethylene glycol as a promote agent. Fusion strain F5-15 was obtained. Then the product of LI-F antibacterial lipopeptide was quantified by HPLC, and the difference of expression of the key genes of lipopeptide synthase between wild strain JSa-9 and the fusion strain was analyzed by real-time PCR. LI-F antibacterial lipopeptide yield of the fusion strain F5-15 was 3.1-fold of the original strain JSa9’s, and the expression levels of the target genes were 10.48, 2.48, 2.1 and 11.8 fold of the initial strain JSa-9, respectively.

protoplast preparation, protoplast fusion, real-time PCR

10.13345/j.cjb.140564

November 19, 2014; Accepted: March 9, 2015

National Natural Science Foundation of China (No. 31271828), Key Technologies Research and Development Program of China (No. 2011BAD23B05).

Xiaomei Bie. Tel: +86-25-84396570; E-mail: bxm43@njau.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 31271828), 國家科技支撐計劃 (No. 2011BAD23B05) 資助。