李佳，王金晶，李崎

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18S rDNA介導(dǎo)的基因過表達對酵母自溶性能的影響

李佳1,2，王金晶1,2，李崎1,2

1 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學(xué)釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無錫 214122

李佳, 王金晶, 李崎. 18S rDNA介導(dǎo)的FKS1基因過表達對酵母自溶性能的影響. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(9): 1344–1354.Li J, Wang JJ, Li Q. Overexpression of FKS1 by 18S rDNA targeted influence on yeast autolysis. Chin J Biotech, 2015, 31(9): 1344–1354.

酵母被譽為啤酒釀造的靈魂，然而隨著啤酒高濃釀造技術(shù)的發(fā)展，釀造過程中滲透壓增加、乙醇含量升高及營養(yǎng)平衡改變等會加快酵母的自溶，對啤酒的風(fēng)味品質(zhì)產(chǎn)生不利的影響。為提高酵母的抗自溶能力，本研究構(gòu)建了以釀酒酵母18S rDNA序列為同源位點的過表達菌株。結(jié)果表明，過表達菌株細胞壁葡聚糖含量較原菌高62%；通過平板耐受性分析可知，過表達菌株在8%的乙醇濃度、0.4 mol/L NaCl的滲透壓沖擊以及24 h饑餓培養(yǎng)的條件下，其脅迫耐受性均高于原始菌株；模擬自溶實驗結(jié)果顯示過表達菌株自溶速度緩慢，抗自溶能力明顯優(yōu)于原始菌株。該結(jié)果有助于探究酵母自溶的機理，同時也對提高啤酒風(fēng)味品質(zhì)和穩(wěn)定性有著重要的意義。

釀酒酵母，細胞壁，β-1,3-葡聚糖，抗環(huán)境脅迫，模擬自溶

釀酒酵母是與人類關(guān)系最為廣泛和密切的一種微生物，不僅因為傳統(tǒng)上它用于釀酒和制作面包、饅頭；在現(xiàn)代分子和細胞生物學(xué)中也常被用作模式生物，是研究真核細胞遺傳學(xué)和生理學(xué)的重要工具[1]。因此可謂是工業(yè)界最為重要的微生物之一。

在啤酒發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵過程的深入進行，酵母所處環(huán)境的滲透壓、乙醇濃度不斷升高，營養(yǎng)成分不斷減少[2]，這種變化促使酵母衰老，胞內(nèi)的生物化學(xué)過程受到破壞，各種酶和底物的作用失去協(xié)調(diào)性，致使酵母開始自 溶[3]。自溶過程會促使胞內(nèi)物質(zhì)釋放到胞外，帶給啤酒酵母味、加重的澀味、苦味等風(fēng)味上的改變，同時使酒體的泡持性及風(fēng)味穩(wěn)定性變差，極大地影響了啤酒的品質(zhì)[4]。

酵母細胞壁是抵抗外界環(huán)境刺激的一個非常重要的屏障[5-6]，其堅固程度直接影響著酵母衰老死亡的速度。研究表明，葡聚糖作為酵母細胞壁的重要組成成分，對維持酵母細胞形態(tài)、增加細胞壁堅韌性、抵抗外界環(huán)境刺激等方面發(fā)揮著重要的作用[7]。在釀酒酵母的基因組中，基因直接調(diào)控細胞壁葡聚糖合成酶的表 達[8-10]。因此，可以通過基因的表達來調(diào)控細胞壁，進而影響酵母細胞的自溶。

在酵母基因的過表達過程中，使用最為廣泛的載體分別是附加型載體 (YEP) 和整合型載體 (YIP)[11]。其中YEP型載體具有獨立存活及拷貝數(shù)較高的優(yōu)點，不足之處在于質(zhì)粒容易丟失，即穩(wěn)定性較差；相比之下，YIP型載體當整合入酵母基因組后則特異性高、穩(wěn)定性強，但存在拷貝數(shù)低的問題[11]。所以，拷貝數(shù)高、穩(wěn)定性強的基因過表達方式將會得到很好的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母的XII染色體中存在100?140個拷貝的rDNA[12-15]，并且rDNA的序列有高度的保守性。因此，將此rDNA序列作為同源重組的整合位點可以使目的基因得到高效且穩(wěn)定的過表達，本文即在此理論基礎(chǔ)上構(gòu)建了基因過表達質(zhì)粒，將其整合到釀酒酵母中達到過表達基因的目的。

綜上所述，本研究通過選取18S rDNA為同源重組整合位點，構(gòu)建了過表達釀酒酵母基因的重組菌。結(jié)果表明，和野生菌相比，重組菌的細胞壁葡聚糖含量增多，從而使得其抗自溶能力有了很大的提高。對探究酵母自溶機理、提高啤酒風(fēng)味品質(zhì)及穩(wěn)定性方面發(fā)揮了積極的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

本研究所用的菌株和質(zhì)粒如表1所示。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10。需要時使用前加入氨芐青霉素至100 μg/mL，固體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂，用于大腸桿菌培養(yǎng)。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。制備平板時添加20 g瓊脂，用于酵母培養(yǎng)。篩選轉(zhuǎn)化子時需添加G418至200 μg/mL。固體平板抗性實驗時需添加無水乙醇至8%濃度，NaCl至0.4 mol/L濃度。

DNA聚合酶、DNA聚合酶、Prime STAR Max及克隆載體pMD19T-simple、T4 DNA連接酶、感受態(tài)細胞制作試劑盒、限制性內(nèi)切酶HⅠ、Ⅰ、Ⅱ、Ⅰ、Ⅰ和Ⅰ均購自TaKaRa公司；酵母基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、柱式膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA Bio-Tek公司。其他試劑均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

表1 菌株和質(zhì)粒

1.2 方法

1.2.1 基因的克隆及質(zhì)粒的構(gòu)建

以W303酵母基因組為模板，擴增啟動子序列，得到Ⅰ--ⅡHⅠ片段；將得到的片段與T載體連接構(gòu)建pTP質(zhì)粒。再以W303酵母基因組為模板，擴增基因序列，得到Ⅱ-HⅠ片段；最后通過Ⅱ與HⅠ雙酶切pTP質(zhì)粒及片段，連接構(gòu)建pTPF質(zhì)粒。

以pUG6質(zhì)粒為模板，擴增基因片段，得到ⅠHⅠⅠⅠ片段；將得到的該片段與T載體連接構(gòu)建pTK1質(zhì)粒。再以W303酵母基因組為模板，擴增18S rDNA下臂，即Ⅰ18S rDNAdownⅠ片段；通過Ⅰ與Ⅰ雙酶切連接pTK1質(zhì)粒及下臂片段，構(gòu)建pTK2質(zhì)粒。最后以W303酵母基因組為模板，擴增18S rDNA上臂，即Ⅰ18S rDNAupⅠHⅠ片段；通過Ⅰ與HⅠ雙酶切pTK2質(zhì)粒與上臂片段，構(gòu)建pTK重組質(zhì)粒。

pTPF及pTK重組質(zhì)粒通過Ⅰ與HⅠ雙酶切后連接，構(gòu)建pTPFK質(zhì)粒。再通過Ⅰ與Ⅰ雙酶切獲得目的同源整合線性片段：up-down。將所獲片段按照醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[12]轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后先涂布到Y(jié)PD平板上，24 h后影印[16]到含200 μg/mL G418的平板上，28 ℃培養(yǎng)2?4 d，檢測轉(zhuǎn)化子。片段擴增及轉(zhuǎn)化子驗證所需引物及條件如表2所示：

表2 實驗所需引物及擴增條件

1.2.2 生長性能分析

將釀酒酵母野生對照菌株W303、重組菌W303-KT斜面菌種進行活化，接入裝有10 mL YPD培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，然后以10%的接種量接入裝有30 mL YPD培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，相同條件下培養(yǎng)。先每隔2 h取樣，30 h后逐漸延長取樣間隔時間，測定600值并作酵母生長曲線。

1.2.3 細胞形態(tài)分析

將釀酒酵母野生對照菌株W303、重組菌W303-KT斜面菌種進行活化，接入裝有10 mL 麥汁培養(yǎng)基的試管中，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)18 h；然后1 500 r/min離心10 min收集菌體進行掃描電鏡制樣、鏡檢。

1.2.4 葡聚糖含量分析

樣品處理：首先配制1.0 mol/L氫氧化鈉溶液100 mL，取離心收集的酵母泥5 g加入其中，在90 ℃條件下反應(yīng)3 h，后3 000 r/min離心 15 min，沉淀物水洗2次，無水乙醇洗滌定容[17]。

分光光度計檢測：0.1 mL樣品 + 1.9 mL蒸餾水 + 4.0 mL剛果紅，20 ℃精確保溫10 min后于550 nm下測吸光值。以2.0 mL蒸餾水 + 4.0 mL剛果紅作空白。

β-葡聚糖含量 (mg/L) =××1/×20

式中，為試樣吸光值；為標準曲線上吸光度為1時對應(yīng)的β-葡聚糖μg數(shù)；為吸取稀釋試樣體積的毫升數(shù)；20為試樣稀釋倍數(shù)。

1.2.5 環(huán)境耐受性分析

于斜面試管中取一環(huán)菌接入5 mL YPD液體培養(yǎng)基中(饑餓培養(yǎng)則接入相同體積的無菌水中)，28 ℃培養(yǎng)24 h。用無菌水調(diào)節(jié)菌液濃度使其=1.0，10倍稀釋梯度，依次取2.5 μL點種在含有8%乙醇、0.4 mol/L NaCl的抗性平板上，以及將饑餓培養(yǎng)的按照同樣方法點種在YPD平板上，培養(yǎng)2–3 d，觀察菌落生長情況[18]。

1.2.6 模擬自溶分析

參考王敏等[19]的方法培養(yǎng)和收集酵母，2 g酵母泥加到200 mL的檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.0)(模擬自溶液) 中，于28 ℃、150 r/min放置，定時取樣測定。

酵母細胞死亡率的測定及260和280的測定及比值計算方法參照許維娜等[20]方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建與篩選

2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

參照1.2.1質(zhì)粒的構(gòu)建方法，依次構(gòu)建pTPF和pTK重組質(zhì)粒(圖1和圖2)；通過Ⅰ與Ⅰ雙酶切連接上述兩個質(zhì)粒，構(gòu)建pTPFK質(zhì)粒，通過Ⅰ與Ⅰ、Ⅰ與HⅠ雙酶切分別來驗證轉(zhuǎn)化子(圖3和圖4)。

2.1.2 轉(zhuǎn)化子的篩選及驗證

用醋酸鋰法將所得的目的片段轉(zhuǎn)化入野生對照菌W303，使重組片段兩端的同源臂與目的基因18S rDNA發(fā)生同源重組，即用up--down來替換up-18S rDNA-down。然后通過平板影印法來篩選轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的基因組，使用不同位置的引物進行PCR驗證，引物驗證結(jié)果如圖5所示：A設(shè)計引物擴增18S rDNA-up和間的核苷酸序列，陽性結(jié)果為1 270 bp；B設(shè)計引物擴增和18S rDNA-down間核苷酸片段，陽性結(jié)果為975 bp。最終成功篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，并命名為W303-KT。

圖1 pTPF質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

2.2 重組菌的基礎(chǔ)性能分析

2.2.1 重組菌基因的表達水平和遺傳穩(wěn)定性

本實驗使用實時熒光定量PCR (qRT-PCR) 來分析過表達菌株基因的mRNA表達水平，結(jié)果表明重組菌株基因的表達量約為原菌的10倍(圖6)；同時，為驗證轉(zhuǎn)化菌的遺傳穩(wěn)定性，將原菌和重組菌在無G418選擇壓力的條件下，連續(xù)轉(zhuǎn)接液體YPD 培養(yǎng)10次并用第10代菌液劃線。結(jié)果如圖7所示：重組菌可以在含有200 μg/mL G418的YPD平板上生長，而原菌則不能，表明轉(zhuǎn)化菌的遺傳穩(wěn)定性良好。以上結(jié)果表明基于18S rDNA的過表達拷貝數(shù)高且穩(wěn)定性好。

圖2 pTK質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

圖3 pTPFK質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

圖4 pTPFK質(zhì)粒及酶切電泳圖

圖5 W303-KT轉(zhuǎn)化子基因組驗證結(jié)果

2.2.2 細胞形態(tài)和生長性能

為分析重組菌與原菌的性狀異同點，本實驗對它們進行了細胞形態(tài)觀察，掃描電鏡結(jié)果顯示(圖8)：從外形上看，轉(zhuǎn)化菌與原菌并無大的差別。然而，生長曲線測定結(jié)果則顯示轉(zhuǎn)化菌生長速度始終快于原菌(圖9)。由此推測，基因的過表達加快了細胞壁葡聚糖的合成，從而促進了細胞的生長。

圖6 原菌與重組菌的qRT-PCR分析

A B

2.3 重組菌自溶性能分析

為驗證重組菌抗自溶能力的增強，本實驗首先分析了菌株的葡聚糖含量變化情況，然后通過模擬自溶實驗來評價菌株的自溶性能，最后通過環(huán)境脅迫性分析給予輔證。

圖8 原菌與轉(zhuǎn)化菌的掃描電鏡 (SEM) 分析

圖9 不同菌株的生長曲線

2.3.1 葡聚糖含量分析

葡聚糖含量檢測結(jié)果顯示原菌為 (3.50 ± 0.02)mg/g，重組菌為 (5.68 ± 0.03) mg/g，較原菌增長62%?；驗檎{(diào)控β-1,3-葡聚糖合成酶的關(guān)鍵基因，由于基因的高效過表達，使得細胞壁內(nèi)葡聚糖含量增多。同時，重組菌細胞壁葡聚糖含量的變化為后面的自溶性能分析提供了理論比較依據(jù)。

2.3.2 模擬自溶

本研究采用模擬分析，將不同菌株置于模擬自溶液中進行模擬自溶，以此來觀察菌株的生長變化情況。首先，觀察了酵母細胞在模擬自溶液中的死亡率變化情況，結(jié)果如表3所示：重組菌株的死亡率明顯慢于原始菌株；同時，本實驗還對模擬自溶液過濾后的濾液在260 nm和280 nm處的吸光度值進行測定，并計算260/280，結(jié)果如表4所示。自溶開始時，酵母釋放出的蛋白類物質(zhì)比例較大，260/280的值較?。浑S著自溶程度的增大，自溶液中的核酸類物質(zhì)所占比例越來越大，260/A80的值也逐漸增大，向2.0靠近[20]。

基于本實驗室先前的研究，我們對260/280與酵母的死亡率進行擬合與分析，發(fā)現(xiàn)隨著酵母自溶程度的變化，(260/280)/死亡率呈現(xiàn)明顯且一致的變化趨勢，且酵母自溶程度越大該比值越小。該方法可適用于比較不同菌株的自溶性能，已得到良好的驗證和應(yīng)用[20-21]。在此理論基礎(chǔ)上，W303-KT菌株的抗自溶能力明顯優(yōu)于原始菌株 (數(shù)據(jù)未顯示)。

表3 酵母在自溶液中死亡率的變化

The results are presented as the average for three times.

表4 酵母在自溶液中A260/A280比值的變化

The results are presented as the average for three times.

2.3.3 環(huán)境脅迫性分析

基因是調(diào)控細胞壁完整性途徑中的重要基因之一，該基因的過表達可提高菌株的抗環(huán)境脅迫能力，即抵抗外界刺激的能力，是菌株抗自溶能力增強的重要輔證。結(jié)果表明，在分別含有8%的乙醇、0.4 mol/L NaCl以及饑餓培養(yǎng)的條件下，W303-KT菌株的生長狀況均優(yōu)于原菌 (圖10)。該結(jié)果證明重組菌株具有更強的抵抗環(huán)境刺激的能力，從側(cè)面證明了菌株抗自溶能力的增強。

圖10 不同脅迫條件下菌株生長狀況

3 結(jié)論

酵母是啤酒釀造的靈魂，強壯的酵母可以釀造出品質(zhì)優(yōu)良、風(fēng)味穩(wěn)定性好、無雜異味的啤酒。而酵母自溶是影響啤酒風(fēng)味品質(zhì)的重要因素，自溶過程中會釋放出對啤酒質(zhì)量有較大負面影響的物質(zhì)，使啤酒帶有酵母味，加重苦味、澀味，使啤酒的泡持性及穩(wěn)定性變差，如果有5%的酵母發(fā)生自溶，將對啤酒質(zhì)量造成難以挽回的影響[22-23]。針對酵母自溶的研究，國內(nèi)學(xué)者多從實際生產(chǎn)和工藝角度出發(fā)，方法簡單快捷，但通常不是十分有效[24-25]，并且不能從根本上理解和解決自溶問題；而國外學(xué)者采用的方法因設(shè)備或技術(shù)限制，在國內(nèi)推廣的空間不大。因此需要探索酵母自溶的機理，尋求簡單靈敏的方法來從根本上解決酵母自溶的問題。

本研究從細胞壁的主要成分葡聚糖角度出發(fā)，運用分子生物學(xué)手段過表達葡聚糖合成酶基因，獲得重組菌株W303-KT。研究表明，重組菌株細胞壁中葡聚糖積累量顯著增加，不但增強了酵母菌株對環(huán)境脅迫的抵抗能力，更重要的是，通過模擬自溶實驗證明，過表達菌株的抗自溶能力明顯優(yōu)于原始菌株，該發(fā)現(xiàn)對于進一步研究酵母自溶的機理以及細胞壁完整性途徑(CWI) 的調(diào)控模式和調(diào)控因子功能奠定了基礎(chǔ)，有助于從根本上理解酵母自溶并加以控制和利用，為最終工業(yè)生產(chǎn)風(fēng)味品質(zhì)更優(yōu)、穩(wěn)定性更好的啤酒提供了理論依據(jù)。

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(本文責編 陳宏宇)

Overexpression ofto improve yeast autolysis-stress

Jia Li1,2, Jinjing Wang1,2, and Qi Li1,2

1,,,214122,,2,,214122,,

With the development of high gravity brewing, yeast cells are exposed to multiple brewing-associated stresses, such as increased osmotic pressure, enhanced alcohol concentration and nutritional imbalance. These will speed up yeast autolysis, which seriously influence beer flavor and quality. To increase yeast anti-autolytic ability,overexpression strain was constructed by 18S rDNA. The concentration of β-1,3-glucan of overexpression strain was 62% higher than that of wild type strain. Meantime,overexpression strain increased anti-stress ability at 8% ethanol, 0.4mol/L NaCl and starvation stress. Under simulated autolysis,showed good anti-autolytic ability by slower autolysis. These results confirms the potential ofoverexpression to tackle yeast autolysis in high-gravity brewing.

, cell wall, β-1,3-glucan, anti-stress, the simulation of autolysis

10.13345/j.cjb.140629

December 20, 2014; Accepted: January 22, 2015

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31301539, 31271919).

Qi Li. Tel: +86-0510-86918176; E-mail: liqi@jiangnan.edu.cn

國家自然科學(xué)基金(Nos. 31301539, 31271919) 資助。

2015-02-27

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150227.1114.002.html