李傲婷，杜椅楠，段秀紅，柴曉倩，吳 超，唐 越，于翠平，吳海濤*

內源酶對刺參腸自溶的作用

李傲婷，杜椅楠，段秀紅，柴曉倩，吳 超，唐 越，于翠平，吳海濤*

（大連工業(yè)大學食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

以刺參腸為原料，通過誘導自溶并添加各種酶抑制劑，以三氯乙酸可溶性寡肽和還原糖釋放量為指標，并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法，研究內源酶在刺參腸自溶過程中的作用。結果表明，在一定的濃度范圍內，胃蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、α-淀粉酶抑制劑和β-1,3-葡萄糖苷酶抑制劑對刺參腸的自溶均具有一定的抑制作用，且絲氨酸蛋白酶抑制劑N-甲苯磺酰-L-賴氨酸氯甲基化酮作用較強。說明胃蛋白酶、胰蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、α-淀粉酶和β-1,3-葡萄糖苷酶參與刺參腸自溶過程。

刺參；腸；自溶；內源酶；絲氨酸蛋白酶

海參屬棘皮動物門海參綱，是一種重要的海洋軟體動物[1]。近年來海參養(yǎng)殖業(yè)在亞洲國家發(fā)展迅速[2]。2015年，我國海參產量達20.50萬 t[3]，而刺參（Stichopus japonicus）是我國最重要的人工養(yǎng)殖經濟品種之一[4]。刺參具有極強的自溶能力，在受到外界物理因素、化學因素和生理因素等刺激后，原本正常的生命活動出現紊亂，會發(fā)生吐腸和體壁軟化的現象[5]。刺參體內含有豐富的內源酶，主要為體壁和腸中的復雜酶類[6-7]。鄭杰等[8]采用環(huán)境因子紫外線誘導海參自溶，在考察溫度、pH值、NaCl質量濃度和液料比對海參自溶過程中主要化學成分變化影響的基礎上，建立了海參自溶的評價指標，即三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）可溶性寡肽和還原糖釋放量。

刺參腸作為刺參加工的副產物，其中含有胃蛋白酶和胰蛋白酶[9]、組織蛋白酶B[10]、高堿性蛋白酶[11]、肽水解酶[12]及β-1,3-葡聚糖酶[13]等多種酶類。這些蛋白酶的存在為利用自溶手段制備生物活性寡肽創(chuàng)造了良好的條件，目前已成功獲得具有抗氧化活性的刺參腸自溶寡肽[14-15]。同時，前期研究針對刺參體壁的自溶過程，研究了蛋白酶對其的貢獻作用[16]。然而，針對刺參腸自溶過程中，其內源酶對腸蛋白質作用的影響，目前還鮮見報道。

因此，本實驗以刺參腸為原料，利用胃蛋白酶抑制劑（Pepstain）、胰蛋白酶抑制劑（soybean trypsin inhibitor，SBTI）、絲氨酸蛋白酶抑制劑及糖苷酶抑制劑，以TCA可溶性寡肽和還原糖釋放量為指標，并采用聚丙烯酰胺-凝膠電泳（sodium-dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測刺參腸蛋白質的變化情況，明確各種內源酶在刺參腸自溶過程中的作用，為深入開發(fā)利用刺參腸提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

刺參腸取自新鮮刺參購于大連長興市場，取出刺參腸，去除內容物，去離子水清洗后于-80 ℃冷凍。

Pepstain、SBTI、N-甲苯磺酰-L-賴氨酸氯甲基化酮（N-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone，TLCK）、N-甲苯磺基-L-苯乙胺酰氯甲基酮（N-tosyl-L-phenylalaninylchloromethyl ketone，TPCK）、N,N,N,N-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、丙烯酰胺、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍R-250、Folin-酚溶液 生工生物工程（上海）有限公司；即用型蛋白分子質量標準（高）、即用型蛋白分子質量標準（低） 寶生物工程（大連）有限公司；α-Amylase 、Nojirimycin 美國Sigma公司；TCA、DNS試劑、甘氨酸 天津市科密歐化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

PHS-3精密pH計 上海雷磁儀器廠；AE-6401垂直電泳儀槽 日本ATTO公司；HH-S型水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司；CF16RXII離心機 日本株式會社日立制作所；XW-80A旋渦振蕩器 上海精科實業(yè)有限公司；Infinite200 NANO酶標定量測定儀 瑞士Tecan公司；UV-5200型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；TS.B-108往復式脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；MF-Chemi BIS 2.0凝膠成像儀以色列DNR成像系統(tǒng)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 刺參腸自溶的誘導

根據前期優(yōu)化的刺參腸自溶最優(yōu)條件[15]，將置于冰上緩化的刺參腸勻漿處理后，經58 μW/cm2紫外線照射30 min，于48 ℃誘導自溶3 h，采用McIIvaine’s（0.2 mol/L）緩沖體系（pH 2.2、4.4或8.0），進行蛋白酶抑制劑對刺參腸自溶中蛋白質降解及TCA可溶性寡肽釋放的影響研究，并采用水相體系（自然pH值）研究糖苷酶抑制劑對刺參腸自溶中還原糖釋放量的影響作用。

1.2.2 蛋白酶抑制劑對刺參腸蛋白質降解作用的影響

根據Laemmli[17]的方法并作適當修改。取1.2.1節(jié)所得經紫外照射或未經照射的刺參腸勻漿液300 μL，加入900 μL的200 mmol/L McIIvaine’s緩沖溶液（Pepstain pH 2.2、SBTI pH 8.0、絲氨酸蛋白酶抑制劑pH 4.4）后，于48 ℃孵育3 h。加入等體積的5×上樣緩沖溶液（8 mol/L尿素、5% SDS、5%巰基乙醇、250 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl），煮沸5 min后樣品于搖床過夜。10 000×g離心10 min后，取上清液10 μL，進行SDS-PAGE分析，濃縮膠質量濃度5 g/100 mL，分離膠質量濃度15 g/100 mL，每塊膠濃縮膠電流8 mA，分離膠電流15 mA，電泳緩沖液采用SDS-Tris-甘氨酸體系。電泳完畢后，利用考馬斯亮藍R-250往復振蕩染色，采用凝膠成像儀進行成像。以未自溶的刺參腸組為空白對照，以未添加蛋白酶抑制劑的自溶組為陽性對照。

1.2.3 蛋白酶抑制劑對刺參腸自溶中TCA可溶性寡肽釋放的影響

利用Lowery法測定TCA可溶性寡肽含量[18]。取1.2.2節(jié)所得自溶或未自溶的刺參腸樣品煮沸5 min后，加入等體積的20%的TCA溶液，靜置20 min，經12 000×g離心10 min，取100 μL稀釋一定倍數的上清液，加入Folin-酚甲液500 μL，振蕩后靜置10 min，再加入Folin-酚乙液50 μL，立即振蕩后靜置30 min，500 nm波長處測定吸光度。甲液由2 g/100 mL碳酸鈉溶液及0.4 g/100 mL氫氧化鈉混合溶液-2 g/100 mL酒石酸鉀鈉溶液-1 g/100 mL硫酸銅（100∶1∶1，V/V）溶液混合，現用現配，乙液為Folin-酚溶液。以牛血清蛋白為標準品獲得標準曲線y=0.629x＋0.006 （R2= 0.998）。以未自溶的新鮮刺參腸組為空白對照，以未添加蛋白酶抑制劑的自溶組為陽性對照。根據標準曲線計算TCA可溶性寡肽含量，設空白組樣品為數值為1，計算TCA可溶性寡肽相對含量。

1.2.4 糖苷酶抑制劑對刺參腸自溶中還原糖釋放的影響

利用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖[19]，并稍作修改。取1.2.1節(jié)所得經紫外照射或未經照射的刺參腸勻漿液300 μL，加入900 μL去離子水，加入淀粉酶抑制劑α-Amylase及β-1,3-葡聚糖酶抑制劑Nojirimycin于50 ℃孵育3 h。經12 000×g離心10 min后取上清液500 μL，加入DNS試劑500 μL，于沸水浴中加熱5 min，取出后立即浸入冰上冷卻至室溫，搖勻，在540 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖為標準品繪制標準曲線y=0.000 9x-0.031（R2=0.998 4）。以未自溶的新鮮刺參腸組為空白對照，以未添加糖苷酶抑制劑的自溶組為陽性對照。根據標準曲線計算還原糖的釋放量，設空白組樣品的還原糖含量為1，計算還原糖的相對含量。

1.2.5 數據處理及統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 胃蛋白酶對刺參腸自溶的影響

圖1 Pepstain對刺參腸自溶過程中蛋白質降解作用的影響Fig. 1 Effects of pepstatin on proteolysis during autolysis of sea cucumber guts

利用SDS-PAGE檢測pH 2.2條件下不同濃度的Pepstain對刺參腸蛋白質降解的影響作用，結果如圖1所示。刺參腸本身所含蛋白質較多，約為干質量的70.9%[15]，未自溶樣品電泳條帶呈現彌散狀。經自溶誘導后條帶整體變淺。Pepstain在0.01 mmol/L和0.1 mmol/L這兩種濃度下對刺參腸蛋白質的降解作用有一定抑制，表現為29 kDa以下彌散條帶加深。這表明胃蛋白酶參與刺參腸自溶過程中蛋白質的降解。有研究表明，蛋白酶的活性受pH值的影響很大，硬骨魚類的胃蛋白酶只有在強酸中才能有效地分解蛋白質[20-21]，一般最適pH值在2.0～3.0之間[22]。刺參腸中含有酸性蛋白酶，Fu Xueyan等[11]利用SDS-PAGE法證明刺參腸中的酸性蛋白酶最適pH值在2.0～5.0之間。前期研究顯示刺參腸在pH 4.4條件下，自溶效果最好，在本研究顯示刺參腸在pH 2.2條件下，蛋白質降解程度并不強烈，這與前期發(fā)現一致。

為進一步明確Pepstain對刺參腸自溶的抑制作用，在pH 2.2條件下，進一步考察0.01 mmol/L和0.1 mmol/L的Pepstain對刺參腸自溶過程中TCA可溶性寡肽釋放量的影響，如圖2所示。在pH 2.2條件下，刺參腸經自溶誘導后，其TCA可溶性寡肽含量顯著提高（P＜0.05），向自溶樣品中加入一定濃度的Pepstain后，與自溶組相比，TCA可溶性寡肽的含量顯著降低（P＜0.05）。且隨著濃度提高抑制效果加強，結合SDS-PAGE檢測結果，說明胃蛋白酶參與刺參腸自溶過程。

圖2 Pepstain對刺參腸自溶過程中TCA可溶性寡肽釋放的影響（pH 2.2）Fig. 2 Effects of pepstatin on the release of TCA-soluble oligopeptide during autolysis of sea cucumber guts at pH 2.2

2.2 胰蛋白酶對刺參腸自溶的影響

圖3 SBTI對刺參腸自溶過程中蛋白質降解作用的影響Fig. 3 Effects of trypsin inhibitor on proteolysis during autolysis of sea cucumber guts

采用SDS-PAGE分析pH 8.0條件下SBTI對刺參腸自溶過程中蛋白質降解的影響，結果見圖3。經自溶誘導后，與未自溶樣品對比，44.3 kDa以上的蛋白質降解明顯，29 kDa以下產生很多的降解產物。在pH 8.0的自溶環(huán)境下，SBTI在0.05 mg/mL質量濃度下對刺參腸蛋白質的降解僅有略微的抑制作用，表現為44.3 kDa以上的蛋白質條帶與自溶樣品相比僅略微加深。大量研究表明水產動物如虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[23]、金槍魚（Thunnus albacores）[24]及嘉陵江鲇[25]等，其胰蛋白酶在pH 8.0條件下活性較高，本實驗結果說明，在pH 8.0條件下胰蛋白酶對刺參腸的自溶影響微弱。

為進一步明確SBTI對刺參腸自溶的抑制效果，考察pH 8.0條件下，0.05 mg/mL和0.1 mg/mL質量濃度的SBTI對刺參腸自溶過程中TCA可溶性寡肽釋放量的影響，結果如圖4所示。在pH 8.0條件下，刺參腸經自溶誘導后，TCA可溶性寡肽含量顯著提高（P＜0.05），TCA可溶性寡肽的相對含量僅為2.68±0.03，小于pH 2.2酸性條件下的TCA可溶性寡肽的相對含量為3.33±0.07，說明酸性條件更有利于刺參腸的降解。向自溶樣品中加入一定濃度的SBTI后，與自溶組相比，TCA可溶性寡肽的含量顯著降低（P＜0.05），但兩種濃度作用基本相同（P＞0.05），綜合SDS-PAGE分析和TCA可溶性寡肽兩項指標，表明胰蛋白酶雖參與刺參腸的自溶，但作用微弱。

圖4 SBTI對刺參腸自溶過程中TCA可溶性寡肽釋放的影響Fig. 4 Effects of trypsin inhibitor on the release of TCA-soluble oligopeptide during autolysis of sea cucumber guts

2.3 絲氨酸蛋白酶抑制劑對刺參腸自溶的影響

圖5 絲氨酸蛋白酶抑制劑對刺參腸自溶過程中蛋白質降解作用的影響Fig. 5 Effects of serine protease inhibitors on proteolysis during autolysis of sea cucumber guts

Yan Longjie等[26]成功從海參腸中純化得到一種絲氨酸蛋白酶，由此可見海參腸中含有含量豐富的絲氨酸蛋白酶，利用SDS-PAGE分析pH 4.4條件下不同濃度的絲氨酸蛋白酶抑制劑，TLCK、TPCK對刺參腸蛋白質降解的影響作用，如圖5所示。經自溶誘導后，與未自溶樣品對比刺參腸蛋白質降解劇烈。在pH 4.4的自溶條件下，絲氨酸蛋白酶抑制劑TPCK在0.1 mmol/L和1 mmol/L兩種濃度下對刺參腸蛋白質的降解均有一定的抑制作用，表現為分子質量大于29.0 kDa及小于20.1 kDa的蛋白質的條帶加深，與TPCK相似，TLCK對自溶刺參腸的蛋白質降解有明顯的抑制作用，上述結果說明，絲氨酸蛋白酶參與刺參腸自溶過程中。

圖6 絲氨酸蛋白酶抑制劑對刺參腸自溶過程中TCA可溶性寡肽釋放的影響Fig. 6 Effects of serine protease inhibitors on the release of TCA-soluble oligopeptide during autolysis of sea cucumber guts

考察pH 4.4條件下，0.1 mmol/L和1 mmol/L濃度下的兩種絲氨酸蛋白酶抑制劑TLCK、TPCK對刺參腸自溶過程中TCA可溶性寡肽釋放量的影響作用，如圖6所示。在pH 4.4條件下，刺參腸經自溶誘導后，TCA可溶性寡肽含量顯著提高（P＜0.05），其相對含量可達到3.98±0.31，強于在pH 2.2和pH 8.0條件下的刺參腸TCA可溶性寡肽相對含量，這與前期發(fā)現一致[15]。向自溶樣品中加入一定濃度的絲氨酸蛋白酶抑制劑后，與自溶組相比，TCA可溶性寡肽的含量顯著降低（P＜0.05），且TLCK的作用效果強于TPCK。均與SDS-PAGE檢測結果一致。上述結果說明，絲氨酸參與刺參腸的自溶，相比于胃蛋白酶和胰蛋白酶，其作用效果較強。研究發(fā)現，刺參腸的天然pH值為6.0±0.02，呈現弱酸性，由于消化酶的活性受pH值影響較大，因此本實驗在應用各種蛋白酶抑制劑時，對于消化酶選擇其最適pH值條件下進行，而對于絲氨酸蛋白酶，選擇在刺參腸最適的pH值下進行，這可能導致不同抑制劑對刺參腸自溶作用不同的原因。

2.4 糖苷酶對刺參腸自溶中還原糖釋放的影響

α-淀粉酶抑制劑是屬于糖苷水解酶抑制劑中的一種，它能有效地抑制淀粉酶的活性[27]。β-1,3-葡聚糖酶抑制劑是一類新的抗真菌抗生素，它通過抑制葡聚糖合成酶，而干擾細胞壁的合成，從而產生抗真菌作用[28]。β-1,3-葡聚糖苷酶主要分布于海洋無脊椎動物動物中，有研究表明該酶參與海洋無脊椎動物對藻類食物的消化，并在其胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[29-30]。為明確糖苷酶抑制劑對刺參腸自溶中還原糖釋放量的影響，分別考察自然pH值條件下，0.01 mmol/L和0.05 mmol/L兩種濃度的糖苷酶抑制劑，α-Amylase、Nojirimycin的作用，如圖7所示。自然pH值條件下，刺參腸經自溶誘導后，還原糖釋放量顯著提高（P＜0.05），這與前期結果一致[8]，向自溶樣品中加入一定濃度的β-1-3-葡聚糖酶抑制劑和α-淀粉酶抑制劑后，與自溶組相比，自溶過程中的溶出的還原糖明顯下降（P＜0.05），上述結果表明淀粉酶和β-1,3葡萄糖苷酶均參與了刺參腸的自溶過程。

圖7 糖苷酶抑制劑對刺參腸自溶過程中還原糖釋放量的影響Fig. 7 Effects of glycosidase inhibitors on the release of reducing sugar during autolysis of sea cucumber S. japonicus guts

3 結 論

刺參腸自溶后，其蛋白質會發(fā)生明顯的降解，同時TCA可溶性寡肽和還原糖釋放量顯著提高。結合SDSPAGE檢測，發(fā)現刺參腸自溶過程中，多種酶參與其中，胃蛋白酶、胰蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、α-淀粉酶和β-1,3-葡萄糖苷酶均參與了刺參腸自溶過程。

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Effect of Endogenous Enzymes on Autolysis of Sea Cucumber Stichopus japonicus Guts

LI Aoting, DU Yinan, DUAN Xiuhong, CHAI Xiaoqian, WU Chao, TANG Yue, YU Cuiping, WU Haitao*
(National Engineering Research Center of Seafood, School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

The effect of endogenous enzymes on the autolysis of sea cucumber (Stichopus japonicas) guts was studied by addition of various protease inhibitors. The autolysis was evaluated by the release of trichloroacetic acid (TCA)-soluble oligopeptides and reducing sugar, and detected by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).The results indicated that different inhibitors, including pepsin inhibitor, trypsin inhibitor, serine protease inhibitor, amylase inhibitor and β-1,3-glucanase inhibitor showed inhibitory effects on the autolysis of S. japonicus guts in a certain range of concentration. The serine protease inhibitor N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethyl ketone (TPCK) showed relatively higher inhibitory effect than the other inhibitors. These results suggest endogenous enzymes, including pepsin, trypsin, serine proteases, amylase and β-1,3-glucanase, may be involved in the autolysis of S. japonicus guts.

Stichopus japonicus; guts; autolysis; endogenous enzymes; serine proteases

10.7506/spkx1002-6630-201802014

TS254

A

1002-6630（2018）02-0088-05

李傲婷, 杜椅楠, 段秀紅, 等. 內源酶對刺參腸自溶的作用[J]. 食品科學, 2018, 39(2): 88-92.

10.7506/spkx1002-6630-201802014. http://www.spkx.net.cn

LI Aoting, DU Yinan, DUAN Xiuhong, et al. Effect of endogenous enzymes on autolysis of sea cucumber Stichopus japonicus guts[J]. Food Science, 2018, 39(2): 88-92. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802014. http://www.spkx.net.cn

2016-11-02

國家自然科學基金面上項目（31370037）；大連市高層次人才創(chuàng)新支持計劃項目（2015R083）

李傲婷（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：756574359@qq.com

*通信作者簡介：吳海濤（1980—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：wht205@163.com