李銳，鄒茜，孫玉林，王林，李想，馮明會*

1(嶺南師范學院 生命科學與技術學院，廣東 湛江，524048) 2(四川旅游學院，四川 成都，610100)3(云南省農(nóng)業(yè)科學院 糧食作物研究所，云南 昆明，650205)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)，俗稱小龍蝦，自1929年由日本引入我國之后，在我國推廣養(yǎng)殖。2016年我國小龍蝦總產(chǎn)量達到89.91萬t，是全世界世界最大的小龍蝦生產(chǎn)國[1]。克氏原螯蝦味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛，也帶動了我國小龍蝦加工業(yè)的發(fā)展?？耸显r在加工過程中有接近整蝦質量50%～ 80%的蝦頭、蝦殼被廢棄或者加工成飼料，造成嚴重的環(huán)境污染和資源浪費[2]。據(jù)研究，克氏原螯蝦蝦頭中粗蛋白含量為13.13%，同時含有豐富的蝦青素、脂類和生物活性物質，可以作為優(yōu)良的蛋白質來源[3]。如何高效回收利用克氏原螯蝦加工副產(chǎn)物中的蛋白，已成為近些年來研究的一個熱點。

酶解法具有操作方便、對營養(yǎng)物質破壞小等優(yōu)點，被廣泛應用于動物蛋白的回收。蝦頭經(jīng)酶解處理，其產(chǎn)物中含有大量的短肽、氨基酸等鮮味物質，可以開發(fā)為蝦味海鮮調味品或食品添加劑，具有廣闊的市場前景[4-5]。趙利等[6]采用堿性蛋白酶回收克氏原螯蝦蝦頭和蝦殼中的蛋白質，其酶解產(chǎn)物中含有豐富的呈味氨基酸和肽類，可以用于制備蝦味調味料。錢飛等[7]以克氏原螯蝦蝦頭為原料，通過堿性蛋白酶水解，得到具有濃郁蝦風味的呈味基料。汪倩等[8]以堿性蛋白酶水解克氏原螯蝦副產(chǎn)物所得蛋白肽為原料，制備得到具有抗氧化性的美拉德反應產(chǎn)物，實現(xiàn)蝦頭蛋白的高效利用。目前國內外食品界主要使用商業(yè)蛋白酶回收蝦頭蛋白質，存在成本較高的問題，影響食品企業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)。

克氏原螯蝦的大部分消化器官都集中在蝦頭，因此蝦頭中含有豐富的內源蛋白酶。有研究學者報道指出，蝦頭中存在活性很高的類胃蛋白酶和類胰蛋白酶2種主要蛋白酶[9-11]。這些蛋白酶在一定條件下被激活，可以將自身組織的蛋白質分解為短肽、氨基酸，可以實現(xiàn)以較低的成本回收蝦頭蛋白質[12-13]。本文以克氏原螯蝦蝦頭為原料，采用紫外輻射法激活克氏原螯蝦蝦頭的內源蛋白酶，在此基礎上利用內源酶制備蝦頭酶解液，并研究自溶前后鮮味物質的變化，以期為克氏原螯蝦加工副產(chǎn)物的高值化利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

克氏原螯蝦蝦頭:鮮活的克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)，購于四川省成都市青羊區(qū)麥德龍超市，洗凈瀝干水分后取蝦頭，分裝保存于-20 ℃?zhèn)溆?蝦頭基本營養(yǎng)成分為：水分含量(74.13±0.46)%，粗蛋白含量(13.68±0.23)%，粗脂肪含量(5.49±0.14)%，灰分含量(6.68±0.08)%)。IMP、GMP、ATP、ADP、AMP、HxR、Hx標準品(純度≥99.0%)，購于美國Sigma公司；甲醇、乙腈，均為色譜純；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

DK-98-1型恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；自動凱氏定氮儀，德國Thermo公司；MBL50型高速均質機，上海默格機械有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器，北京華人新創(chuàng)科技有限公司；835-50型高速氨基酸自動分析儀，日本Hitachi公司；PB-10型酸度計，德國Sartorius公司；SB-5200型超聲波清洗器，上海新芝生物技術研究所；Agilent 1200型半制備高效液相色譜儀，美國Agilent公司；CF16RX型高速冷凍離心機，日本Hitachi公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫外誘導克氏原螯蝦蝦頭自溶工藝優(yōu)化

1.2.1.1 技術路線

蝦頭→解凍→粉碎→紫外照射→加水均質→調節(jié)pH→恒溫攪拌反應→滅酶→離心→酶解液

1.2.1.2 紫外誘導克氏原螯蝦蝦頭自溶酶解產(chǎn)物的制備

蝦頭自溶工藝參考曹文紅等[14]的方法，稍作改動。原料預處理：取冷凍的克氏原螯蝦蝦頭，置于4 ℃解凍，粉碎后置于波長為250 nm、功率為30 W的紫外燈下照射，然后按料液比1∶1(質量比)的比例加入去離子水均質10 min(轉速6 000 r/min)，用0.1 mol/L醋酸鈉溶液調節(jié)pH值，恒溫攪拌反應，自溶結束后置于90～100 ℃的水浴中加熱10 min，使內源蛋白酶失活。將溶液于轉速4 500 r/min、溫度4 ℃下離心10 min，取上清液即為蝦頭酶解液。

1.2.1.3 紫外誘導克氏原螯蝦蝦頭自溶單因素實驗

紫外誘導克氏原螯蝦蝦頭自溶反應的固定條件為：紫外照射時間30 min，自溶初始pH值8.0，自溶反應溫度50 ℃，自溶反應時間3 h。固定其他條件不變，改變其中某個因素條件分別分析對蝦頭酶解液水解度的影響。設置各因素的梯度分別為：紫外照射時間0、10、20、30、40、50、60 min，自溶初始pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，自溶溫度35、40、45、50、55、60、65 ℃，自溶時間0、1、2、3、4、5、6 h。反應結束后于80 ℃加熱20 min終止反應；于4 500 r/min離心10 min，上清液即為樣品液。

1.2.1.4 響應面分析試驗設計

在單因素實驗的基礎上，選擇對蝦頭水解度影響較大的紫外照射時間、自溶初始pH值、自溶溫度3個因素，按照Box-Bohnken設計法每個因素取3個水平，以(-1，0，1)編碼進行實驗，以水解度為響應值建立二次響應面數(shù)學模型，尋找最佳的自溶條件。共有17個試驗，其中12個為析因點，5個為零點以估計誤差。每個試驗重復3次，試驗結果為測定結果的平均值±標準偏差。因素與水平見表1。

表1 響應面因素與水平設計Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.2 水解度測定

氨基態(tài)氮含量的測定參考NILSANG等[15]的方法。取1 mL的樣品溶液和2 mL的去離子水加入250 mL的錐形瓶，再加入10 mL去離子水，用0.05 mol/L的NaOH溶液將pH調到7.0，再加入4 mL 18%(體積分數(shù))的甲醛溶液，混勻后用0.05 mol/L的NaOH溶液將pH滴定至9.5，記錄滴定消耗的NaOH溶液體積，計算樣品中氨基態(tài)氮的含量；原料總氮和非蛋白氮含量采用微量凱氏定氮法測定。

水解度(degree of hydrolysis, DH)的計算公式如下:

(1)

式中：A為樣品中總氮量；B為樣品中的氨基氮量；C為樣品中的非蛋白氮量。

1.2.3 感官評價

感官評價采用描述分析法[16]。樣品評價前，置于60 ℃恒溫水浴加熱10 min，然后稀釋5倍并用統(tǒng)一的容器盛裝，隨機取樣進行感官評價。根據(jù)感官評定標準(表2)，選取經(jīng)過感官評定培訓的10人組成感官評價小組，對樣品的鮮味、苦味、腥味、醇厚感和后味進行打分，每項總分為10分，逐項評分后取平均值作出風味雷達圖。在評價前12 h，禁止評價員吸煙、飲酒，吃刺激性食物。

1.2.4 游離氨基酸測定

樣品用酸水解法處理，然后用全自動氨基酸分析儀測定游離氨基酸的含量。

1.2.5 呈味核苷酸測定

樣品前處理：取樣品溶液10 mL，加入30 mL體積分數(shù)8%冷的高氯酸溶液均質2 min(轉速6 000 r/min)。在4 ℃條件10 000 r/min離心20 min，取上清液，沉淀重新提取兩次，上清液用10 mol/L的KOH調節(jié)pH 6.5，在0 ℃保存30 min以沉淀高氯酸鉀，過濾取上清液，用8%冷的高氯酸溶液定容至50 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 感官評定標準表Table 2 Standard of sensory evaluation

HPLC條件：色譜柱為Waters C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；柱溫25 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL；流動相為含有1%甲醇的0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH 6.5)；采用等度洗脫方法，流速為0.7 mL/min。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

實驗結果用平均值±標準偏差表示(n=3)，使用Origin 8.0和SPSS 22.0 軟件進行作圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結果與討論

2.1 紫外誘導克氏原螯蝦蝦頭自溶反應單因素試驗

紫外照射時間、自溶初始pH值、自溶溫度和自溶時間對克氏原螯蝦蝦頭水解度的影響如圖1。

圖1 紫外照射時間、自溶初始pH值、自溶溫度和自溶時間對克氏原螯蝦蝦頭水解度的影響
Fig.1 Effect of ultraviolet irradiation time, autolysis initial pH, autolysis temperature and autolysis time on
degree of hydrolysis ofProcambarusclarkiahead

由圖1-a可知，隨著紫外照射時間的增加，克氏原螯蝦蝦頭水解度先增加后略有降低，在30 min時水解度取得最大值。當照射時間小于30 min時，由于紫外線的誘導作用，激活了蝦頭的內源蛋白酶，促進蛋白質降解，提高了水解效果；照射時間超過30 min時，由于紫外線過度作用，使得酶分子的結構發(fā)生變化，降低了酶的活性，進而減緩蝦頭蛋白的水解[17]。因此，紫外照射時間選擇30 min左右為宜。由圖1-b可知，隨著pH值增加，克氏原螯蝦蝦頭酶解液水解度先增大后減小，pH值8.0時取得最大值。這一結果與田申等[12]的試驗結果相一致。由于pH值為7.0和8.0時，其蝦頭水解度之間沒有顯著性差異(P>0.05)，考慮到食品工業(yè)生產(chǎn)中的效率和能耗等問題，確定自溶初始pH值為7.0為宜。溫度是影響酶活力的主要因素，酶在最適溫度下活力最高，增加或降低溫度均影響酶活力，內源蛋白酶酶解蝦頭蛋白的最適溫度為50 ℃(圖1-c)，此溫度下酶活力最強，最利于蝦頭蛋白水解。這一結果與曹文紅等[14]的試驗結論近似，酶解溫度50℃為宜。由圖1-d可知，隨著酶解時間的增長，3 h時蝦頭蛋白自溶基本完成，達到平衡，隨后增加自溶時間對蝦頭蛋白水解度影響不大。因此，自溶時間選擇 3 h較為合適。

2.2 響應面結果分析

2.2.1 響應面結果及方差分析

根據(jù)Box-Behnken設計方法得到17組試驗結果，其設計方案及結果見表2。利用Design Expert 8.0.5軟件對響應面試驗結果進行二次多元回歸分析，對表2的數(shù)據(jù)進行方差分析并除去不顯著項得到模型的二次多項回歸方程為：y=44.17+1.43A+1.44B-1.20AC-5.05A2-4.63B2-1.66C2。

表2 響應面設計方案及結果Table 2 Design and result of response surface analysis

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

由表3可知，模型的P值小于0.000 1，而失擬項不顯著(P=0.222 1>0.05)，表明模型是極顯著的。另外，因素一次項(A、B)、交互項AC、二次項(A2、B2、C2)對結果影響是極顯著(P<0.01)，一次項C、交互項AB、BC對結果影響不顯著(P>0.05)。同時，軟件分析的復相關系數(shù)R的RAdj2值為97.93%，表明模型中殘差相互獨立，擬合程度良好，實驗誤差小，可用于對紫外誘導克氏原螯蝦蝦頭自溶工藝進行分析和預測。

2.2.2 響應曲面圖分析

根據(jù)回歸方程的分析結果，考察紫外誘導克氏原螯蝦蝦頭自溶工藝中紫外照射時間、自溶初始pH、自溶溫度3個因素之間交互作用對水解度的影響如圖2～圖4所示。

圖2顯示紫外照射時間為30 min時，自溶初始pH值和自溶溫度對克氏原螯蝦蝦頭水解度的交互影響效應。從圖2可知，隨著自溶溫度的升高，水解度的變化較為平緩。曲面的投影圖中，等高線變化趨勢近似于一條直線，說明自溶溫度與自溶初始pH值交互作用對蝦頭自溶水解度影響不顯著。等高圖中形成封閉的圓圈，說明在因素變化范圍內出現(xiàn)極大值。

圖2 自溶初始pH和自溶溫度對水解度影響的
三維曲面圖
Fig.2 Three-dimensional curved surface for effect of
autolysis initial pH and autolysis temperature on degree
of hydrolysis

圖3顯示自溶初始pH值為7.0，紫外照射時間和自溶溫度對克氏原螯蝦蝦頭水解度的交互影響效應。在測定范圍內，隨著紫外照射時間的增加，蝦頭水解度先升高后降低。曲面圖的投影圖中，等高線變化趨勢為一條弧線，這說明紫外照射時間和自溶溫度對蝦頭自溶水解度影響較為顯著。另外曲面投影的等值線形成一個封閉的圓圈，說明其在因素變化范圍內，出現(xiàn)有最大值。

圖3 紫外照射時間和自溶溫度對水解度影響的
三維曲面
Fig.3 Three-dimensional curved surface for effect of
ultraviolet irradiation time and autolysis temperature on
degree of hydrolysis

圖4顯示自溶溫度為50 ℃時，自溶初始pH值和紫外照射時間對克氏原螯蝦蝦頭水解度的交互影響效應。根據(jù)曲面投影的等高圖，在因素變化范圍內，等高線變化趨勢較為平緩，說明紫外照射時間與自溶初始pH值交互作用對蝦頭自溶水解度影響不顯著。等高圖中形成封閉的圓圈，說明在因素變化范圍內存在極大值。

圖4 自溶初始pH和紫外照射時間對水解度影響的
三維曲面
Fig.4 Three-dimensional curved surface for effect of
autolysis initial pH and ultraviolet irradiation time on degree
of hydrolysis

2.2.3 紫外誘導克氏原螯蝦蝦頭自溶工藝最優(yōu)方案與驗證試驗

為了得到最佳工藝方案，對所得回歸方程取一階偏導數(shù)，解方程組后可得：A=22.94,B=7.16,C=50.36，即為紫外照射時間22.94 min，自溶初始pH 7.16，溫度50.06 ℃，在此條件下克氏原螯蝦蝦頭水解度達44.39%?？紤]到實際操作條件，確定紫外誘導克氏原螯蝦蝦頭自溶最佳工藝條件為：紫外照射時間23 min，自溶初始pH 7.2，溫度50 ℃，自溶時間3 h。為檢驗回歸方程所預測結果的可靠性，在最優(yōu)條件下進行3次驗證性實驗，實際測得的蝦頭蛋白酶解液水解度為(45.88±1.37)%(P<0.05)，所得實際值與理論值的平均誤差為3.36%。試驗結果充分驗證了該模型的正確性，所得到的二次多項回歸方程可以較準確預測紫外誘導克氏原螯蝦蝦頭自溶水解度。

2.3 克氏原螯蝦蝦頭自溶前后鮮味物質的變化

2.3.1 克氏原螯蝦蝦頭原液和自溶產(chǎn)物的感官評價

克氏原螯蝦蝦頭原液和自溶產(chǎn)物的感官評定結果見圖5?？耸显r蝦頭經(jīng)過自溶，蛋白酶解液的腥味和苦味有所減少，同時鮮味和醇厚感味顯著增加(P<0.05)。蝦頭蛋白在自溶過程中，隨著內源蛋白酶的作用，蝦頭蛋白被分解為小分子肽和游離氨基酸?？耸显r蝦頭自溶后蛋白酶解液中的鮮味，主要來源于酶解過程中產(chǎn)生的鮮味和甜味氨基酸[19]。與氨基酸相比，小分子肽的鮮味較弱，主要賦予食品可口的味覺，能與其他呈味物質相互協(xié)調構建令人愉悅的風味，如IMP與Glu-Glu有協(xié)同效應[20-21]。自溶后小分子肽含量增加，使得蝦頭自溶酶解產(chǎn)物的醇厚感和后味得以提升。

圖5 紫外誘導克氏原螯蝦蝦頭原液和自溶產(chǎn)物的
感官評價
Fig.5 Sensory evaluation ofprocambarusclarkiahead
original fluid and autolysis products

2.3.2 克氏原螯蝦蝦頭自溶前后游離氨基酸含量的變化

克氏原螯蝦蝦頭原液和自溶產(chǎn)物中游離氨基酸含量如表4所示。游離氨基酸是克氏原螯蝦蝦頭自溶產(chǎn)物鮮味物質的重要組成成分。鮮味氨基酸主要指一些具有鮮味的L型天然氨基酸，如天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu，俗稱味精)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)，其中谷氨酸一鈉(monosodium glutamate，MSG)是鮮味物質的典型代表[19]。除此之外，苯丙氨酸和酪氨酸具有特殊的鮮甜味，對蝦頭酶解液的整體鮮味也有重要作用。

蝦頭經(jīng)過自溶后，其自溶產(chǎn)物中游離氨基酸總量為8 605.45 mg/kg，與蝦頭原液相比，增加了1.29倍，其中精氨酸、賴氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的含量較高，均在700 mg/kg以上，此5種氨基酸即占游離氨基酸總量的51.53%。在所有氨基酸當中，精氨酸含量最高，為1 085.37 mg/kg。精氨酸是略帶苦味的甜味氨基酸，與其他氨基酸相互協(xié)調，具有增加醇厚感和提高鮮度的作用[22]。與蝦頭原液相比，克氏原螯蝦蝦頭自溶產(chǎn)物中丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)4種呈鮮味的氨基酸總含量增加1.41倍，達2 150.12 mg/kg，占游離氨基酸總量的24.99%，其中丙氨酸的含量較高為816.33 mg/kg。蝦頭經(jīng)過自溶之后，蛋白酶解產(chǎn)生大量氨基酸，使得自溶產(chǎn)物的鮮味大大提升，整體滋味更加醇厚鮮美。蝦肉及其酶解產(chǎn)物中游離氨基酸的含量和組成，對其滋味的鮮美程度有著重要的影響作用，特別是丙氨酸、谷氨酸和甘氨酸這3種氨基酸的影響最大，這一發(fā)現(xiàn)與田申等[12]、沈月新等[23]的研究結果相一致。

表4 克氏原螯蝦蝦頭原液和自溶產(chǎn)物中游離氨基酸的含量Table 4 The concent of free amino acids in Procambarusclarkia head original fluid and autolysis products

注：鮮味氨基酸包括天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸。

2.3.3 克氏原螯蝦蝦頭自溶前后呈味核苷酸及其關聯(lián)化合物含量的變化

核苷酸及其關聯(lián)化合物是影響克氏原螯蝦蝦頭自溶產(chǎn)物中鮮味的另一關鍵成分。一般認為，鳥苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)具有突出的鮮味，是食品工業(yè)中常用的鮮味劑[19]。AMP具有協(xié)調整體滋味的作用，能夠壓抑苦味增強整體的醇厚感，使食物產(chǎn)生較為柔和的甜味和鮮味。ATP降解得到的一種最終產(chǎn)物——次黃嘌呤會產(chǎn)生苦味，會使產(chǎn)物整體滋味變差[24-25]。據(jù)報道，在魚蝦貝等生物體內，核苷酸化合物主要由核苷酸的降解途徑以及降解程度來決定的。ATP的降解存在兩條途徑[26]：(1)ATP→ADP→AMP→ADR→HxR→Hx；(2)ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx。由表5結果可知，克氏原螯蝦蝦頭原液和自溶產(chǎn)物中呈味核苷酸及其關聯(lián)化合物總含量變化不大(P>0.05)。自溶產(chǎn)物中HxR含量最高，為188.43 mg/kg，其次是Hx含量為77.46 mg/kg，而與鮮味有著密切聯(lián)系的IMP含量分別為8.36 mg/kg，增加了47.18%。自溶前后，蝦頭中ATP的含量變化最大，從8.08 mg/kg降低到3.12 mg/kg，原因可能為自溶過程中ATP降解為其他物質。

表5 克氏原螯蝦蝦頭原液和自溶產(chǎn)物中ATP以及關聯(lián)化合物的含量Table 5 Contents of ATP related compounds inProcambarus clarkia head original fluid and autolysisproducts

注：*表示反應前后含量差異顯著(P<0.05);ND表示未檢測出。

3 結論

克氏原螯蝦蝦頭中含有豐富的內源酶，通過紫外線照射可以誘導其發(fā)生自溶反應。通過響應面中心組合設計優(yōu)化紫外誘導克氏原螯蝦蝦頭自溶工藝參數(shù)，從而建立以紫外照射時間、自溶初始pH和自溶溫度3個因素對克氏原螯蝦蝦頭水解度的回歸模型：Y=44.17+1.43A+1.44B-1.20AC-5.05A2-4.63B2-1.66C2。經(jīng)過驗證試驗證明，該模型可以預測克氏原螯蝦蝦頭自溶水解度的變化規(guī)律，適用于實際生產(chǎn)中的預測。根據(jù)回歸模型，得到最佳自溶條件為：紫外照射時間22.94 min，自溶初始pH 7.16，溫度50.06 ℃，自溶時間3 h。在此條件下克氏原螯蝦蝦頭水解度達44.39%。

通過感官評價和理化指標，對克氏原螯蝦蝦頭原液和自溶產(chǎn)物中的鮮味物質進行分析，結果表明，克氏原螯蝦蝦頭經(jīng)過自溶后，其腥味和苦味降低的同時，鮮味和醇厚感顯著增加(P<0.05)；與蝦頭原液相比，自溶產(chǎn)物中鮮味氨基酸總量(2 150.12 mg/kg)和游離氨基酸總量(8 605.45 mg/kg)均顯著增加，分別增加了1.41倍和1.29倍；呈味核苷酸及其關聯(lián)化合物總量變化不大(P>0.05)，與鮮味有著密切聯(lián)系的肌苷酸(IMP)為8.36 mg/kg，增加了47.18%。本實驗結果為蝦類加工副產(chǎn)物的高值化利用提供理論基礎。