秦修遠(yuǎn)，劉文穎，陳立城，劉戚，魯軍，谷瑞增，蔡木易*，張春樂*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)2(廣東中食營科生物科技有限公司，廣東 東莞，523122)

大量科學(xué)研究表明，經(jīng)蛋白酶水解蛋白質(zhì)得到的生物活性多肽，具有很好的溶解性，更容易被消化吸收，并且具有許多獨(dú)特的生理功能[1]。豌豆低聚肽是對豌豆蛋白進(jìn)行酶解得到的多肽，研究表明，豌豆低聚肽具有抗菌、抗氧化等生物活性[2]。硒是生物體內(nèi)必不可缺的營養(yǎng)元素之一，具有抗氧化、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等顯著生理功能，因此維持機(jī)體中合適的硒水平能夠預(yù)防多種疾病，如癌癥、克山病、大骨節(jié)病等[3-4]。世界上約有40個國家或地區(qū)缺硒，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國約有2/3地區(qū)屬缺硒地區(qū)[5]。由此造成人體缺硒或低硒，對健康不利。

目前，人們可以通過藥物、硒營養(yǎng)強(qiáng)化劑、膳食等途徑補(bǔ)充硒，但是隨著分析化學(xué)、分子生物學(xué)、毒理學(xué)研究的不斷進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)硒的生理功能不僅與其含量有關(guān)，也與其形態(tài)相關(guān)[6]。與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒具有更高的吸收率、生物活性強(qiáng)、毒性低等特點(diǎn)[7-8]。已有研究通過螯合的方式，將多肽與硒結(jié)合，但由于原料限制，產(chǎn)品的腥味去除和螯合率仍有待提高[9]。本研究將食源性豌豆低聚肽與亞硒酸鈉螯合，以期為有機(jī)硒補(bǔ)充劑的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豌豆低聚肽，廣東中食營科生物科技有限公司；五水亞硒酸鈉(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；3′3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB 4HCl)。(試劑級)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)(生物技術(shù)級)，Biotopped Amresco；氫溴酸(分析純)，天津市福晨化學(xué)試劑廠；鹽酸羥胺、高氯酸、硝酸、鹽酸、氫氧化鈉、95%乙醇(分析純)，均購自北京化工廠；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

pH計(jì)(EL20)，Mettler Toledo；超聲波清洗器(KQ-250E)，昆山市超聲儀器有限公司；恒溫水浴鍋(1204007)，蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Phenom Prox臺式掃描電子顯微鏡、Dynex Spectra Mr酶標(biāo)儀、Frontier FT-IR型傅里葉變換紅外光譜儀，Perkin Elmer； DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京陸?？萍加邢薰?。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

硒標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取2.190 g Na2SeO3·5H2O，以少量超純水溶解后，加48%氫溴酸，然后以超純水定容至1 L，制備成657.474 6 mg/L的硒標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取1 mL硒標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，以超純水定容至100 mL，制備成6.57 μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

精確量取0、2、4、6、8、10 mL硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，根據(jù)陳甫等[9]提出的分光光度法，以酸消解后測量3， 3’ -二氨基聯(lián)苯胺與還原硒反應(yīng)后產(chǎn)生的黃色絡(luò)合物在420 nm處的吸光值。

按上述方法繪制，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.1 Selenium standard curve

1.2.2 螯合物硒含量的測定

準(zhǔn)確稱量一定量待測樣品，以10 mL超純水溶解后，采用上述方法處理樣品，測量處理后樣品的吸光值。對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定螯合物硒含量。

1.2.3 硒的螯合率的計(jì)算

(1)

式中：m1為螯合物中硒元素的質(zhì)量；m2為加入螯合體系硒元素的質(zhì)量。

1.2.4 螯合物得率的計(jì)算

(2)

式中：m3為螯合產(chǎn)物質(zhì)量；m4為加入螯合體系總物質(zhì)的質(zhì)量。

1.2.5 豌豆低聚肽硒螯合物制備工藝單因素試驗(yàn)

1.2.5.1 豌豆低聚肽硒螯合物制備方法

豌豆低聚肽硒螯合物的制備工藝流程為：豌豆低聚肽→超純水溶解→加入亞硒酸鈉→超聲波混勻→調(diào)節(jié)pH值→恒溫螯合→醇沉→干燥得成品。

1.2.5.2 豌豆低聚肽硒螯合物單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

肽質(zhì)量濃度設(shè)計(jì)為10 g/L，肽鹽質(zhì)量比為2∶1，螯合pH值為8.5，分別在60、70、80、85、90 ℃條件下反應(yīng)30 min?？疾旆磻?yīng)溫度對得率和螯合率的影響。

肽質(zhì)量濃度為10 g/L，螯合pH值為8.5，螯合溫度為85 ℃，分別在肽鹽質(zhì)量比為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1的條件下反應(yīng)30 min?？疾祀柠}質(zhì)量比對得率和螯合率的影響。

肽鹽質(zhì)量比為3∶1，螯合pH值為8.5，螯合溫度為85 ℃，分別在肽質(zhì)量濃度為20，30，40，50 g/L的條件下反應(yīng)30 min?？疾祀馁|(zhì)量濃度對得率和螯合率的影響。

肽質(zhì)量濃度為40 g/L，肽鹽質(zhì)量比為3∶1，螯合溫度為85 ℃，分別在螯合pH值為6.5、7、8、8.5、9的條件下反應(yīng)30 min?？疾旆磻?yīng)pH值對得率和螯合率的影響。

肽質(zhì)量濃度為40 g/L，肽鹽質(zhì)量比為3∶1，螯合溫度為85 ℃，螯合pH值設(shè)計(jì)為8.5，分別反應(yīng)20、30、40、50、60 min?？疾旆磻?yīng)時(shí)間對得率和螯合率的影響。

1.2.6 豌豆低聚肽硒螯合物制備工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇溫度、肽鹽質(zhì)量比、pH值和肽質(zhì)量濃度，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，篩選出豌豆低聚肽硒螯合物的最佳工藝制備條件。正交試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平表Table 1 Orthogonal experiment level

1.2.7 豌豆低聚肽硒螯合物的結(jié)構(gòu)特征

1.2.7.1 紫外全波長掃描

分別稱取豌豆低聚肽及豌豆低聚肽硒螯合物于超純水中，配制成0.05 g/mL溶液。對2組溶液進(jìn)行全波長紫外掃描，掃描波長200～600 nm。

1.2.7.2 掃描電鏡

分別將豌豆低聚肽及豌豆低聚肽硒螯合物干粉樣品涂抹在樣盤雙面膠上，然后進(jìn)行氮吹處理。處理好的樣品放入掃描電鏡抽真空，施加一定的電壓，調(diào)整束斑尺寸待聚焦清晰后分別在×1 000倍數(shù)下獲取圖像，觀察。

1.2.7.3 傅里葉紅外光譜掃描

稱取豌豆低聚肽10 mg和干燥的光譜純KBr 1 000 mg置于瑪瑙研缽中，研磨均勻后壓片得到透明的KBr樣品片，利用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行定性分析。同樣方法對豌豆低聚肽硒螯合物進(jìn)行紅外光譜測定。

儀器參數(shù)設(shè)置：光譜范圍為 4000～400 cm-1；分辨率 4 cm-1，掃描時(shí)扣除水和二氧化碳的干擾。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS v20處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 豌豆低聚肽的基礎(chǔ)理化成分

豌豆低聚肽中總蛋白含量為88.30%，酸溶蛋白含量為84.20%，水分含量為4.46%，灰分含量為5.04%，游離氨基酸含量(以干基計(jì))為2.93%，水解氨基酸含量為66.82%，肽含量(以干基計(jì))為81.27%。

2.2 豌豆低聚肽硒螯合物制備工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)溫度對螯合結(jié)果影響

在化學(xué)反應(yīng)中，溫度是影響反應(yīng)進(jìn)程的一個不可忽略的因素。從圖2可以看出，隨著溫度的升高，螯合率和得率都逐漸升高，說明溫度的升高有助于螯合過程的進(jìn)行。當(dāng)溫度超過85 ℃時(shí)，得率逐漸下降，而螯合率基本保持不變，說明過高的溫度會阻止反應(yīng)進(jìn)行。經(jīng)方差分析，85與80 ℃組的得率為差異顯著(P<0.05)，與組間(除80 ℃)為差異極其顯著(P<0.01)，85 ℃螯合率與80 ℃組和90 ℃組差異不顯著，與組間(除80、90 ℃)差異極顯著(P<0.01)。因此，綜合2項(xiàng)指標(biāo)，溫度選擇為85 ℃。

圖2 溫度對螯合反應(yīng)的影響
Fig.2 Effects of temperature on the chelating reaction

2.2.2 肽鹽質(zhì)量比對螯合結(jié)果影響的研究

在化學(xué)反應(yīng)過程中，反應(yīng)物的相對比例可能對一些空間鍵位的形成構(gòu)成影響。從圖3可以看出，隨著肽鹽質(zhì)量比(肽∶鹽)的逐漸增加，螯合率逐漸減少，而得率逐漸增加，兩項(xiàng)指標(biāo)的變化趨勢相反，隨著肽鹽比的增加，肽濃度保持不變，則鹽的質(zhì)量減少。

圖3 肽鹽質(zhì)量比(肽∶鹽)對鰲合反應(yīng)的影響
Fig.3 Effects of the mass ratio of oligopeptideto salt
on the chelating reaction

鹽質(zhì)量的減少，是導(dǎo)致螯合率下降的主要原因。但當(dāng)肽鹽質(zhì)量比超過3∶1時(shí)，產(chǎn)物得率也呈下降趨勢，而螯合率的下降趨勢逐漸平緩。肽鹽質(zhì)量比為3∶1時(shí)，螯合得率最高。經(jīng)方差分析，在3∶1時(shí)的得率和螯合率與組間相比，差異極顯著(P<0.01)。綜合2項(xiàng)指標(biāo)，肽鹽質(zhì)量比選擇為3∶1。

2.2.3 肽濃度對螯合結(jié)果影響的研究

在化學(xué)反應(yīng)過程中，除了反應(yīng)速率，反應(yīng)物的濃度也是影響反應(yīng)進(jìn)行程度的重要因素。從圖4可以看出，隨著肽濃度的增加，螯合率與得率都呈現(xiàn)了先增加再穩(wěn)定后減小的變化趨勢?；瘜W(xué)反應(yīng)是一個動態(tài)平衡的過程，若產(chǎn)物在反應(yīng)體系中濃度很高，則不利于反應(yīng)的正向進(jìn)行。平穩(wěn)的濃度即達(dá)到了化學(xué)平衡的最適濃度。經(jīng)方差分析，肽質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)的得率和螯合率與組間(除40 g/L外)2項(xiàng)指標(biāo)相比為差異極顯著(P<0.01)，與40 g/L的2項(xiàng)指標(biāo)為不顯著。綜合2項(xiàng)指標(biāo)，且從節(jié)約肽的經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，選擇肽質(zhì)量濃度為30 g/L。

圖4 肽濃度對鰲合反應(yīng)的影響
Fig.4 Effects of the concentration of oligopeptideon on
the chelating reaction

2.2.4 反應(yīng)pH值對螯合結(jié)果影響的研究

從圖5可以看出，隨著溶液pH值的增加，螯合率和得率整體上都呈增加趨勢，但是pH值超過8以后，2項(xiàng)指標(biāo)呈下降趨勢并逐漸趨于平緩。說明該鰲合反應(yīng)在弱堿性的環(huán)境下有更好的反應(yīng)結(jié)果。從表2經(jīng)方差分析，在pH=8時(shí)，得率和螯合率與組間相比均為極顯著差異(P<0.01)。

圖5 pH值對鰲合反應(yīng)的影響
Fig.5 Effects of the pH value on the chelating reaction

當(dāng)豌豆低聚肽與亞硒酸鈉完全溶解時(shí)，溶液的pH值即為8左右。因此，綜合2項(xiàng)指標(biāo)，選擇pH=8。

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間對螯合結(jié)果影響的研究

由圖6可以看出，隨著螯合時(shí)間的延長，螯合率和得率都逐漸增加。當(dāng)螯合時(shí)間超過30 min時(shí)，螯合率與得率都下降，并在一定值的范圍內(nèi)波動。經(jīng)方差分析，30 min的得率和螯合率與20 min組的2項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到了差異極顯著(P<0.01)，與組間(除20 min組外)為差異顯著(P<0.05)。40、50、60 min組間2項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著。綜合2項(xiàng)指標(biāo)，選擇螯合時(shí)間為30 min。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對螯合反應(yīng)的影響
Fig.6 Effects of reaction time on the chelating reaction

2.3 豌豆低聚肽硒螯合物制備正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜合以上單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以豌豆低聚肽硒的螯合率和得率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化豌豆低聚肽硒螯合物的制備工藝。結(jié)果如表2所示。

表2 豌豆低聚肽硒螯合物正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results of the peaoligopeptideselenium chelate

以得率為指標(biāo)，由表2可看出,各因素對豌豆低聚肽硒螯合物得率的影響大小依次為：肽鹽比>肽質(zhì)量濃度>pH值>溫度。最佳因素組合為A1B3C1D3，即螯合溫度80 ℃，豌豆低聚肽濃度為5%，肽鹽質(zhì)量比為2∶1，螯合pH值為8，反應(yīng)時(shí)間為30 min。

以螯合率為指標(biāo)，由表2可看出各因素對豌豆低聚肽硒螯合物螯合率的影響大小依次為肽鹽比>pH值>肽濃度>溫度。最佳因素組合為A1B3C3D3，即螯合溫度80 ℃，豌豆低聚肽濃度為5%，肽鹽質(zhì)量比為2∶1，螯合pH值為9，反應(yīng)時(shí)間為30 min。

綜合以上2項(xiàng)指標(biāo)，確定豌豆低聚肽硒螯合物最佳制備工藝為螯合溫度80 ℃，豌豆低聚肽質(zhì)量濃度為50 g/L，肽鹽質(zhì)量比為2∶1，螯合pH值為9，反應(yīng)時(shí)間為30 min。

2.4 豌豆低聚肽硒螯合物的結(jié)構(gòu)特征

2.4.1 紫外全波長掃描

分別將配制成0.05 g/mL溶液的豌豆低聚肽和豌豆低聚肽硒螯合物進(jìn)行全波長紫外掃描，掃描波長200～600 nm。結(jié)果如圖7所示。

圖7 豌豆低聚肽與豌豆低聚肽硒螯合物紫外
全波長掃描圖
Fig.7 UV scanning analysis of the pea oligopeptide
and pea oligopeptide selenium chelate

由圖7可以看出，豌豆低聚肽在309 nm處有最大吸收峰，當(dāng)豌豆低聚肽與亞硒酸鈉螯合形成豌豆低聚肽硒螯合物時(shí)，最大吸收峰紅移到322 nm處，并且最大吸收峰的OD值也變大，證明螯合使物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，硒元素與肽的配合形成對光吸收性能更強(qiáng)的結(jié)構(gòu)，這是豌豆低聚肽與硒螯合后，價(jià)電子躍遷程度變化的結(jié)果。

2.4.2 掃描電鏡

由圖8可以看出，在螯合前(圖8-a)，豌豆低聚肽具有明顯的球體顆粒狀，在1 000放大倍數(shù)下，可以看出豌豆低聚肽顆粒表面都存在褶皺，完整顆粒的粒徑均小于50 μm。由圖8-b可以看出，經(jīng)過螯合后，豌豆低聚肽硒螯合物粒型變化較大，失去球狀形態(tài)。最遠(yuǎn)粒徑大于300 μm。豌豆低聚肽硒螯合物的表面褶皺大部分伸展開，并且存在孔洞。推測是經(jīng)過螯合，豌豆低聚肽表面展開，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，以提供與硒的結(jié)合位點(diǎn)。顆粒前后變化明顯，證明是2種物質(zhì)。

圖8 豌豆低聚肽(a)和豌豆低聚肽硒螯合物(b)的
掃描電鏡圖
Fig.8 Scanning electron microscope of the pea oligopeptide
(a) and pea oligopeptide selenium chelate (b)

2.4.3 傅里葉紅外光譜結(jié)果分析

豌豆低聚肽與螯合物的吸收峰相比，峰的形狀出現(xiàn)了變化，如圖9所示。豌豆低聚肽在3 040、954附近有吸收峰，說明存在—COOH，而螯合物在3 040附近的吸收峰變窄，954附近吸收峰變得很弱，說明游離羧基不存在，可能是羧基以共價(jià)鍵形式與硒配合。螯合物在3 158和3 436附近有雙峰，在1 216附近有峰，說明存在—NH2，且—NH2為自由的。從理論上分析，肽硒螯合物的螯合機(jī)制為Se4+與—NH2配合，羧基以共價(jià)鍵方式也與Se形成配合。推測豌豆低聚肽硒螯合物中，由Se4+提供4 d空軌道，N、O能夠提供孤對電子，可分別占據(jù)空軌道形成配位鍵。這一推測也與其他相關(guān)研究相符[11-12]。

圖9 豌豆低聚肽和豌豆低聚肽硒螯合物紅外
光譜對比
Fig.9 Infrared radiation spectrum of the pea oligo-
peptide and pea oligopeptide selenium chelate

3 結(jié)論

豌豆低聚肽與亞硒酸鈉螯合制備豌豆低聚肽硒螯合物的最佳工藝制備條件為：螯合溫度80 ℃，豌豆低聚肽質(zhì)量濃度50 g/L，肽鹽質(zhì)量比為2∶1(肽∶鹽)，pH=9，時(shí)間30 min。在此條件下的產(chǎn)物得率為27.87%，螯合率為57.23%。

通過紫外全波長掃描的結(jié)果可以看出，由于豌豆低聚肽與硒元素螯合后，相應(yīng)的原子價(jià)電子躍遷發(fā)生變化，因此豌豆低聚肽硒螯合物的最高吸收峰發(fā)生紅移，且吸收峰更強(qiáng)；掃描電鏡結(jié)果顯示豌豆低聚肽經(jīng)過螯合，其微觀形態(tài)發(fā)生變化，表面褶皺舒展，以提供與硒配合的位點(diǎn)，最終配體顆粒體積變大；傅里葉紅外光譜結(jié)果顯示，螯合反應(yīng)使豌豆低聚肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，推斷是硒離子可與多肽中NH2+以及—COO—形成配位鍵，豌豆低聚肽硒螯合物是一種新型含硒的螯合物。本實(shí)驗(yàn)開辟了補(bǔ)硒產(chǎn)品的新思想，為進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化奠定了理論基礎(chǔ)。