王婷，韓超，毛倩，張德志，蔡檸勻，劉宏亮，李燕軍,2,3，陳寧,2,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室(天津科技大學(xué))，天津，300457)3(教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點實驗室(天津科技大學(xué))，天津，300457)

L-2-氨基丁酸是一種非天然的手性α-氨基酸，并不參與蛋白質(zhì)的合成。L-2-氨基丁酸具有增強6-磷酸葡萄糖酯酶活性、抑制人體神經(jīng)信息傳遞和提高神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞新陳代謝速度的功能。它常被用作化工材料和手性化合物，同時也是多種藥物合成的中間體。利用L-2-氨基丁酸合成的新型藥物有抑制結(jié)核桿菌、治療疥病的鹽酸乙胺丁醇、治療癲癇的利維西坦、內(nèi)皮素及其受體拮抗劑，以及連氮絲菌素(Azinothricin)類抗菌藥物等[1-3]。

L-2-氨基丁酸的合成方法有化學(xué)合成法[4]、酶催化法、細(xì)胞轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法。利用微生物進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化或直接發(fā)酵生產(chǎn)L-2-氨基丁酸是特異性強、條件溫和、綠色無污染的方式。李國龍[5]在大腸桿菌中過表達(dá)蘇氨酸脫氨酶與ω-轉(zhuǎn)氨酶，用來轉(zhuǎn)化底物L(fēng)-蘇氨酸和異丙胺合成L-2-氨基丁酸。目前通過微生物發(fā)酵法合成L-2-氨基丁酸鮮有報道，構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的L-2-氨基丁酸高產(chǎn)菌株具有重要的現(xiàn)實意義。

通過基因工程手段延伸已有產(chǎn)品的代謝途徑，來生產(chǎn)人們所需的產(chǎn)品已經(jīng)有許多成功的報道。CHOI等[6]在大腸桿菌中引入歐文氏菌crtEXYIB操縱子，延伸1-脫氧-5-磷酸代謝途徑來生產(chǎn)番茄紅素。SHEN等[7]引入乳酸菌2-酮酸脫羧酶(Kivd)和酵母菌乙醇脫氫酶(ADH2)，延伸L-蘇氨酸途徑將L-2-酮基丁酸生成1-丙醇和1-丁醇等。另外，引入L-2-羥基丁酸脫氫酶還可以還原L-2-酮基丁酸為L-2-羥基丁酸，進(jìn)而聚合成生物材料聚羥基丁酸(polyhydroxyalkanoates, PHA)等。

從生物合成途徑來看，L-2-氨基丁酸是L-蘇氨酸的下游產(chǎn)物，L-蘇氨酸在蘇氨酸脫水酶的作用下生成L-2-酮丁酸，L-2-酮丁酸在不同氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、氨基酸脫氫酶作用下生成L-2-氨基酸丁酸(圖1)。

圖1 大腸桿菌L-2-氨基丁酸合成途徑
Fig.1 The biosynthesis pathway ofL-2-aminobutyrate inE.coli
注：黑色線條表示內(nèi)源途徑，雙線條表示重構(gòu)途徑。
叉號表示基因敲除，陰影方框表示延伸途徑中關(guān)鍵基因。
BS代表基因來源枯草芽孢桿菌

因此，通過延伸L-蘇氨酸的代謝途徑合成L-2-氨基酸丁酸是比較理想的選擇。本研究以L-蘇氨酸生產(chǎn)菌E.coliTHRD出發(fā)，通過不同酶的選擇延伸代謝途徑合成L-2-氨基酸丁酸，同時考察了阻斷L-蘇氨酸輸出途徑對L-2-氨基丁酸合成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

L-蘇氨酸生產(chǎn)菌E.coliTHRD保藏于天津科技大學(xué)菌種保藏中心，編號為TCCC11825。菌株E.coliW3110、E.colidh5α、Bacillussubtilis168和Methanococcusjannaschii為本研究室保藏，THRDΔrhtA、THRLΔrhtC和THRLΔrhtAΔrhtC為本實驗構(gòu)建。質(zhì)粒pTrc99a、pKD3、pKD46、pCP20為本研究室保藏，其他質(zhì)粒為本實驗構(gòu)建。

1.1.2 酶與試劑盒

HS DNA聚合酶、QuickCut限制性內(nèi)切酶和Solution I連接酶購自寶生物工程(Takara)有限公司(大連)，Taq PCR MasterMix購自諾維贊(Vazyme)生物工程有限公司(南京)，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-tek公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Universal 320冷凍離心機(jī)，德國Hettich公司；MiniSpin臺式高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；LRH-250A培養(yǎng)箱，廣東醫(yī)療器械廠；ZWYR-P2403疊式搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；Mastercycler nexus PCR儀，德國Eppendorf公司；電擊轉(zhuǎn)化儀，德國Eppendorf公司；移液器，德國Eppendorf公司；德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠；WD-9403C紫外分析儀，北京六一儀器廠；752紫外分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Thermo U3000高效液相色譜儀，美國Thermo公司；5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1.0，蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，酵母粉5.0，NaCl 2.5，瓊脂20.0，pH調(diào)至7.0～7.2，0.1 MPa、121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，蛋白胨6.0 g/L，(NH4)2SO42.0 g/L，KH2PO41.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10.0 mg/L，MnSO4·H2O 10.0 mg/L，維生素(VB1、VB3、VB5、VB7、VB12)1.0 mg/L，VH0.3 mg/L，pH調(diào)至7.0～7.2，0.1 MPa、115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40.0 g/L，酵母粉2.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，檸檬酸鈉1.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 50.0 mg/L，MnSO4·H2O 50.0 mg/L，維生素VB1、VB3、VB5、VB7、VB12濃度均為0.8 mg/L，VH0.2 mg/L，pH調(diào)至7.0～7.2，0.1 MPa、115℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒、菌株構(gòu)建

1.2.1.1 引物設(shè)計

本研究所用引物采用Primer Premier 5軟件進(jìn)行設(shè)計，所有引物見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the study

續(xù)表1

引物序列(5′-3′)rhtC-3GGTGGGCGGTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCrhtC-4CTGAAGACGCGCCATGGTCCATATGAATATCCTCCTrhtC-5GACCATGGCGCGTCTTCAGAGTAAGTCGGATAAGrhtC-6CAATCGCGTCGACATTTGTTC

注：下劃線代表酶切位點，斜體代表引物間重疊區(qū)域。

1.2.1.2 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

以實驗室已有的抗L-異亮氨酸反饋抑制的突變基因ilvA2[8]和ilvA4[9]為模板，分別以引物對ilvA2-S、ilvA2-A，和ilvA4-S、ilvA4-A擴(kuò)增這2個突變基因。以限制性內(nèi)切酶PstI、Hind III切割ilvA2、ilvA4和質(zhì)粒pTrc99a。用Solution I連接酶分別連接pTrc99a和ilvA2，pTrc99a和ilvA4，獲得質(zhì)粒pTrc99a-ilvA2和pTrc99a-ilvA4。

以引物tyrB-S、tyrB-A擴(kuò)增大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因tyrB。以KpnI和XbaI雙酶切質(zhì)粒pTrc99a-ilvA2和片段tyrB。用Solution I將二者連接起來，獲得質(zhì)粒pTrc99a-tyrB-ilvA2。采用類似的方法構(gòu)建來源于枯草芽孢桿菌亮氨酸脫氫酶基因bcdBS、大腸桿菌谷氨酸脫氫酶基因gdh，和ilvA2串聯(lián)表達(dá)的質(zhì)粒pTrc99a-bcdBS-ilvA2和pTrc99a-gdh-ilvA2。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化采用CaCl2介導(dǎo)的方法，具體為將質(zhì)粒加入冰浴20 min的E.coliTHRD感受態(tài)細(xì)胞，42 ℃熱激1 min、冰浴2 min，復(fù)蘇1 h后涂布添加相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，37 ℃過夜培養(yǎng)，采用菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.1.3 基因敲除菌株構(gòu)建

基因敲除采用Red同源重組方法進(jìn)行。

分別以引物對rhtA-1/rhtA-2和rhtA-5/rhtA-6擴(kuò)增待敲除基因rhtA的上、下游同源臂序列，以引物rhtA-3、rhtA-4擴(kuò)增氯霉素抗性基因cat。以rhtA-1、rhtA-6引物進(jìn)行重疊PCR反應(yīng)獲得敲除rhtA的DNA片段(兩端為rhtA基因同源臂、中間為抗性基因序列)。采用同樣方法獲得敲除rhtC的DNA片段。

將純化的DNA片段采用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入攜帶pKD46的E.coli感受態(tài)細(xì)胞。涂布含有氯霉素的固體培養(yǎng)基，菌落PCR鑒定獲得正確的轉(zhuǎn)化子，即為片段重組到基因組的菌株。丟失溫敏質(zhì)粒pKD46后，制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化pCP20質(zhì)粒，涂布含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基，鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化子。通過對點含有抗性的固體培養(yǎng)基，獲得在氯霉素不生長、在氨芐青霉素生長的菌落，即為基因組上氯霉素抗性消除的菌株。最后，在42 ℃下培養(yǎng)丟失pCP20質(zhì)粒。

利用上述方法敲除L-高絲氨酸和L-蘇氨酸輸出蛋白編碼基因rhtA和rhtC，獲得E.coliTHRDΔrhtA、THRDΔrhtC和THRDΔrhtAΔrhtC菌株。

1.2.2 發(fā)酵方法

搖瓶發(fā)酵：從新鮮活化斜面上挑取2環(huán)菌體接種于種子培養(yǎng)基中(500 mL三角瓶裝液量30 mL，添加相應(yīng)抗生素)。置于搖床中200 r/min、36 ℃培養(yǎng)至OD600值約為12時，按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加相應(yīng)抗生素和IPTG(終濃度0.1 mmol/L)，當(dāng)葡萄糖耗盡時發(fā)酵結(jié)束。

5 L發(fā)酵罐發(fā)酵：吸取適量無菌水于3支新鮮的活化斜面，將菌懸液接入5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基裝液量為1.5 L。通過自動流加氨水控制pH在7.0左右，培養(yǎng)溫度36 ℃。培養(yǎng)至OD600值為12～14時，按13%接種量棄掉多余的種子培養(yǎng)基，接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵過程通過自動流加氨水控制pH在7.0左右，培養(yǎng)溫度36 ℃。菌體OD600=20時，添加終濃度為0.04 mmol/L的IPTG。以一定脈沖速度流加80%葡萄糖溶液，維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在菌體所需范圍。

1.2.3 檢測方法

菌體生物量測定：菌體生物量以菌體干重表示。取10 mL發(fā)酵液，13 000 r/min離心20 min，棄上清，菌體用去離子水洗滌2次，置于55 ℃恒溫干燥箱中至恒重，用分析天平稱重。發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，測定600 nm波長下的OD值。繪制OD600值與干重對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

葡萄糖濃度測定：采用SBA-40C生物傳感儀測定。取發(fā)酵液1 mL離心2 min，取上清液10 μL，稀釋100倍后，取25 μL稀釋液直接進(jìn)樣讀數(shù)。

L-蘇氨酸濃度測定：采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中蘇氨酸的含量。取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心2 min，上清液過φ0.22 μm膜。用2,4-二硝基氟苯(DNFB)進(jìn)行柱前衍生。色譜分離條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6 mm × 150 mm，5 μm)，流動相A為乙酸鈉緩沖液，流動相B為乙腈，采用二元梯度混合，流速1.0 mL/min，柱溫33 ℃，檢測波長360 nm。

有機(jī)酸濃度測定：采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中L-2-氨基丁酸和L-2-酮基丁酸的含量。取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心2 min，上清液過0.22 μm膜。色譜分離條件：色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H，300 mm×7.8 mm)，流動相為5 mmol/L H2SO4，柱溫30 ℃，流速0.5 mL/min，檢測波長215 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達(dá)蘇氨酸脫水酶將L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化為L-2-酮基丁酸

2.1.1 過表達(dá)ilvA基因菌株的搖瓶發(fā)酵

L-蘇氨酸首先在蘇氨酸脫水酶催化下生成L-2-酮基丁酸，然后L-2-酮基丁酸再通過轉(zhuǎn)氨基作用生成L-2-氨基丁酸。我們采取逐步延伸L-蘇氨酸代謝途徑的策略，首先過表達(dá)蘇氨酸脫水酶(由ilvA基因編碼)，該酶受到L-異亮氨酸的反饋抑制。前期工作中，我們實驗室保存了2個ilvA突變體ilvA2[8]和ilvA4[9]，本研究將這2個突變體在pTrc99a中過表達(dá)，導(dǎo)入E.coliTHRD中。對菌株THRD/pTrc99a、THRD/pTrc99a-ilvA2和THRD/pTrc99a-ilvA4進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定菌體生物量、L-蘇氨酸和L-2-酮基丁酸積累量，結(jié)果如表2。

表2 過表達(dá)ilvA菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)果Table 2 The fermentation profiles of ilvA overexpressionstrains

注：a-菌生物量以菌體干重表示。

由表2可知，與對照THRD/pTrc99a相比，THRD/pTrc99a-ilvA2和THRD/pTrc99a-ilvA4的細(xì)胞干重大幅減少，但二者之間無明顯差別。對照菌株產(chǎn)生23.4 g/LL-蘇氨酸，并不積累L-2-酮基丁酸。攜帶重組質(zhì)粒菌株在蘇氨酸脫氨酶的作用下，L-蘇氨酸積累量下降90%左右，生成較高濃度的L-2-酮基丁酸。THRD/pTrc99a-ilvA2和THRD/pTrc99a-ilvA4的L-2-酮基丁酸積累量分別為9.2 g/L和8.3 g/L，葡萄糖到L-2-酮基丁酸的轉(zhuǎn)換率分別為15.4%和13.8%。由此可知，ilvA2比ilvA4具有更強的L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化能力。

2.1.2 菌株THRD/pTrc99a-ilvA2的5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵

以THRD/pTrc99a為對照，對菌株THRD/pTrc99a-ilvA2進(jìn)行了5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵，菌體生物量、L-蘇氨酸和L-2-酮基丁酸積累量結(jié)果如圖2。

由圖2可見，在發(fā)酵前期，菌株THRD/pTrc99a-ilvA2與對照THRD/pTrc99a的生長速率無顯著差異，但是在穩(wěn)定期，THRD/pTrc99a-ilvA2的生物量僅為對照的一半左右。發(fā)酵4～16 h是THRD/pTrc99a的快速產(chǎn)酸期，L-蘇氨酸的最終積累量為118 g/L。同樣，菌株THRD/pTrc99a-ilvA2在4～16 h時快速合成L-2-酮基丁酸，最終可積累18 g/L；而發(fā)酵過程中并沒有出現(xiàn)L-蘇氨酸的過量積累，發(fā)酵液中始終維持約2 g/LL-蘇氨酸，說明蘇氨酸脫水酶的表達(dá)有效的將細(xì)胞合成的L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化為L-2-酮基丁酸。然而，L-2-酮基丁酸的最高產(chǎn)量只有18 g/L，原因可能是當(dāng)其積累到一定濃度時對細(xì)胞具有較強的抑制作用[10]，導(dǎo)致菌體生長變慢和蘇氨酸合成受阻。

a-生物量；b-L-蘇氨酸；c-L-2-酮基丁酸圖2 E. coli THRD/pTrc99a和THRD/pTrc99a-ilvA25 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程曲線Fig.2 The fed-batch fermentation process of E. coliTHRD/pTrc99a and THRD/pTrc99a-ilvA2 in a 5 L fermenter

2.2 延伸代謝途徑將L-2-酮基丁酸轉(zhuǎn)化為L-2-氨基丁酸

2.2.1 串聯(lián)表達(dá)tyrB、gdh和bcdBS菌株搖瓶發(fā)酵

酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫氫酶和亮氨酸脫氫酶均可以催化L-2-酮基丁酸合成L-2-氨基丁酸。本研究在pTrc99a-ilvA2質(zhì)粒中串聯(lián)表達(dá)來源于大腸桿菌的酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因tyrB、谷氨酸脫氫酶基因gdh和來源于枯草芽孢桿菌的亮氨酸脫氫酶基因bcdBS，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliTHRD。對3株菌進(jìn)行了搖瓶培養(yǎng)，定時取樣測定了菌體生物量、L-蘇氨酸、L-2-酮基丁酸和L-2-氨基丁酸積累量(圖3)。

圖3E.coliTHRD/pTrc99a-tyrB-ilvA2、THRD/pTrc99a-
gdh-ilvA2和THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2搖瓶發(fā)酵結(jié)果
Fig.3 Shake flask fermentation of strainsE.coliTHRD/
pTrc99a-tyrB-ilvA2, THRD/pTrc99a-gdh-ilvA2 and
THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2

由圖3可知，發(fā)酵結(jié)束時菌株THRD/pTrc99a-tyrB-ilvA2、THRD/pTrc99a-gdh-ilvA2和THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2的生物量比THRD/pTrc99a要顯著降低，但是比THRD/pTrc99a-ilvA2(2.6 g DCW/L，

表1)略高一些。串聯(lián)表達(dá)tyrB基因之后，L-2-酮基丁酸仍有9.3 g/L的積累，但是同時也產(chǎn)出4.1 g/LL-2-氨基丁酸。串聯(lián)表達(dá)gdh和枯草芽胞桿菌的bcd基因之后，菌株的L-2-酮基丁酸積累量顯著降低至僅約1.0 g/L，同時二者均產(chǎn)生較高質(zhì)量濃度的L-2-氨基丁酸，分別為9.0 g/L和7.9 g/L。由此可見，在過表達(dá)ilvA2的基礎(chǔ)上，再串聯(lián)表達(dá)谷氨酸脫氫酶和亮氨酸脫氫酶基因，均能高效地將細(xì)胞內(nèi)積累的L-2-酮基丁酸轉(zhuǎn)化為L-2-氨基丁酸。因此，我們對菌株THRD/pTrc99a-gdh-ilvA2和THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2進(jìn)行了5 L發(fā)酵罐發(fā)酵測試。

2.2.2E.coliTHRD/pTrc99a-gdh-ilvA2和THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2的5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵

在5 L罐發(fā)酵過程中對兩株菌進(jìn)行定時取樣，測定了生物量L-蘇氨酸、L-2-酮基丁酸和L-2-氨基丁酸積累量，發(fā)酵過程曲線如圖4所示。菌株THRD/pTrc99a-gdh-ilvA2和THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2發(fā)酵前期生物量迅速積累，在8 h左右時達(dá)到最高值。之后THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2的生物量保持緩慢下降的狀態(tài)，而THRD/pTrc99a-gdh-ilvA2的生物量則快速下降。分析原因可能是從發(fā)酵8 h開始，菌株THRD/pTrc99a-gdh-ilvA2開始快速合成L-2-酮基丁酸(終積累量達(dá)到17.8 g/L)，造成了菌體的衰亡；與此同時，也有部分L-2-酮基丁酸轉(zhuǎn)化為L-2-氨基丁酸(終積累量為8.3 g/L)。而菌株THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2

a-生物量；b-L-蘇氨酸；c-L-2-酮基丁酸；d-L-2-氨基丁酸圖4 E. coli THRD/pTrc99a-gdh-ilvA2和THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2分批補料發(fā)酵過程曲線Fig.4 The fed-batch fermentation processes of E. coli THRD/pTrc99a-gdh-ilvA2和THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2

在發(fā)酵過程中L-2-酮基丁酸和L-2-氨基丁酸均緩慢積累，終質(zhì)量濃度分別達(dá)到8.3 g/L和19.1 g/L。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)L-2-酮基丁酸對大腸桿菌細(xì)胞的生長具有抑制作用。DANCHIN等[11]研究發(fā)現(xiàn)，L-2-酮基丁酸的添加會造成糖酵解反應(yīng)中6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、1,6-二磷酸果糖，以及乙酰輔酶A的濃度下降。此外，L-2-酮基丁酸還會影響AMP的循環(huán)以及mRNA的翻譯，從而造成細(xì)胞生物量的下降。

5 L發(fā)酵罐發(fā)酵實驗結(jié)果與搖瓶發(fā)酵結(jié)果相差較大，也說明了在構(gòu)建大腸桿菌工程菌株的過程中，在搖瓶發(fā)酵初步優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，有必要及時進(jìn)行發(fā)酵罐的測試。在搖瓶發(fā)酵中，菌株THRD/pTrc99a-gdh-ilvA2和THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2發(fā)酵過程參數(shù)相當(dāng)，二者均積累少量的L-2-酮基丁酸，THRD/pTrc99a-gdh-ilvA2的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量甚至超過THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2(圖3)。在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中，2株菌L-2-酮基丁酸和L-2-氨基丁酸的總濃度相當(dāng)，然而THRD/pTrc99a-gdh-ilvA2的L-2-酮基丁酸積累量顯著高于L-2-氨基丁酸，而THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2則恰好相反(圖4)。因此，我們選擇THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2進(jìn)行后續(xù)研究。

在5 L罐發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基L-蘇氨酸呈現(xiàn)先積累(超過20 g/L)后消耗的趨勢(圖4)，說明在發(fā)酵前期，L-蘇氨酸不能完全被轉(zhuǎn)化而排出細(xì)胞，在發(fā)酵后期隨著胞內(nèi)L-蘇氨酸的消耗，胞外的L-蘇氨酸逐漸進(jìn)入細(xì)胞。由于L-蘇氨酸的跨膜運輸需要消耗能量，因此我們探索了阻斷L-蘇氨酸的運輸途徑對L-2-氨基丁酸發(fā)酵的影響。

2.3 阻斷L-蘇氨酸輸出途徑對L-2-氨基丁酸發(fā)酵的影響

2.3.1 敲除L-蘇氨酸分泌蛋白基因各菌株搖瓶發(fā)酵

大腸桿菌L-蘇氨酸分泌蛋白有RhtA、RhtB和RhtC，其中RhtA同時可以輸出L-高絲氨酸[12-13]。為了研究阻斷L-蘇氨酸輸出途徑對發(fā)酵的影響，本研究借助RED重組基因編輯方法[14]，單獨和組合敲除了E.coliTHRD中rhtA和rhtC基因，獲得菌株THRDΔrhtA、THRDΔrhtC和THRDΔrhtAΔrhtC。將質(zhì)粒pTrc99a-bcdBS-ilvA2轉(zhuǎn)化入這3株菌中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗，結(jié)果如圖5所示。

圖5E.coliTHRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2、THRDΔrhtC/
pTrc99a-bcdBS-ilvA2、THRDΔrhtA/pTrc99a-bcdBS-ilvA2和
THRDΔrhtAΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2搖瓶發(fā)酵結(jié)果
Fig.5 Shake flask fermentation of strainsE.coliTHRD/
pTrc99a-bcdBS-ilvA2, THRDΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2,
THRDΔrhtA/pTrc99a-bcdBS-ilvA2 and THRDΔrhtAΔrhtC/
pTrc99a-bcdBS-ilvA2

由圖5可見，與對照菌株THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2相比，菌株THRDΔrhtA/pTrc99a-bcdBS-ilvA2、THRDΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2和THRDΔrhtAΔrhtC/ pTrc99a-bcdBS-ilvA2的生物量無明顯差異，說明敲除rhtA和rhtC基因?qū)w生長影響不大。對照菌株L-蘇氨酸積累量為9.25 g/L，而3株敲除菌株的L-蘇氨酸積累量分別為4.9、5.1和1.1 g/L，降幅明顯，說明rhtA和rhtC基因的敲除對副產(chǎn)物L(fēng)-蘇氨酸的減少具有顯著作用。4菌株的L-2-酮基丁酸積累量沒有太大差異，分別為1.0、2.5、1.4和1.1 g/L。而L-2-氨基丁酸的產(chǎn)量具有較大差異，對照菌株為7.9 g/L，其他3株菌分別達(dá)到13.5、11.2和4.5 g/L。分析以上結(jié)果可知，單敲除菌株THRDΔrhtA/pTrc99a-bcdBS-ilvA2和THRDΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2的L-蘇氨酸積累量下降，使得L-2-氨基丁酸的產(chǎn)量提高；雙敲除菌株THRDΔrhtAΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2的L-蘇氨酸積累量最低，然而并沒有轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物L(fēng)-2-氨基丁酸，其產(chǎn)量卻下降了42.4%。雙基因敲除菌株雖然L-蘇氨酸積累量大幅降低，但仍有1.1 g/L的質(zhì)量濃度，說明大腸桿菌還存在其他特異或非特異的L-蘇氨酸輸出途徑。另外，雙敲除菌株由于胞內(nèi)L-蘇氨酸的快速積累，可能強化了其他代謝途徑，導(dǎo)致碳源流向其他副產(chǎn)物。

2.3.2 四菌株5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵

從搖瓶發(fā)酵結(jié)果可見，單獨敲除rhtA和rhtC后，較為顯著地提高了L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)能力。為了進(jìn)一步表征L-蘇氨酸/L-高絲氨酸輸出途徑缺失對L-2-氨基丁酸發(fā)酵的影響，以THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2相比為對照，對菌株THRDΔrhtA/pTrc99a-bcdBS-ilvA2、THRDΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2和THRDΔrhtAΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2進(jìn)行了5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，對照菌株THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2在發(fā)酵過程中先積累L-蘇氨酸，在12 h后L-蘇氨酸逐漸轉(zhuǎn)化為L-2-酮基丁酸和L-2-氨基丁酸，二者質(zhì)量濃度分別達(dá)到9.9 g/L和19.1 g/L。菌株THRDΔrhtA/pTrc99a-bcdBS-ilvA2在發(fā)酵2 h后，開始快速積累L-2-酮基丁酸，導(dǎo)致菌體生長受阻，在發(fā)酵過程中L-蘇氨酸沒有明顯積累；然而，在12 h后，L-2-酮基丁酸逐步轉(zhuǎn)化為L-2-氨基丁酸，最終產(chǎn)量達(dá)到13.7 g/L。菌株THRDΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2發(fā)酵過程曲線與對照菌株類似，不同的是生成更多L-蘇氨酸，且后期L-蘇氨酸更多的轉(zhuǎn)化為L-2-氨基丁酸，生成L-2-酮基丁酸的量相對較少。比較奇怪的是，雙敲除菌株THRDΔrhtAΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2菌體生長最好，而生成L-蘇氨酸、L-2-酮基丁酸和L-2-氨基丁酸的量都很低，可能是阻斷L-蘇氨酸/L-高絲氨酸的分泌對產(chǎn)物合成途徑產(chǎn)生了調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致碳源流向菌體生長和其他副產(chǎn)物的合成。由此可見，改造L-蘇氨酸/L-高絲氨酸的輸出途徑對L-2-氨基丁酸的發(fā)酵產(chǎn)生了多樣化影響，與對照相比，敲除rhtC基因的菌株效果較好，但是仍積累了較高濃度的L-2-酮基丁酸。此外，可能由于L-蘇氨酸/L-高絲氨酸輸出途徑的阻斷對菌體特性影響較大，導(dǎo)致5 L發(fā)酵罐的發(fā)酵結(jié)果與搖瓶發(fā)酵相差較大，提示我們在今后研究中有必要對代謝工程改造的過程菌株也進(jìn)行發(fā)酵罐測試。

a-生物量；b-L-蘇氨酸；c-L-2-酮基丁酸；d-L-2-氨基丁酸圖6 E. coli THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2、THRDΔrhtA/pTrc99a-bcdBS-ilvA2、THRDΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2和THRDΔrhtAΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2分批補料發(fā)酵過程曲線Fig.6 The fed-batch fermentation processes of E. coli THRD/pTrc99a-bcdBS-ilvA2, THRDΔrhtA/pTrc99a-bcdBS-ilvA2,THRDΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2 and THRDΔrhtAΔrhtC/pTrc99a-bcdBS-ilvA2

3 結(jié)論

L-2-氨基丁酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在化工和制藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。目前還沒有直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的報道。本研究以1株L-蘇氨酸大腸桿菌生產(chǎn)菌株出發(fā)，通過延伸代謝途徑構(gòu)建了L-2-氨基丁酸高產(chǎn)菌株。L-2-氨基丁酸最高產(chǎn)量達(dá)到22 g/L，但培養(yǎng)基中仍然存在一定濃度的L-蘇氨酸和L-2-酮基丁酸。本研究結(jié)果表明延伸代謝途徑合成下游產(chǎn)品的策略具有可行性，然而，如何將中間代謝物最大程度上轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物具有一定的挑戰(zhàn)。本研究同時表明，對某些產(chǎn)品的合成而言，搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐水平的發(fā)酵結(jié)果可能相差很大，在今后研究中應(yīng)該重視這一現(xiàn)象。