阿伐他汀對ApoE基因敲除小鼠海馬和大腦皮質(zhì)HDAC4和pCREB表達(dá)的影響

李報(bào)黃大可桂麗汪淵蘆寶靜賈雪梅

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽合肥230032)

摘要〔〕目的探討阿伐他汀對高脂血癥模型小鼠腦組織組蛋白去乙酰酶(HDAC4)和pCREB表達(dá)的影響。方法將16只雄性ApoE基因敲除小鼠隨機(jī)分成兩組，一組正常飲食，一組在正常飲食同時(shí)給予阿伐他汀灌胃。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱重測血脂，取腦組織固定，石蠟切片后進(jìn)行HE和免疫組化染色。結(jié)果阿伐他汀治療組小鼠海馬和大腦皮質(zhì)HDAC4表達(dá)水平顯著下降(P< 0.05)，而pCREB表達(dá)水平顯著增加(P< 0.05)。結(jié)論提示HDAC4和轉(zhuǎn)錄因子pCREB在阿伐他汀改善高脂血癥引起的腦神經(jīng)退行性疾病可能具有重要作用。

關(guān)鍵詞〔〕阿伐他?。籄poE基因敲除；組蛋白去乙?；?；環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白

中圖分類號〔〕R322.81〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(30570750)；安徽省教育廳自然科學(xué)基金(KJ2012A164)

通訊作者：賈雪梅(1959-)，女，教授，碩士，主要從事神經(jīng)退行性疾病研究。

第一作者：李報(bào)(1979-)，男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事神經(jīng)退行性疾病研究。

高脂血癥是阿爾茨海默病(AD)發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。阿伐他汀作為膽固醇合成途徑關(guān)鍵限速酶HMGCoA還原酶的抑制劑，可以降低血清中膽固醇的含量。研究表明，阿伐他汀對AD模型小鼠的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元丟失有保護(hù)作用〔1〕，但是作用機(jī)制還不清楚。組蛋白去乙?；?HDAC)對神經(jīng)發(fā)育和學(xué)習(xí)認(rèn)知行為具有重要的調(diào)控作用，通過修飾組蛋白調(diào)控基因表達(dá)。本課題組也發(fā)現(xiàn)載脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠海馬區(qū)HDAC4的表達(dá)顯著升高〔2〕。ApoE基因是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中運(yùn)輸膽固醇的重要載體，也是后發(fā)性AD的重要關(guān)聯(lián)基因。ApoE基因敲除小鼠的血脂水平明顯升高，腦部出現(xiàn)神經(jīng)退行性病變，成為高脂血癥和AD研究的動(dòng)物模型之一〔3〕。本研究以ApoE基因敲除小鼠作為模型動(dòng)物，觀察阿伐他汀治療后HDAC4和pCREB在腦部的表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究阿伐他汀治療神經(jīng)退行性疾病作用機(jī)制提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料和分組實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均為C57BL/6遺傳背景的雄性ApoE 基因敲除小鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院動(dòng)物中心。4周齡ApoE 基因敲除小鼠隨機(jī)分成模型組和治療組，每組8只。模型組給予正常飲食，治療組在正常飲食的同時(shí)給予阿伐他汀(5 mg·kg-1·d-1)灌胃，12 w后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，眼球取血測血脂。

1.2主要試劑和儀器阿伐他汀和血脂檢測試劑盒購自上海榮盛公司；HDAC4和pCREB抗體分別為美國Santa cruz公司和北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供；免疫組化檢測試劑盒為美國GBI公司生產(chǎn)的通用型PV-9000；DAB顯色試劑盒購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。顯微鏡為Nikon80i，日立全自動(dòng)生化分析儀。

1.3實(shí)驗(yàn)材料的采集摘取眼球取血后按照血脂檢測試劑盒進(jìn)行操作，最后用生化分析儀進(jìn)行檢測。血樣采集后斷頸處死小鼠，取腦組織用甲醛溶液固定，后脫水、石蠟包埋和切片。

1.4H-E染色和免疫組化切片脫蠟至水：二甲苯2次各20 min，100%乙醇2次各10 min， 95%乙醇、85%和70%乙醇各5 min最后放入ddH2O中。H-E染色：蘇木精染色20 min后藍(lán)化，伊紅染色1 min。免疫組化步驟按照檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒說明進(jìn)行操作，一抗4℃孵育過夜，抗體HDAC4和pCREB稀釋度分別為1∶100和1∶300。陰性對照用PBS代替一抗。使用Nikon顯微鏡10×40倍鏡頭，保持光學(xué)參數(shù)和曝光參數(shù)均一致，采集組織相同部位的免疫組化顯色圖片。采集的圖片用Nikon80i顯微拍攝系統(tǒng)中的形態(tài)分析軟件進(jìn)行平均光密度值(MOD)統(tǒng)計(jì)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1血脂水平檢測治療組小鼠中總膽固醇(CHO)〔(12.43±2.30)mmol/L〕和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)〔(2.58±0.74)mmol/L〕含量均低于模型組〔(19.69±3.94)、(3.65±0.43)mmol/L〕(P< 0.05)，雖然治療組甘油三酯(TG)的水平〔(2.11±0.64)mmol/L〕低于模型組〔(3.01±0.83)mmol/L〕，但差異無顯著性(P> 0.05)。

2.2H-E染色細(xì)胞核被蘇木精染為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染為紅色。海馬區(qū)神經(jīng)元錐體細(xì)胞緊密排列，而皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞分布較稀疏。治療組海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，濃染現(xiàn)象要輕于模型組，表明阿伐他汀治療后神經(jīng)元變性現(xiàn)象減輕。見圖1。

標(biāo)尺=50 μm 圖1　小鼠海馬區(qū)和大腦皮質(zhì)區(qū)H-E染色

2.3免疫組化顯色免疫組化陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，用PBS代替一抗的陰性對照未見棕黃色顆粒物。HDAC4和pCREB在海馬區(qū)和大腦皮質(zhì)區(qū)的細(xì)胞核和質(zhì)中均有表達(dá)，見圖2。阿伐他汀處理后，海馬區(qū)和大腦皮質(zhì)區(qū)HDAC4的表達(dá)均降低(P<0.05)；阿伐他汀處理后，pCREB在海馬區(qū)和大腦皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)均升高(P<0.05)。見圖3。

標(biāo)尺=50 μm 圖2　小鼠海馬區(qū)和大腦皮質(zhì)區(qū) HDAC4和 pCREB免疫組化顯色

1)P<0.05 圖3　HDAC4和pCREB在小鼠海馬區(qū)和 大腦皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)

3討論

流行學(xué)研究表明,他汀類藥物對AD病人癥狀有保護(hù)作用〔4〕，尤其對于具有高脂血癥的AD病人,但機(jī)制目前還不清楚。

近期研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控因子尤其是組蛋白乙?；揎椩谏窠?jīng)發(fā)育和調(diào)控中具有重要作用〔5〕。組蛋白乙?；酵ㄟ^組蛋白乙?；?HATs)和HDACs共同調(diào)控。HAT作用是為組蛋白提供乙?；菇M蛋白乙酰化水平提高，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與DNA序列接合，激活相關(guān)基因表達(dá)。HDAC主要作用是降低染色質(zhì)乙?；?，抑制基因的表達(dá)〔6〕。臨床AD病人和模型動(dòng)物腦組織的染色質(zhì)乙?；骄@著降低。HDAC在高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要調(diào)控作用〔7〕。HDACs家族共有11個(gè)成員，分為四大類，目前已證明HDAC2、3和4在神經(jīng)生長發(fā)育和記憶認(rèn)知方面具有負(fù)調(diào)控作用〔8,9〕，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)HDAC4在ApoE基因敲除小鼠海馬區(qū)表達(dá)顯著升高。HDAC作為一類染色質(zhì)修飾因子，是通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而調(diào)節(jié)下游功能基因表達(dá)影響神經(jīng)的生長發(fā)育，而CREB是調(diào)控神經(jīng)生長發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。 Vecsey等〔10〕已證明HDAC通過CREB負(fù)調(diào)控記憶與突觸的可塑性，Bolger等〔11〕用帶有熒光酶素報(bào)告基因的CRE響應(yīng)原件，發(fā)現(xiàn)HDAC4轉(zhuǎn)移至核內(nèi)將直接抑制CREB的轉(zhuǎn)錄活性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿伐他汀可能通過降低HDAC4在腦部的表達(dá)引起染色質(zhì)乙?；教岣?，激活轉(zhuǎn)錄因子pCREB，促進(jìn)下游調(diào)控基因Bcl-2、BDNF、Synaptophysin和SNAP25等的表達(dá)。其調(diào)控機(jī)制可能為HDAC4表達(dá)被抑制后激活了CREB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控程序性細(xì)胞存活機(jī)制(PCL〔12,13〕)，(1)促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡；(2)提高神經(jīng)生長因子BDNF、突觸素相關(guān)蛋白Synaptophysin和SNAP25表達(dá)，增強(qiáng)神經(jīng)元活性；(3)除了阿伐他汀可以降低血管性炎癥反應(yīng)，CREB介導(dǎo)的PCL機(jī)制也可以減少Aβ表達(dá)和沉積，減弱神經(jīng)炎癥反應(yīng)；最終促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長發(fā)育，提高記憶認(rèn)知能力〔14,15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HDAC4調(diào)控的CREB轉(zhuǎn)錄激活途徑可能在阿伐他汀治療高脂血癥引起的腦神經(jīng)退行性疾病具有重要作用，為闡明其治療機(jī)制提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。

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〔2014-11-19修回〕

(編輯李相軍)