聚丙烯酰胺凝膠電泳快速染脫色方法的應(yīng)用

李建偉李俐陸陪信李曉林張家穎

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)中心，吉林長春130021)

摘要〔〕目的探討建立聚丙烯酰胺凝膠電泳的無毒性染色和快速脫色的方法。方法在染色和脫色時分別10%的三氯醋酸代替高濃度的醋酸，用乙醇替代有毒性的甲醛，同時用微波加熱染色、脫色。結(jié)果與傳統(tǒng)方法比較，在不影響檢測靈敏度的情況下，減少了有毒性有機(jī)溶劑使用，大大縮短分析所需時間，且降低實(shí)驗(yàn)成本。結(jié)論改良方法具有染色背景淺、省時、降低成本、安全低毒等優(yōu)點(diǎn)，是一種便于推廣的好方法。

關(guān)鍵詞〔〕電泳；聚丙烯酰胺；蛋白質(zhì)染色

中圖分類號〔〕R33〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助(No.30570688)

通訊作者：李俐(1957-)，女，高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)改革研究。

第一作者：李建偉(1961-)，男，主管技師，主要從事生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)改革研究。

聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離、分析蛋白質(zhì)常用的方法。在蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)中，蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后的染色是十分重要的環(huán)節(jié)。電泳后的常規(guī)染色方法已有很多，目前一般采用的染色、脫色方法是用甲醇-醋酸〔1〕。但在學(xué)生的實(shí)驗(yàn)中，脫色液用量相當(dāng)大，且脫色時間長〔2〕，不但試劑成本耗費(fèi)比較高、實(shí)驗(yàn)時間長，而且甲醇的毒性有害健康〔3〕。為此，本文用乙醇代替甲醛，用10%的三氯醋酸代替高濃度的醋酸配制染色、脫色液，并用微波爐加熱染色、脫色的方法〔4，5〕，建立了一種成本低、無毒性的快速染色、脫色方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑和儀器丙烯酰銨、N，N'-甲叉雙丙烯酰銨、過硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三羥甲基甘氨酸(Tricine)、鹽酸、氫氧化鈉、四甲基乙二胺(TEMED)、核黃素、甘氨酸、蔗糖、溴酚藍(lán)、三氯乙酸(TCA) 、考馬斯亮藍(lán)G250、95%乙醇(均為上海生工生物工程有限責(zé)任公司)。電泳采用MV-Ⅱ型雙垂直板微型電泳系統(tǒng)。

1.1.2染色液、脫色液的配制見表1。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1制膠取小燒杯，根據(jù)預(yù)定膠濃度，吸取定量的凝膠應(yīng)用液，依次加入分離膠應(yīng)用液、水、TEMED，慢速攪拌，并在真空干燥器中抽氣 3 min。加入過硫酸銨輕輕攪拌后，立即將膠液沿玻壁注入傾斜一定角度的垂直板型凝膠玻璃板模具中，至距上沿 約3 cm處。然后用滴管沿玻璃板內(nèi)壁緩緩注入一 層蒸餾水隔離空氣，室溫垂直放置，使凝膠液聚合。 30～40 min后分離膠完全聚合，傾出分離膠上的覆蓋層液體，用濾紙條吸干殘留水分。注入濃縮膠(小心不要產(chǎn)生氣泡)，將膠液加到距玻璃頂端1 cm處插入樣品模具梳子，放在紫外燈下，使凝膠聚合。膠凝后，去掉硅膠條。將凝膠板安裝在微型電泳槽上。在內(nèi)外緩沖液槽中均加入電極緩沖液，小心拔出樣品槽模具，加樣。

表1　改進(jìn)前后染色液、脫色液配制方法對比 〔3〕

1.2.2樣品制備 取4份樣品液，5份40%的蔗糖-0.1%溴酚藍(lán)-1 mmol/L。

1.2.3加樣和電泳在樣品槽內(nèi)用微量注射器依次加入20～30 nm樣品溶液，電泳的條件為濃縮膠中的電壓120 V，待樣品進(jìn)入分離膠后，改為150 V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距玻璃板底部1 cm時，停止電泳。

1.2.4固定和染色方法1：將電泳完的凝膠放入用考馬斯亮藍(lán)R-250、甲醇、冰醋酸配制的染色液中，然后放在搖床上搖動染色，15 min后取出凝膠，用蒸餾水沖洗3次，再加入100 ml的脫色液，在搖床上脫色，20 min后倒掉變藍(lán)脫色液，然后用蒸餾水沖洗3次，棄去變藍(lán)的蒸餾水，再倒入100 ml脫色液重復(fù)上面操作3次。方法2：將電泳完的凝膠放入盛有100 ml的用考馬斯亮藍(lán)R-250、10%三氯醋酸、乙醇配制的染色液的塑料盤中，蓋子扣嚴(yán)，在微波爐中用高火照射10 s染色，然后用蒸餾水反復(fù)沖洗3次。再將凝膠放入100 ml脫色液中，高火檔照射20 s，然后倒掉脫色液，用蒸餾水沖洗，棄去變藍(lán)的蒸餾水。再加入新鮮脫色液再照射20 s，重復(fù)3 次，凝膠體積會逐漸縮小，將其用蒸餾水反復(fù)沖洗，恢復(fù)到原來的體積。凝膠先出現(xiàn)紫色條帶，然后逐漸變成較清晰的藍(lán)色條帶。

2結(jié)果

2.1不同染色方法比較實(shí)驗(yàn)表明用乙醇代替甲醇，實(shí)驗(yàn)分辨率幾乎沒有區(qū)別。見圖1，圖2。

圖1　用方法1染色、脫色的效果

圖2　用方法2染色、脫色的效果

2.2不同脫色方法的比較用原來的方法，加入脫色液然后放在搖床上染色脫色需要1.5～2 h；改用微波爐加熱方法染色、脫色只需要20～30 min，并且脫色效果更清晰。見圖1，圖2。

3討論

蛋白質(zhì)染色及固定原理實(shí)際上就是使蛋白質(zhì)變性，從水相中析出到凝膠相中，使其不再發(fā)生自由擴(kuò)散，使用的染色劑中有三氯乙酸、乙醇，其分子不僅與蛋白質(zhì)的帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合，而且通過氫鍵和肽鍵結(jié)合，其結(jié)果使蛋白質(zhì)分子失去水化水分子，同時在肽鍵表面包上一層疏水的基團(tuán)，這樣蛋白質(zhì)的水溶性被破壞后就從水相中沉淀到凝膠相上。另外，蛋白質(zhì)變性后結(jié)合染料的能力也大大增強(qiáng)了。所以，只要有足夠的三氯乙酸和乙醇溶液，染料的染色、固定作用就會好。經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)證明，用乙醇和10%的三氯醋酸代替有毒性的甲醛及高濃度的醋酸完全可以達(dá)到同樣的染色效果，且減少了污染、降低了試劑的成本。

微波加熱能夠促進(jìn)試劑向凝膠內(nèi)滲透和擴(kuò)散以及分子間相互作用。水浴或微波加熱處理的目的是將凝膠中的蛋白快速地固定，以免其擴(kuò)散，并可以大大節(jié)省膠片固定和染色時間、省卻過多的漂洗步驟。通過微波加熱處理可以在20～30 min內(nèi)完成凝膠的染色和脫色過程，與使用搖床染色、脫色方法相比，極大縮短了染色、脫色時間。膠片經(jīng)微波染色20 s即可達(dá)到用搖床方法染色1 h的效果，且微波脫色可在短時間內(nèi)使膠片底色脫除更加徹底。

通過實(shí)際應(yīng)用，筆者發(fā)現(xiàn)用改進(jìn)的染色、脫色方法不僅減少了毒性藥品的使用，同時大大縮短了實(shí)驗(yàn)時間，且降低了實(shí)驗(yàn)成本，可以在實(shí)驗(yàn)室推廣。

4參考文獻(xiàn)

1練玉銀，劉志剛，溫岸玲.鯉魚主要變應(yīng)原的分離、鑒定與純化〔J〕.中國公共衛(wèi)生，2006;22(8)：947-9.

2倪菊華，梁靜，賈竹青.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程〔M〕.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2008：26-39.

3Wang X，Wang D，Wang D，etal.Systematic comparison of technical details in CBB methods and development of a sensitive GAP stain for comparative proteomic analysis〔J〕.Electrophresis，2012;33(2)：296-306.

4Marchetti-Deschmann M，Kemptner J，Reichel C，etal.Comparing standard and microwave assisted staining protocols for SDS-PAGE of glycoproteins followed by subsequent PMF with MALDI MS〔J〕.Proteomics，2009;72(4)：628-39.

5劉吉民，張家穎.醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程〔M〕.長春：吉林大學(xué)出版社，2002：17-39.

〔2014-09-11修回〕

(編輯袁左鳴)