沙利度胺對人結(jié)腸癌小鼠移植瘤放射敏感性的影響及其機(jī)制

王媛惠雙

(南陽市中心醫(yī)院，河南南陽473000)

摘要〔〕目的探討沙利度胺對人結(jié)腸癌小鼠移植瘤放射敏感性的影響及其協(xié)同作用的機(jī)制。方法建立Colon26腸癌小鼠移植瘤模型，將28只小鼠隨機(jī)分為對照組、單純放療組(R組)、單純沙利度胺組(T組)、放療聯(lián)合沙利度胺組(T+R組)。自治療當(dāng)日起，次日測量腫瘤體積，計(jì)算腫瘤抑制率，并將小鼠斷髓處死后剝離瘤體，采用免疫組織化學(xué)法對各腫瘤組織中微血管密度(MVD)進(jìn)行測量。結(jié)果治療前各組小鼠移植瘤體積之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腫瘤體積隨治療時間的延長逐漸變大，對照組小鼠明顯大于另外三組(P<0.05)；其中T+R組小鼠移植瘤體積增長最慢，腫瘤生長曲線最為平緩。治療結(jié)束時，各實(shí)驗(yàn)組小鼠移植瘤體積均明顯小于對照組(P<0.05)；與對照組相比，T組、R組、T+R組抑制率分別為42.1%、47.3%、62.0%。對照組MVD數(shù)量最多，分布密集度最高；T+R組MVD數(shù)量最少，壞死區(qū)域面積最大，移植瘤組織中的MVD表達(dá)明顯低于另外三組(P<0.05)。結(jié)論沙利度胺能夠有效增強(qiáng)結(jié)腸癌小鼠移植瘤的放射敏感性，其可能機(jī)制與抑制移植瘤血管的生成有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕結(jié)腸癌；沙利度胺；放射敏感性；微血管密度；移植瘤

中圖分類號〔〕R735.3+5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：惠雙(1976-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤靶向治療研究。

第一作者：王媛(1985-)，女，碩士，主要從事腫瘤治療研究。

目前臨床對結(jié)腸癌治療的主要手段包括手術(shù)、放療、化療，其中放療是不可或缺的輔助治療手段，但腫瘤細(xì)胞通常對放療的敏感性較低〔1，2〕。研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可有效提升人食管癌細(xì)胞對放療的敏感性，且與血管內(nèi)皮生長因子有關(guān)〔3〕。但關(guān)于沙利度胺在提升結(jié)腸癌放療敏感性的作用效果和機(jī)制的研究仍鮮有報(bào)道。本次研究采用Colon26腸癌小鼠移植瘤模型，從腫瘤組織血管形成的角度初步探討抗腫瘤機(jī)制，觀察沙利度胺的放射增敏效果。

1材料與方法

1.1試劑與儀器沙利度胺，美國Sigma公司產(chǎn)品，批號093K461；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均為美國HyClone公司產(chǎn)品；大鼠抗小鼠CD34/IgG單克隆抗體購于北京翰譜醫(yī)藥生物研究所。放射治療設(shè)備采用Precise Clinac EX Primus型醫(yī)用電子直線加速器，德國西門子公司產(chǎn)品，TS100型倒置顯微鏡購于日本尼康公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞株健康雄性BALB/C小鼠28只，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：僦(京)2005-00130。小鼠結(jié)腸腺癌Colon26細(xì)胞系由鄭州大學(xué)提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法①模型建立：將結(jié)腸腺癌Colon26細(xì)胞系體外培養(yǎng)到指數(shù)生長期，制成單細(xì)胞懸液，取0.3 ml懸液(約含腫瘤細(xì)胞1×106)，在小鼠前腿進(jìn)行皮下注射，共接種28只，均成瘤，成功建立小鼠移植瘤模型。②分組：模型建立后1 w將28只小鼠隨機(jī)分對照組、單純放療組(R組)、單純沙利度胺組(T組)、放療聯(lián)合沙利度胺組(T+R組)，每組7只。對照組給予0.9%氧化鈉溶液灌胃，每次0.3 ml，1次/d；R組小鼠在清醒狀態(tài)下捆綁固定，用6 MVX射線照射，SSD為100 cm，照射劑量為8 Gy，輸出率300 mU/min；T組將沙利度胺用0.9%氧化鈉溶液溶解，按200 mg/kg劑量灌胃。③腫瘤生長曲線：治療后次日對腫瘤長徑(a)和與其垂直的短徑(b)進(jìn)行測量，估算腫瘤體積，計(jì)算腫瘤生長抑制率；飼養(yǎng)第22天時斷髓處死小鼠，將腫瘤剝離后放入4%中性甲醛固定液中。④腫瘤生長延遲(TGD)時間和放射增敏比(SER)：各實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤體積增大到開始實(shí)驗(yàn)時5倍需要的時間和對照組小鼠腫瘤用時得差值為TGD時間；T+R組TGD時間和R組TGD時間的比值為沙利度胺對照射的SER。

1.4腫瘤細(xì)胞壞死程度判斷首先在低倍鏡下對切片的整體染色情況進(jìn)行觀察，然后在高倍鏡下對切片的10個視野進(jìn)行觀察，在每個視野中計(jì)數(shù)100個重度壞死細(xì)胞，計(jì)算平均值反應(yīng)腫瘤組織中的壞死水平。

1.5免疫組化檢測微血管密度(MVD)用CD34對血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記，陽性細(xì)胞未呈淺黃色到深棕色顆粒；可被染色的內(nèi)皮細(xì)胞，只要同周圍微血管、相連組織之間有明顯的分界線，則作為一個可計(jì)數(shù)的微血管。取5個高倍鏡視野下血管數(shù)目的均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)及方差分析。

2結(jié)果

2.1各實(shí)驗(yàn)組對結(jié)腸癌小鼠移植瘤生長的影響治療前各組小鼠移植瘤體積之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腫瘤體積隨治療時間的延長逐漸變大，對照組小鼠明顯大于另外三組(P<0.05)；其中T+R組腫瘤體積上升最慢，生長曲線最平緩。與對照組小鼠相比，R組、T+R組小鼠腫瘤體積增加到治療前五倍時的TCD值分別為6.0、2.7 d，SER值2.32。治療第22天，各實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤體積均明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組相比，T組、R組、T+R組抑制率分別為42.1%、47.3%、62.0%。

2.2腫瘤組織病理形態(tài)對照組小鼠腫瘤細(xì)胞成片狀分布，生長旺盛，腫瘤壞死區(qū)極少；T組小鼠腫瘤細(xì)胞核體積小，排布緊密，染色質(zhì)濃縮邊集，少數(shù)細(xì)胞核斷裂表現(xiàn)出體積不等的細(xì)胞核小體；R組小鼠腫瘤細(xì)胞可見少量的組織濃染區(qū)和較多的腫瘤壞死區(qū)，組織中存在有少數(shù)異常腫瘤細(xì)胞，呈巢狀分布于正常腫瘤細(xì)胞間，細(xì)胞核濃染、固縮、壞死；T+R組小鼠腫瘤細(xì)胞中可見大面積壞死區(qū)域，極少數(shù)正常腫瘤細(xì)胞。見圖1。

2.3對MVD表達(dá)的影響對照組MVD數(shù)量最多，分布密集度最高；T+R組MVD數(shù)量最少，壞死區(qū)域面積最大，移植瘤組織中的MVD表達(dá)明顯低于另外三組(P<0.05)。見圖2，表1。

圖1　光鏡下各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)(×100)

圖2　光鏡下各組小鼠腫瘤組織中MVD的表達(dá)(×100)

分組MVD壞死細(xì)胞對照組37.68±11.3547.89±10.55T組23.87±11.8260.77±7.92R組22.78±10.4161.81±6.37T+R組20.58±11.7064.52±7.35

3討論

近年來研究顯示，沙利度胺能夠通過抑制腫瘤血管內(nèi)皮生長因子及堿性成纖維細(xì)胞生長因子的分泌，發(fā)揮抗血管生成的作用；通過升高自然殺傷(NK)細(xì)胞活性和調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，起到良好的抗腫瘤效果〔4〕?？鼓[瘤血管生成已經(jīng)逐漸成為臨床中腫瘤治療新的方案，與放療相互結(jié)合，能夠取得較好的治療效果。臨床治療中選用的特異性抗血管生成藥包括恩度、貝伐單抗等，由于價格較高，阻礙了其在經(jīng)濟(jì)條件不理想的癌癥患者中的推廣〔5〕。沙利度胺作為一種成本和售價較低的抗血管生成藥，逐漸得到了關(guān)注。高M(jìn)VD者放射敏感性好〔6〕。本次研究顯示，沙利度胺與放療聯(lián)合使用能夠明顯抑制結(jié)腸癌小鼠移植瘤的生長，抑制效果明顯好于沙利度胺與放療單獨(dú)使用。本次研究中還發(fā)現(xiàn)T+R組小鼠腫瘤生長抑制的程度明顯優(yōu)于T組、R組，而僅僅是兩個單獨(dú)治療方案相關(guān)療效的簡單加和，其原因主要為腫瘤病灶的生成是一個復(fù)雜的過程，通過多種因素的共同作用，需進(jìn)一步深入研究。本次研究中T+R組的MVD明顯低于另外三組，說明聯(lián)合治療能對結(jié)腸癌小鼠移植瘤的血管生成起到明顯的抑制作用。其原因除去放射治療能夠?qū)⒉糠帜[瘤細(xì)胞直接殺死，使腫瘤組織中MVD的表達(dá)降低之外，還可能因?yàn)樯忱劝纺軌驅(qū)δ[瘤組織中紊亂的血管網(wǎng)起到較好的改善作用，促使其功能和結(jié)構(gòu)正?；M(jìn)而使組織微循環(huán)得到改善，提升血液灌注和氧分壓，進(jìn)而提高了放療的效果。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-01-12修回〕

(編輯袁左鳴)