補(bǔ)腎健脾、扶正祛邪中藥在荷瘤小鼠化療過程中的減毒增效作用

張江華李恩李彬

(河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，河北石家莊050017)

摘要〔〕目的通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究扶正祛邪中藥的抗腫瘤作用及對(duì)外周血細(xì)胞凋亡的影響。方法采用昆明小鼠肉瘤移植模型，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組，腫瘤模型組，中藥治療組，環(huán)磷酰胺治療組，中藥+環(huán)磷酰胺治療組，觀察抑瘤效應(yīng)并檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)抑制率、平均存活期、血清乳酸脫氫酶(LDH)活性、外周血象及對(duì)荷瘤小鼠外周血細(xì)胞凋亡。結(jié)果各實(shí)驗(yàn)組對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，環(huán)磷酰胺(CTX)+中藥治療組抑瘤率達(dá)到81.4%；中藥治療或CTX+中藥治療后腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，與腫瘤生長(zhǎng)抑制率一致，減輕化療的骨髓抑制作用。結(jié)論CTX聯(lián)合中藥治療具有抗癌、減輕骨髓抑制作用，拮抗CTX的毒副作用，進(jìn)一步延長(zhǎng)荷瘤小鼠的壽命的作用。

關(guān)鍵詞〔〕中藥；化療；減毒增效

中圖分類號(hào)〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：李恩(1929-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)和臨床研究。

第一作者：張江華(1976-)，女，副教授，博士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

細(xì)胞凋亡是化療后惡性腫瘤細(xì)胞死亡的主要方式之一。既往一些實(shí)體瘤和腫瘤細(xì)胞株的凋亡研究工作都證實(shí)〔1～3〕，癌細(xì)胞在化療藥物作用下都出現(xiàn)細(xì)胞凋亡明顯增高的現(xiàn)象。但是化療藥物對(duì)外周血細(xì)胞凋亡情況，未引起足夠的重視。中醫(yī)對(duì)于惡性腫瘤治療的研究多集中于提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)患者對(duì)放、化療的敏感性，抑制癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡等方面〔4，5〕。目前一致認(rèn)為腫瘤病人各病期多有氣血陰陽(yáng)虛損之癥，采用和虛則補(bǔ)之，扶正固本，中西醫(yī)藥并用，既攻又補(bǔ)，以達(dá)到治療腫瘤又不損傷機(jī)體元?dú)獾哪康?。本文觀察“補(bǔ)腎健脾，祛痰散結(jié)”中藥的抗癌作用及對(duì)化療毒性的拮抗作用。

1材料與方法

1.1藥物補(bǔ)腎健脾、扶正祛邪中藥由枸杞子，茯苓，人參，生薏米仁，白術(shù)，當(dāng)歸，清半夏，首烏等組成(水煎、過濾、濃縮按成人劑量的15倍制成含生藥1.05 g/ml)，由河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省中醫(yī)院中藥房提供。

1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株肉瘤S180，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究室提供。

1.3主要試劑、藥品及儀器四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，二甲基甲酰胺均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基(Gibco產(chǎn)品)；乳酸脫氫酶(LDH)檢驗(yàn)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)0608155)。CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠制造)。

1.4建立小鼠肉瘤移植模型及給藥取昆明鼠18～22 g 90只(合格證書：冀醫(yī)動(dòng)之第036號(hào))，SPF級(jí)，雌雄各半，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組，模型組，中藥治療組，環(huán)磷酰胺(CTX)治療組，中藥+環(huán)磷酰胺治療組，每組18只。模型組和各治療組右腋皮下接種S180細(xì)胞0.2 ml/只(細(xì)胞濃度為5×106/ml)，造成實(shí)體瘤模型。所有小鼠均從接種腫瘤細(xì)胞之日起同時(shí)給藥，中藥0.4 ml·kg-1·d-1灌胃，CTX腹腔注射30 mg·kg-1·d-1(劑量按體重計(jì)算相當(dāng)于成人的10～15倍)，連續(xù)給藥10 d，對(duì)照組給予水。

1.5腫瘤生長(zhǎng)抑制率于末次給藥后次日，每組隨機(jī)處死動(dòng)物8只剝離瘤稱重，并觀察剩余動(dòng)物死亡時(shí)間，按公式計(jì)算腫瘤抑制率和存活延長(zhǎng)率。

1.6藥物對(duì)荷瘤小鼠血清乳酸脫氫酶LDH活性的影響分離血清，按LDH試劑盒說明測(cè)定血清LDH的活性。

1.7藥物對(duì)荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞的影響取外周血1 ml，分離單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌，70%乙醇固定，PBS洗滌，RNA酶消化PI染色，F(xiàn)ACS分析細(xì)胞凋亡率、S期細(xì)胞比率(SPF)及增殖指數(shù)(PI)。

1.8藥物對(duì)荷瘤小鼠紅細(xì)胞、血紅蛋白及血清促紅細(xì)胞生成素(EPO)的影響取抗凝血采用常規(guī)計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)紅細(xì)胞;高鐵氰化鉀法測(cè)血紅蛋白含量；胎肝細(xì)胞法測(cè)EPO活力。

1.9藥物對(duì)腫瘤組織凋亡的影響取各組S180實(shí)體瘤，PBS洗滌,剪成1 mm3大小，70%乙醇固定，蛋白酶K消化，PI染色，F(xiàn)ACS流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件行ANOVA單因素方差分析方法，使用LSD方法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果

2.1腫瘤生長(zhǎng)抑制率各實(shí)驗(yàn)組對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，CTX治療組、中藥治療組及CTX+中藥治療組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率與模型組相比差異顯著(P<0.01，P<0.05)。見表1。

表1　扶正祛邪復(fù)方對(duì)S180的抑瘤作用

與模型組比較：1)P<0.01，2)P<0.05

2.2荷瘤動(dòng)物平均存活期CTX治療組，中藥治療組，CTX+中藥治療組動(dòng)物的存活時(shí)間分別為：(12.6±2.2)d，(11.8±4.2)d，(14.2±1.3)d與模型組(8.3±0.8)d相比差異顯著(P<0.01或P<0.05)。

2.3血清LDH活性測(cè)定模型組血清LDH活性為(92.35±32.14)U/ml，與正常對(duì)照組(63.74±26.53)U/ml比較差異顯著(P<0.05)，中藥治療組為(81.42±18.43)U/ml，與模型組比較有所下降但無顯著差異(P>0.05)。CTX治療組為(59.37±27.66)U/ml，CTX+中藥治療組為(52.29±34.23)U/ml，與模型組差異顯著(P<0.05)，表明化療，中藥治療或CTX+中藥治療后腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，與腫瘤生長(zhǎng)抑制率一致。

2.4藥物對(duì)荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞凋亡的影響荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞的凋亡率，SPF和PI均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01或<0.05)；CTX治療組凋亡率進(jìn)一步升高與模型組比較差異顯著(P<0.05)，SPF和PI均有所降低，PI降低尤為明顯(P<0.01)；中藥治療組外周血細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.01)，SPF和PI均有所升高但無顯著意義(P>0.05)，PI值明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2　藥物對(duì)S180荷瘤小鼠外周

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.01，4)P<0.05；與CTX治療組比較：5)P<0.05

2.5藥物對(duì)荷瘤小鼠紅細(xì)胞，血紅蛋白及血清EPO的影響①正常對(duì)照組小鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)為(9.3±1.0)×107個(gè)/ml；模型對(duì)照組為(9.0±0.8)×107個(gè)/ml，中藥治療組為(9.6±0.5)×107個(gè)/ml，CTX化療組下降到(7.3±0.6)×107個(gè)/ml(與模型組比較P<0.01)，CTX+中藥治療組為(9.4±1.3)×107個(gè)/ml(與CTX治療組比較P<0.01)。②正常對(duì)照組小鼠血紅蛋白含量為(12.0±1.6)g/100 ml，模型組為(11.5±1.2)g/100 ml，中藥治療組為(11.1±0.9)g/100 ml，CTX治療組為(8.2±0.9)g/100 ml(與模型組比較P<0.01)，CTX+中藥治療組為(12.8±2.8)g/100 ml(與CTX治療組比較P<0.01)。③正常對(duì)照組小鼠EPO的活性為(18.1±8.0)mU/ml,模型組為(18.7±8.6)mU/ml，中藥治療組為(26.4±8.6)mU/ml，與模型組比較無顯著差異(P>0.05)，CTX治療組為(44.4±8.3)mU/ml，與模型組比較差異顯著(P<0.05)，CTX+中藥治療組為(28.7±9.2)mU/ml，與CTX治療組比較差異顯著(P<0.05)。

3討論

就環(huán)磷酰胺來講，雖然對(duì)多種惡性淋巴瘤、白血病等有較好的療效，但同時(shí)其毒性作用也相當(dāng)嚴(yán)重：免疫抑制，骨髓抑制，各種血細(xì)胞減少，肝腎毒性，惡心，嘔吐，脫發(fā)等〔6，7〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CTX在誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也導(dǎo)致外周血白細(xì)胞凋亡，紅細(xì)胞減少，血紅蛋白降低的貧血癥狀。從中醫(yī)角度，化療副反應(yīng)主要表現(xiàn)為損傷氣血，脾胃失調(diào)及肝腎虧損等證候。

中醫(yī)認(rèn)為，癌癥屬中醫(yī)外科的“陰毒惡論”，“石瘤”，“積聚”和“貯痰”等。不管“里寒陰毒證”。特別是中晚期患者，其病灶中所加的物質(zhì)有屬中醫(yī)的“里寒濕證”。從臨床表現(xiàn)來看，患者大多為痰濕蘊(yùn)結(jié)，陽(yáng)氣不足或“陽(yáng)虛寒濕”的共同病機(jī)，從損害的程度來看，大多表現(xiàn)為脾、腎、肺、肝、胃等的氧氣虧虛?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)中醫(yī)藥在腫瘤治療中的作用已進(jìn)行了廣泛的研究，鑒于數(shù)代人的認(rèn)識(shí)，綜合擬定以“補(bǔ)腎健脾，祛痰散結(jié)”為主的治療大法，通過溫補(bǔ)人體陽(yáng)氣和甘酸寒味之品的配伍，調(diào)理臟腑，經(jīng)絡(luò)，氣血，陰陽(yáng)，又兼攻堅(jiān)消積，抗腫瘤，研究扶正祛邪復(fù)方對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的治療作用及減輕化療毒副反應(yīng)的作用，具有互補(bǔ)，達(dá)到減毒增效的目的。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常小鼠外周血細(xì)胞凋亡和增殖趨于平衡,荷瘤小鼠外周血細(xì)胞凋亡明顯較正常小鼠多，細(xì)胞增殖活性變化不大，化療后細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增多，細(xì)胞增殖活性卻顯著降低，合并中藥治療可防止化療對(duì)荷瘤小鼠外周血細(xì)胞的這種作用，單純中藥又降低荷瘤小鼠外周血細(xì)胞凋亡率和提高細(xì)胞增殖活性的趨勢(shì)。據(jù)現(xiàn)有資料分析〔8〕，惡性腫瘤患者外周血細(xì)胞凋亡增加的原因有：①外周血免疫細(xì)胞通過凋亡機(jī)制的清除，腫瘤細(xì)胞侵入外周血中，成為新的抗原，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞數(shù)量增加，功能增強(qiáng)，免疫系統(tǒng)在執(zhí)行功能過程中有大量免疫細(xì)胞凋亡，沒有免疫細(xì)胞凋亡，機(jī)體就不會(huì)有健全的免疫防御系統(tǒng)。②化療藥物作用腫瘤患者機(jī)體后，不僅誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)也誘導(dǎo)正常體細(xì)胞和淋巴細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致。

本實(shí)驗(yàn)表明，該復(fù)方能阻止CTX對(duì)白細(xì)胞，紅細(xì)胞，血紅蛋白的降低作用。腎性貧血是血清EPO水平升高較少，腎衰時(shí)EPO產(chǎn)生不足。CTX可因骨髓抑制引起小鼠外周血紅細(xì)胞及HB降低，導(dǎo)致血清EPO水平代償性升高。本實(shí)驗(yàn)中扶正祛邪復(fù)方可改善骨髓造血抑制CTX引起的血清EPO水平代償性升高，表明中藥的整體調(diào)節(jié)作用。

該復(fù)方單獨(dú)應(yīng)用及與CTX聯(lián)合應(yīng)用治療S180實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤小鼠表明：該復(fù)方能抑制腫瘤生長(zhǎng)延長(zhǎng)荷瘤小鼠壽命，與CTX聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可拮抗CTX的毒副作用，進(jìn)一步延長(zhǎng)荷瘤小鼠的壽命，從不同側(cè)面為該方藥的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

4參考文獻(xiàn)

1Xu RC，Chen XY，Chen L.The initial research on hoptoad inducing human HL-60 cell apoptosis〔J〕.Chin J Chin Med，2001；26(1)：59-61.

2Rong Y，Liang FY，Chen L.The dehydromethyl organies of tiger beetle inducing the lineages of mammary cancer apoptosis and influencing the expression of bcl-2〔J〕.Cancer，2000；19(12)： 1077-81.

3Liu CX，Gao G，Sun M,etal.Study on compound-polysaccharide of fungi inducing liver cancer Bel-7402 cell apoptosis〔J〕.J Hyg Res，2001； 30(1)：40-3.

4袁宗軍.中西醫(yī)結(jié)合治療惡性腫瘤探討〔J〕.中醫(yī)藥研究，2002；18(3)：61.

5郁仁存.中西醫(yī)結(jié)合腫瘤防治研究的進(jìn)展〔J〕.中國(guó)腫瘤，1999；8(10)：461.

6譚先杰，吳嗚，郎景和.婦科惡性腫瘤化療后骨髓抑制處理中的實(shí)用問題〔J〕.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2009；25(5):272.

7陳志偉，祝彼得，嚴(yán)蘇純，等.骨髓抑制性貧血小鼠模型的研究〔J〕.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2006；16(5):260-2.

8周振英，張軍妮，朱月清.香菇多糖對(duì)腫瘤患者外周血細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中國(guó)腫瘤生物治療學(xué)雜志，1997；4(3)：233.

〔2013-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)