通心絡(luò)對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道的影響及作用機(jī)制

李暢

(瀘州醫(yī)學(xué)院心血管醫(yī)學(xué)研究所，四川瀘州646000)

摘要〔〕目的探討通心絡(luò)對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)的影響及作用機(jī)制。方法將30只10周齡的雄性SD大鼠隨機(jī)分為大劑量通心絡(luò)組(1.0 g·kg-1·d-1)、小劑量通心絡(luò)組(0.5 g·kg-1·d-1)和模型對(duì)照組，每組10只，經(jīng)腹主動(dòng)脈部分縮窄術(shù)制作高血壓大鼠模型，另選10只同齡SD大鼠作為正常對(duì)照組，采用酶消化法和貼塊法分離VSMC，采用膜片鉗技術(shù)記錄各組大鼠VSMC的BKCa通道開放概率(Po)、電流幅度值(Amp)、平均開放時(shí)間(To)和平均關(guān)閉時(shí)間(Tc)的變化。結(jié)果不同Ca2+濃度下的正常對(duì)照組和模型對(duì)照組的BKCa通道活性均明顯增強(qiáng)，呈顯著的濃度依賴性。Po以及To均隨著浴液Ca2+濃度的增加而增加，Tc隨著浴液Ca2+濃度的增加而縮短，浴液Ca2+濃度對(duì)BKCa通道的Amp影響不大；與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組通道活性的改變更顯著(P<0.05)。保持浴液游離的Ca2+濃度為10-7 mol/L，鉗制電壓固定在+40 mV時(shí)，內(nèi)面外向式的膜片下，模型對(duì)照組的Po水平顯著高于正常對(duì)照組，Tc顯著低于正常對(duì)照組；大、小劑量的通心絡(luò)組的Po及To的水平均顯著高于模型對(duì)照組，Tc顯著低于模型對(duì)照組；大劑量通心絡(luò)組的Po及To的水平比小劑量通心絡(luò)組更高，Tc的水平更低(均P<0.05)。結(jié)論通心絡(luò)能夠激活大鼠VSMC的BKCa通道，能擴(kuò)張血管。

關(guān)鍵詞〔〕通心絡(luò)；大電導(dǎo)鈣激活鉀通道；血管平滑肌細(xì)胞

中圖分類號(hào)〔〕R54〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：李暢(1983-)，女，在讀碩士，主要從事心血管電生理方面的研究。

通心絡(luò)具有通絡(luò)止痛、活血益氣、改善血脂代謝、動(dòng)脈僵硬和血液高凝狀態(tài)等作用〔1〕。但通心絡(luò)治療血管擴(kuò)張性疾病的功效研究不多，高血壓在宏觀上表現(xiàn)為心機(jī)重量及心室壁增厚，在組織上表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大及纖維化，其中心肌間質(zhì)及心肌內(nèi)冠脈小血管周圍的膠原過(guò)度的沉積和增多表現(xiàn)最明顯，阻力血管肥厚是高血壓的主要病理特征，同時(shí)是高血壓心、腎、腦靶器官損害的一個(gè)病理基礎(chǔ)。本次實(shí)驗(yàn)采用腹主動(dòng)脈部分縮窄術(shù)建立大鼠心肌肥厚即高血壓模型，采用膜片鉗技術(shù)并運(yùn)用Pclamp(version 10.1)軟件系統(tǒng)記錄不同劑量的通心絡(luò)對(duì)大鼠通心絡(luò)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)的影響，以期從細(xì)胞水平和分子水平探討其擴(kuò)張血管水平的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物選擇與分組將30只10周齡的雄性SD大鼠(由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供)隨機(jī)分為大劑量通心絡(luò)組(1.0 g·kg-1·d-1)、小劑量通心絡(luò)組(0.5 g·kg-1·d-1)和模型對(duì)照組，每組10只，藥物干預(yù)2個(gè)月，經(jīng)腹主動(dòng)脈部分縮窄術(shù)制作高血壓大鼠模型，另選10只同齡SD大鼠作為正常對(duì)照組。

1.2方法

1.2.1模型制作方法采用腹主動(dòng)脈部分縮窄術(shù)制作高血壓大鼠模型：術(shù)前大鼠禁食12 h，至術(shù)前半小時(shí)給大鼠注射慶大霉素及氯霉素。運(yùn)用氯胺酮行腹腔麻醉，將其置于仰臥位固定，于大鼠的腹中線位切開皮膚和肌肉。將腹主動(dòng)脈及腎動(dòng)脈分離后，用7號(hào)的注射針頭緊貼在距腎動(dòng)脈的上方1 cm處的腹主動(dòng)脈，平行放置，之后用4號(hào)的手術(shù)絲線將腹主動(dòng)脈和腎動(dòng)脈一起結(jié)扎，最后抽出針頭，逐層將肌肉和皮膚縫合，其中10只正常對(duì)照組只將主動(dòng)脈分離但不做結(jié)扎術(shù)。術(shù)后連續(xù)注射青霉素5 d。

1.2.2給藥方法將通心絡(luò)置于蒸餾水中溶化，對(duì)高血壓大鼠進(jìn)行灌胃，給予模型對(duì)照組和正常對(duì)照組大鼠相同劑量的蒸餾水灌胃，通心絡(luò)由河北石家莊以嶺藥業(yè)有限公司提供。

1.2.3血壓測(cè)量采用MRB-ⅢA型的電腦大鼠血壓及心率測(cè)定儀(由北京中日友好醫(yī)院研究所制造)，于大鼠清醒的狀態(tài)下進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性測(cè)定尾動(dòng)脈收縮壓和心率。將尾動(dòng)脈測(cè)壓儀提前預(yù)熱半小時(shí)，定標(biāo)壓力信號(hào)，將實(shí)驗(yàn)SD大鼠固定在固定盒內(nèi)，通過(guò)加壓套將大鼠的尾部插入至尾根部，使得鼠尾恰好在脈搏傳感器的上方，之后調(diào)節(jié)鼠尾的壓迫片，使得傳染片貼住鼠尾的尾動(dòng)脈，在大鼠脈搏穩(wěn)定后測(cè)量血壓。

1.2.4實(shí)驗(yàn)溶液的配制臺(tái)氏液(mmol/L)的配制：1 000 ml臺(tái)氏液含有NaCl 8.0 g、10%的KCl 2.0 ml(0.2 g)、10%的MgSO4·7H2O 2.6 ml(0.26 g)、5%的NaH2PO4·2H2O 1.3 ml(0.065 g)、NaHCO3(1.0 g)、 1 Mol/L CaCl21.8 ml(0.2 g)、葡萄糖 1.0 g。配制時(shí)不加CaCl2則是無(wú)鈣臺(tái)氏液。電極液(mmol/L)的配制：KCl 1.0、CaCl21.0、MgCl21.0、K-Asp 40.0以及HEPES 10.0，用KOH將pH調(diào)至7.1~7.4。臺(tái)氏液及電極液都是對(duì)稱性的高鉀液。

1.2.5大鼠主動(dòng)脈VSMC的分離將游離出的大鼠主動(dòng)脈中模剪成2 mm×4 mm的條塊，將其放入酶液Ⅰ(木瓜蛋白酶1，牛血清白蛋白2，二硫基蘇糖醇0.68)中，放置在恒溫水(37℃)中振蕩消化7.5 min。之后再放入酶液Ⅱ(F-型膠原酶1.615，透明質(zhì)酸酶1.25)，同樣在恒溫水中振蕩消化9 min，最后用拋光了的圓頭吸管吹打8~10次血管組織，可以得到大量的平滑肌細(xì)胞，將分離好的細(xì)胞懸液滴入玻璃培養(yǎng)皿，4℃保存。

1.2.6膜片鉗技術(shù)選擇貼壁好、表面光滑有立體感、紋理清晰且遮光性強(qiáng)的梭行VSMC細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將VSMC放置在顯微鏡下倒置的浴槽中，通過(guò)加樣槍加入1 ml的浴液；之后將灌有電極液的微管電極放在放大器的夾持器上，給予一定正壓于電極內(nèi)，將電極尖端置于浴液中；通過(guò)高倍鏡觀察并操縱使得電極的尖端緊貼于細(xì)胞表面，觀察到應(yīng)答電流降低后施加負(fù)壓，直至應(yīng)答電流減小至零；高阻封接形成后，運(yùn)用電極操縱器將微電極迅速提起，將其于空氣中暴露3 s后再次置于浴槽中，如此時(shí)應(yīng)答電流以及阻抗和以前相比均沒(méi)發(fā)生變化，則形成了內(nèi)面向外式的膜片。實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)通過(guò)Pclamp(version 10.1)軟件進(jìn)行處理分析，經(jīng)Clampfit分析程序自動(dòng)測(cè)量各組大鼠VSMC的BKCa的開放概率(Po)、電流幅度值(Amp)、平均開放時(shí)間(To)和平均關(guān)閉時(shí)間(Tc)。

2結(jié)果

2.1各組血壓比較通心絡(luò)組和模型對(duì)照組的SD大鼠的血壓水平〔(157±9)mmHg,(165±4)mmHg〕顯著高于正常對(duì)照組〔(102±7)mmHg〕(P<0.05)。

2.2兩組BKCa的鈣敏感性比較在內(nèi)面外向式的膜片下，不同Ca2+濃度0、10-8、10-7、10-6mol/L下的正常對(duì)照組和模型對(duì)照組的BKCa通道活性均明顯增強(qiáng)，呈顯著的濃度依賴性；Po以及To均隨浴液Ca2+濃度的增加而增加，Tc隨著浴液Ca2+濃度的增加而縮短，浴液Ca2+濃度對(duì)BKCa通道的Amp影響不大，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組通道活性的改變更顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3通心絡(luò)對(duì)BKCa通道的影響保持浴液游離的Ca2+濃度為10-7mol/L，鉗制電壓固定在+40 mV時(shí)，內(nèi)面外向式的膜片下，模型對(duì)照組的Po水平顯著高于正常對(duì)照組，Tc顯著低于正常對(duì)照組；大、小劑量的通心絡(luò)組的Po及To的水平均顯著高于模型對(duì)照組，Tc顯著低于模型對(duì)照組；大劑量通心絡(luò)組的Po及To的水平比與小劑量通心絡(luò)組更高，Tc的水平更低(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1　兩組在不同的Ca 2+濃度下BKCa活性相關(guān)指標(biāo)的比較

與正常對(duì)照組同濃度比較：1)P<0.05；與同組Ca2+濃度為0 mol/L比較：2)P<0.05

表2　不同組BKCa活性相關(guān)指標(biāo)的比較

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型對(duì)照組比較：2)P<0.05；與小劑量通心絡(luò)組比較：3)P<0.05

3討論

血管平滑肌的張力調(diào)節(jié)主要受神經(jīng)調(diào)節(jié)、肌源性調(diào)節(jié)和體液調(diào)節(jié)等因素影響。受到牽張刺激時(shí)，血管平滑肌可使得VSMC去極化，產(chǎn)生微血管收縮，而當(dāng)牽張刺激減弱或血壓降低時(shí)，管壁將自動(dòng)舒張〔2〕。BKCa在VSMC中廣泛存在，是血管平滑肌上主要的一種外向電流通道，能起到調(diào)節(jié)血管的舒縮作用，尤其在血管的肌源性調(diào)節(jié)過(guò)程起著重要作用〔3〕。當(dāng)VSMC因各種原因引起去極化時(shí)，將激活細(xì)胞膜上電壓依賴性的鈣通道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度急劇上升，從而Ca2+-鈣調(diào)蛋白-肌球蛋白輕鏈激酶途徑被激活，引起VSMC收縮，從而血管的緊張性被增強(qiáng)。隨著細(xì)胞內(nèi)的Ca2+上升，BKCa又被激活，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣泵敏感性通道得以開放，鉀離子外流，使得電壓依賴性的Ca2+內(nèi)流停止或減少，胞內(nèi)的鈣濃度降低，細(xì)胞膜趨向超計(jì)劃，最后，血管平滑肌得到舒張，以此對(duì)抗去極化造成的血管收縮〔4〕。由此BKCa的負(fù)反饋?zhàn)饔闷鸬搅苏{(diào)控VSMC去極化及血管收縮程度，維持機(jī)體在靜息狀態(tài)下的血管張力的作用。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與有關(guān)報(bào)道一致〔5〕。

血管功能性的收縮加強(qiáng)是高血壓的發(fā)病因素之一，高血壓時(shí)VSMC的過(guò)度增殖將引起阻力血管肥厚和管腔狹窄，使得機(jī)體對(duì)體內(nèi)的收縮血管活性物的反應(yīng)增強(qiáng)，而對(duì)舒張血管活性物的反應(yīng)下降，造成更嚴(yán)重的管腔狹窄，加劇了血壓的升高，產(chǎn)生高血壓的“惡性循環(huán)”〔6〕。而BKCa功能以及量的變化又在血管功能性發(fā)揮上占有重要作用，因此，有效地干預(yù)和治療手段，尋求一種新的BKCa激動(dòng)劑能夠有效降低心血管事件的發(fā)生，從而延長(zhǎng)人類壽命。以往的研究〔7〕表明，通心絡(luò)能夠有效減輕心肌梗死后心肌間質(zhì)的膠原纖維沉積；心絞痛病人經(jīng)通心絡(luò)治療后，其von Willebrand水平能顯著降低，纖維結(jié)合蛋白的水平明顯回落，證明通心絡(luò)能起到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的效果〔8〕；通心絡(luò)可以顯著降低高血壓大鼠的血清內(nèi)皮素水平，使大鼠NO的濃度增加，從而改善血管內(nèi)皮功能〔9〕；通心絡(luò)一方面能在某種程度上阻止高血壓大鼠的血壓上升，同時(shí)能抑制高血壓大鼠的阻力血管肥厚〔10〕。本研究結(jié)果與上述已有研究結(jié)論一致。結(jié)果表明通心絡(luò)能夠在不降低血壓的情況下改善高血壓患者的血管重塑，這可能是由于通心絡(luò)將BKCa激活后，VSMC的鉀離子外流，引起細(xì)胞膜的超極化，降低Ca2+內(nèi)流以及細(xì)胞內(nèi)的Ca2+釋放，抑制電壓依賴性的鈣通道，使得阻力血管的非內(nèi)皮依賴性舒張功能得到改善。

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〔2014-09-27修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)