張麗影，汪寒寒，潘 婷，邢承華*，蔡妙珍

產纖維素酶菌株的篩選及產酶條件優(yōu)化

張麗影1，汪寒寒2，潘 婷2，邢承華3*，蔡妙珍2

（1. 浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004；2. 浙江師范大學 地理與環(huán)境科學學院，浙江 金華 321004；3. 金華職業(yè)技術學院 農業(yè)與生物工程學院，浙江 金華 321007）

以羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選菌株，經初篩和復篩篩選出目的菌株后，通過觀察菌落形態(tài)、顏色和孢子形態(tài)等方法初步鑒定目的菌株。結果表明，本研究篩選出的2株目的菌株均為黑曲霉。菌株的最佳碳源和氮源分別為1.0%CMC-Na和0.3%酵母膏，最佳培養(yǎng)起始pH值和最適宜溫度分別為4和40℃。在此條件下培養(yǎng)7d后菌株1和菌株2的CMCase酶活分別達到0.504 IU/mL和0.277 IU/mL。

產纖維素酶菌；篩選；羧甲基纖維素酶；酶活力

纖維素是地球中最豐富、來源最廣泛的碳水化合物，它的降解與循環(huán)利用是實現碳循環(huán)的重要途徑[1]。近年來，由于持續(xù)的能量耗損，枯竭的化石燃料與環(huán)境污染的加重，使得人們越來越關注碳資源的利用[2]。因此，纖維素的降解利用引起高度關注與重視。目前，纖維素一般用作燃料，或是被燒荒、遺棄腐爛掉，這不僅浪費了資源，還會引起嚴重的環(huán)境污染[3-4]。所以，纖維素的綜合利用與有效的轉化對于解決當前的能源危機、糧食短缺、環(huán)境污染等有重大的意義。

纖維素酶（cellulase）是降解纖維素的一組酶系總稱[5]，它能將纖維素分解為葡萄糖，在食品、造紙、紡織、洗滌和飼料等工業(yè)有重要作用[6-9]。而降低纖維素酶的生產成本是纖維素酶真正用于工業(yè)生產的首要條件。因此，選育高酶活的纖維素分解菌株就成了關鍵之一。目前，大多數的商業(yè)纖維素酶都是由木霉屬和曲霉屬菌株生產得到的[10-11]。已有報道研究篩選產纖維素酶菌株，使經過微生物處理的玉米秸稈等轉化為動物易吸收或利用的能源、物、料或化工原料，以實現纖維素的合理應用[12-13]。近年來，國內外對于產纖維素酶菌株篩選的報導雖較多，但大部分研究集中在對秸稈的降解上[14?16]，而且多數試驗均采用單一的菌株對秸稈進行降解，降解效果不佳[17]。本文從長期栽培水稻的土壤中分離出產纖維素酶菌株，測定了纖維素酶活力并對其進行產纖維素酶條件優(yōu)化，最大程度的增大菌株的產酶量及菌株的酶活力，利用優(yōu)化的菌株共同處理平菇菌糠及杏鮑菇菌糠，以便降解菌糠中的粗纖維成分，使菌糠轉化成利于動物消化和吸收的菌糠飼料。

1 實驗

1.1 試劑與材料

菌種來源：從浙江師范大學生物園栽培水稻半年以上的土壤中，采集距地面約5～25 cm深處的土樣，從中分離篩選產纖維素酶菌株。

初篩培養(yǎng)基：孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基[18]、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMC-Na）[19]。

斜面培養(yǎng)基：PDA完全培養(yǎng)基[18]。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[4]：蛋白胨3 g，NH4NO32 g，酵母粉 0.5 g，KH2PO44 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，CMC-Na 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0～7.4。

初步鑒定培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基[18]。

1.2 菌株的篩選

將采集的土樣置于生理鹽水中震蕩，以制備菌懸液。取0.1 mL懸浮液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別挑取生長不同的菌落劃線分離接種于以CMC-Na為唯一碳源的CMC培養(yǎng)基中，直至分離得到純菌株，采用剛果紅染色法觀察純菌落的透明圈直徑[20]，篩選出透明圈直徑最大的菌株，即初步斷定具有纖維素降解活性。將初篩得到的菌株接入到PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4 d后，加入無菌蒸餾水將斜面上孢子洗下并經過適當稀釋制成孢子懸浮液（活菌數106CFU/mL）。以3%（V/V）的量將孢子懸浮液接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，測定酶活力，篩選出纖維素酶高產菌株。

1.3 羧甲基纖維素酶（CMCase）活力的測定及菌株產酶條件的優(yōu)化

1.3.1 CMCase活力的測定

培養(yǎng)5～7 d的復篩發(fā)酵液，經4℃，3 000 r/min離心15 min后得到粗酶液[21]。采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[22]，通過測經粗酶液反應后所得的葡萄糖含量來測菌株CMCase活性[23]。

按照上述條件，以國際單位為依據，定義1 min催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位（IU），其計算公式如式（1）所示[24]。

1.3.2 菌株產CMCase條件的優(yōu)化

分別對菌株1和菌株2進行產酶條件的優(yōu)化，優(yōu)化指標包括碳源、氮源、培養(yǎng)基起始pH、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間（如表1所示）。通過檢測菌株的CMCase活力確定菌株產酶的最佳條件。

表1 菌株的優(yōu)化條件

1.4 數據處理

各實驗重復3次，根據3次實驗所得數據計算平均值和標準誤差，利用EXCEL2003進行數據統(tǒng)計，用SPSS.17軟件進行方差分析。

1.5 菌株的初步鑒定

將菌株1和菌株2分別接種到察氏培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)2～3 d后，初步肉眼觀察菌落大小、形狀、顏色；然后利用水浸片法，取干凈載玻片，加無菌水一滴，用接種環(huán)挑取少量菌體放入無菌水中，蓋好蓋玻片，顯微鏡下觀察菌株的菌絲及孢子形態(tài)。根據真菌分類鑒定手冊對菌株進行初步鑒定[25]。

2 結果與討論

2.1 產纖維素酶菌株的篩選、初步鑒定和活性比較

由圖1可見，分離得到的菌株接種到CMC-Na固體培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d后，經剛果紅染色可以看到明顯、穩(wěn)定的透明圈，菌株1的菌落直徑（d1）是2.142 cm，透明圈直徑（D1）是4.598 cm，D1/d1是2.147；菌株2的菌落透明圈直徑（d2）是2.7 cm，透明圈直徑（D2）是2.774 cm，D2/d2是1.027。經液體發(fā)酵后，菌株1和菌株2的CMCase活力分別是0.214 IU/mL和0.188 IU/mL，其中菌株1比活力比菌株2的CMCase活力高出14.2%。此后菌株采用察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩種菌株的菌落質地呈絲絨狀，顏色呈黑褐色，后呈不同程度的黃色。菌株1的菌落具有輻射狀溝紋，菌株2菌落則表現平坦（如圖2所示）。在顯微鏡下進一步觀察菌落，兩種菌株頂囊呈球形，雙層小梗，小梗上長有成串褐黑色的球狀，分生孢子呈黑褐色球形，菌絲體發(fā)達，有隔（如圖3所示）。初步判定兩種菌株均為黑曲霉。

圖1 菌株的透明圈觀察

圖2 菌株在察氏培養(yǎng)基下菌落形態(tài)觀察

圖3 菌株的孢子形態(tài)觀察

2.2 目的菌株產CMCase條件的優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對菌株1和菌株2產CMCase活力的影響

為研究菌株的最佳碳源，分別利用葡萄糖、蔗糖、淀粉、濾紙和CMC-Na為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，對菌株的CMCase活力進行測定。由圖4可見，CMC-Na為唯一碳源時，菌株1和菌株2的CMCase活性最高，顯著高于其它碳源。當葡萄糖作為碳源培養(yǎng)菌株時，菌株CMCase分泌量比CMC-Na為唯一碳源時低，可能是以葡萄糖為碳源時引起了葡萄糖效應所致。蔗糖、淀粉和濾紙為碳源時，菌株的CMCase分泌量很少。因此，菌株1和菌株2的最佳碳源均為CMC-Na，其中菌株1的酶活力要比菌株2的酶活力高出14.2%。

圖4 菌株的最佳碳源

圖5 菌株的最佳氮源

2.2.2 不同氮源對菌株1和菌株2產CMCase活力的影響

為研究菌株的最佳氮源，分別利用蛋白胨、硫酸銨、酵母膏、硝酸銨和草酸為唯一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，對菌株的CMCase活力進行測定。由圖5可見，菌株1的最佳氮源順序依次是酵母膏、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨和草酸銨，測得菌株1的CMCase活力之比約是17∶8∶7∶1∶1。菌株2的最佳氮源順序依次是酵母膏、硫酸銨、草酸銨、蛋白胨和硝酸銨，測得菌株2的CMCase活力之比約是14∶12∶10∶10∶10。故菌株1和菌株2的最佳氮源均為酵母膏。酵母膏與其他氮源相比，既為菌株提供了氮源的同時，也為菌株提供了碳源和生長因子，所以菌株在以酵母膏為唯一氮源時長勢最好。兩種菌株利用酵母膏為氮源時，菌株2的酶活力要比菌株1的酶活力高出3.48%。

2.2.3 培養(yǎng)基起始pH對目的菌株產CMCase活力的影響

為研究菌株的最佳培養(yǎng)基起始pH，用醋酸鈉―醋酸緩沖液調節(jié)培養(yǎng)基的pH，制成pH分別為4、5、6、7和8的培養(yǎng)基后，對菌株的CMCase活力進行測定。由圖6可見，調節(jié)培養(yǎng)基的起始pH值至4時，菌株1和菌株2的CMCase活力分別是0.183 IU/mL和0.182 IU/mL。當pH值上升至7時，菌株1和菌株2的CMCase活力分別降低了27.6%和40.5%。當pH值上升至8時，菌株幾乎不分泌CMCase。由此可見兩種菌株的最適培養(yǎng)pH值均為4，該結果與Wen[26]和Latifian等[27]得出的產纖維素酶菌株培養(yǎng)基的最適起始pH值介于4.0～5.0一致。羧甲基纖維素鈉液體培養(yǎng)基呈酸性，菌株從該培養(yǎng)基中復篩得到，因而也適應酸性環(huán)境。

圖6 菌株的最佳培養(yǎng)pH值

圖7 菌株的最佳培養(yǎng)溫度

2.2.4 培養(yǎng)溫度對菌株I和菌株2產CMCase活力的影響

溫度設定為10、20、30、40和50℃對菌株的CMCase活力進行測定。由圖7可見，溫度從10℃上升至40℃時，兩株菌株的CMCase活力不斷提高，當溫度上升至50℃時，幾乎測不到兩種菌株的CMCase活力。表明菌株1和菌株2的最佳培養(yǎng)溫度均為40℃，此時菌株1的酶活力要比菌株2的酶活力高出8.97%。Sangrila等[28]的結果表明產纖維素酶菌株優(yōu)化后，菌株的最適溫度多集中在35～55℃。本文中菌株的最適溫度是40℃，處于最適溫度范圍。由于菌株是從夏日中午采集的土樣中進行篩選的，所以最適培養(yǎng)溫度稍高。

2.2.5 培養(yǎng)時間對菌株1和菌株2產CMCase活力的影響

由圖8可見，菌株產CMCase的活力均隨著培養(yǎng)時間的增加而增大，第7 d時達到最大，此時菌株1的酶活力是菌株2酶活力的1.70倍。

圖8 菌株1和菌株2的最佳培養(yǎng)時間

2.2.6 兩種目的菌株優(yōu)化后的CMCase活力

綜合以上各優(yōu)化條件，配制含1% CMC-Na和0.3%酵母膏，起始pH值為4的培養(yǎng)基，于40℃條件培養(yǎng)，優(yōu)化后的菌株1和菌株2的CMCase活力分別是0.504 IU/mL和0.277 IU/mL。優(yōu)化后菌株1和菌株2的CMCase活力分別是優(yōu)化前酶活力的2.35和1.47倍，優(yōu)化后菌株1的CMCase活力比菌株2高82.0%。表明菌株經過培養(yǎng)條件優(yōu)化后，產CMCase能力有很大幅度的提高，優(yōu)化后的菌株更有益于纖維素的降解。在該優(yōu)化培養(yǎng)基中，最佳碳源CMC-Na在提供碳源的同時也提供了Na元素易于菌株的生長，同時CMC-Na作為底物，在適當濃度下可以促進菌株的CMCase分泌。最佳氮源酵母膏與其它氮源相比除了提供氨基酸外，也提供了碳源及生長因子。本文中菌株能夠在以菌糠為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中生勢良好，原因可能在于菌糠中除了含粗纖維以外，還含有粗蛋白、粗纖維及其他Ca、Zn、Mg等微量元素[29-30]，而這些營養(yǎng)元素可以保證菌株正常生長，同時菌株分泌的纖維素酶可以降解菌糠中的粗纖維成分，使菌糠轉化成更易于動物消化和吸收的飼料，增加菌糠的利用率。

3 結論

利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基，采用剛果紅染色法，并進一步利用液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選得到黑曲霉2株。

菌株的最適產酶條件：液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方10 g/L CMC-Na，3 g/L 酵母膏，0.3 g/L MgSO4，0.3 g/L CaCl2，4 g/L KH2PO4，pH值4，培養(yǎng)溫度是40℃，發(fā)酵培養(yǎng)到第7 d時，菌株1和菌株2粗酶液的CMCase活力分別達到0.504 IU/mL和0.277 IU/mL。

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Isolation of Cellulase-Producting Strains and Optimization of Cellulase-Producting Conditions

ZHANG Li-ying1, WANG Han-han2, PAN Ting2, XING Cheng-hua3*, CAI Miao-zhen2
（1. College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China; 2. College of Geography and Environmental Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China; 3. Bioengineering Institute, Jinhua College of Vocation and Technology, Jinhua 321007, China）

Two cellulase-producting strains were isolated by sodium carboxymethyl cellulose medium and liquid fermentation from the rice cultivated soil. The colony morphologic, color and spore morphologic analysis suggested that the two strains were Aspergillus Niger. The premium CMCase activity and optimized cellulase-producting conditions were determined. Under the optimum condition of 1.0%CMC-Na and 0.3% yeast extract yeast extract, 4 in pH and 40℃ in temperature, the crude CMCase activities reached the maximum at 0.504 IU/mL and 0.277 IU/mL.

cellulase-produting strains; screening; CMCase; enzyme activity

Q93.331

A

1004-8405(2015)02-0001-07

2015-03-02

浙江省公益性技術應用研究計劃項目（2013C32047）；金華市科技計劃項目（2011-2-005）。

張麗影（1990～），女，碩士研究生；研究方向：環(huán)境修復與逆境植物生理。1138625296@qq.com

* 通訊作者：邢承華（1976～），男，博士，教授；研究方向：植物營養(yǎng)、植物生態(tài)。xingchenghua@ hotmail.com