邱洋洋，童國林*

耐熱性木聚糖酶預(yù)處理麥草原料及麥草漿的比較研究

邱洋洋，童國林*

（南京林業(yè)大學 江蘇省制漿造紙科學與技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210037）

研究了耐熱性木聚糖酶預(yù)處理麥草原料的工藝，并對酶處理麥草原料與堿法麥草漿酶處理的效果進行對比。結(jié)果表明：麥草木聚糖酶預(yù)處理適宜條件為酶用量40 IU/g、液比1∶9、pH值7.2、時間4 h、溫度95℃。該木聚糖酶能夠在中性及相對較高溫環(huán)境下具有較好的酶學穩(wěn)定性。對比麥草原料及漿料的木聚糖酶預(yù)處理效果表明：麥草原料經(jīng)木聚糖酶處理后酶解液中還原糖含量為1.14%，而麥草漿酶處理后酶解液的還原糖含量為1.23%；經(jīng)堿抽提后麥草原料還原糖溶解量增加了0.39%，而漿料則增加1.25%。說明木聚糖酶對麥草漿降解半纖維素作用明顯優(yōu)于對麥草原料的作用，且堿抽提提高了酶處理的效果。

耐熱性木聚糖酶；麥草；麥草漿；預(yù)處理；還原糖

我國造紙工業(yè)發(fā)展所面臨的主要問題是原料供求矛盾突出和節(jié)能減排任務(wù)艱巨。造紙工業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃指出要以科學合理利用非木材資源，實施清潔生產(chǎn)新工藝為出發(fā)點，進而提高產(chǎn)業(yè)節(jié)能減排和綜合利用水平，提高非木纖維制漿造紙質(zhì)量，以緩解國內(nèi)纖維資源供需矛盾和對進口木材纖維和廢紙的依賴程度，達到優(yōu)化造紙原料結(jié)構(gòu)的目的[1]。國家明確提出要用生物技術(shù)改造傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，“十二五”期間，撥出專項資金支持在制漿造紙領(lǐng)域應(yīng)用生物技術(shù)[2]，因此本文就耐熱性木聚糖酶預(yù)處理麥草秸稈原料和麥草漿進行研究，為耐熱型木聚糖酶應(yīng)用于麥草秸稈等非木材纖維原料制漿提供理論支持。

木聚糖酶是常被用于進行漿料處理的半纖維素酶，是由D-木糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的主鏈和由種類各異的糖基側(cè)鏈組成的側(cè)鏈構(gòu)成[3]。其中以內(nèi)切-1,4-β-D木聚糖酶為主，是對木聚糖降解起關(guān)鍵作用的木聚糖降解酶[4]。目前絕大多數(shù)商用木聚糖酶來源于霉菌，其有酶產(chǎn)量相對較高的優(yōu)點，但同時存在發(fā)酵周期長、作用條件偏中性等缺點，在造紙、飼料和食品等工業(yè)的極端環(huán)境下應(yīng)用受到一定限制[5]。經(jīng)過近年來的不斷研究，科研工作者發(fā)現(xiàn)了一些可以在耐極端條件下發(fā)揮作用的細菌木聚糖酶，具有較好的開發(fā)前景[6]。已報道的用于生產(chǎn)木聚糖酶的細菌以芽孢桿菌居多。Anand A等[7]研究了從印度高溫堆肥中篩選出的一株嗜熱脫氮芽孢桿菌所產(chǎn)的木聚糖酶，其作用的最適溫度為70℃。鄭宏臣等[8]分析了從造紙廠周邊土壤中分離純化出來的一株產(chǎn)堿性木聚糖酶的短小芽孢桿菌所產(chǎn)的木聚糖酶，其最適反應(yīng)pH值可達8.0，最適反應(yīng)溫度為55℃；陳學敏等[9]在云南騰沖熱泉中分離得到產(chǎn)木聚糖酶的菌株，經(jīng)鑒定為地芽孢桿菌，研究發(fā)現(xiàn)其所產(chǎn)木聚糖酶的最適pH值和最適溫度分別為7.0和70℃；梁方方等[10]在堆放青貯飼料的土壤中分離出一株枯草芽孢桿菌X7，在對其所產(chǎn)出的酶進行研究后發(fā)現(xiàn)該酶最適pH值和溫度分別為6.0和50℃。

本文選用的耐熱耐堿木聚糖酶，來源于極端嗜熱菌海棲熱胞菌（Thermotoga maritime），通過海棲熱胞菌的XynB基因克隆到熱激表達載體pHsh中，得到了耐熱性木聚糖酶[11]。對該木聚糖酶用于麥草預(yù)處理工藝條件進行優(yōu)選，并就麥草原料及麥草漿料在相同處理條件下處理效果進行比較，從而為其后續(xù)開發(fā)應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 原料

麥草由甘肅某造紙廠提供，實驗室條件下進行篩選，切片后水洗，風干儲存平衡水分后測水分。

自制麥草漿：麥草在YYG3-10-1.25油浴蒸煮器內(nèi)采用燒堿-AQ蒸煮工藝制得麥草漿，卡伯值14.7。

1.1.2 木聚糖酶

耐熱性木聚糖酶（pHsh-XynB）的酶活為3 000 IU/mL，由南京師范大學生命科學院微生物實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 耐熱性木聚糖酶酶活的測定方法

耐熱性木聚糖酶活性的測定[12]，以0.5%樺樹木聚糖作為底物，利用對羥基苯甲酸酰肼與還原糖的顯色反應(yīng)進行比色，具體方法：在90 μL（25 mM pH 6.3）的磷酸鈉緩沖液中加0.1 mL 1%樺樹木聚糖，然后添加10 μL稀釋的酶液于95℃下反應(yīng)10 min，最后加入600 μL終止劑/顯色劑PAHBAH（配方為：0.5 M NaOH 和溶于0.5 M HCl的5% PAHBAH體積比4∶1混合）終止反應(yīng)。其混合物在沸水浴中加熱10 min后，立即在冰水浴中冷卻，使用分光光度計，在410 nm下測其吸收值。木聚糖酶1個活性單位定義為每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol木糖的酶量。

1.2.2 麥草及漿料的酶處理

將清洗風干后原料、25 mM檸檬酸鈉緩沖液（pH值分別為5.2、5.7、6.2、6.7、7.2、7.7和8.2）、酶液在聚乙烯塑料袋中充分混合后，置于恒溫水浴鍋中加熱，每隔20 min揉搓一次，使原料與酶液充分混合，反應(yīng)到規(guī)定時間取出。用布袋將酶解液分離出來用于分析，所得原料用水洗干凈，存放在塑料袋中平衡水分，測水分后用于后續(xù)的處理及檢測。對照樣處理條件與酶處理條件相同，但不加酶處理[13]。

1.2.3 麥草原料的堿處理

麥草在經(jīng)過酶處理洗干凈后置于聚乙烯塑料袋中，用氫氧化鈉對麥草進行抽提處理。處理條件：液比1∶10，時間1 h，溫度70℃，堿用量2%[14]。

1.2.4 處理液還原糖的測定

酶解液的還原糖采用DNS方法測定[15]。

1.2.5 處理液吸光度的測定

木質(zhì)素在280 nm附近具有吸收峰。吸光度可作為一個相對量，間接反映木質(zhì)素溶出情況。在酶解液中滴入幾滴CCl3COOH，然后調(diào)節(jié)pH值到9.0，離心后取上層清液，稀釋到一定倍數(shù)，在UV-751型分光光度計280 nm處測定吸光度。吸光度值可間接反映木質(zhì)素溶出量[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐熱性木聚糖酶預(yù)處理工藝條件的選擇

在對麥草進行酶預(yù)處理時，必須在其最優(yōu)條件下進行處理。木聚糖酶是具有生物活性的大分子，在不同環(huán)境下，所表現(xiàn)出來的效果有所差異。預(yù)處理的過程中需綜合考慮酶用量、液比、pH值、處理時間以及處理溫度對木聚糖酶預(yù)處理麥草過程中的影響。在耐熱性木聚糖酶預(yù)處理麥草原料研究中，以測定處理液中還原糖的含量、木質(zhì)素含量和處理后稻草的得率來評價預(yù)處理效果。

2.1.1 木聚糖酶用量對麥草預(yù)處理的影響

酶用量對酶處理效果是個關(guān)鍵因素，酶用量越高，則溶出還原糖越多，木質(zhì)素溶出量也越多，得率越低。如圖 1 所示，隨著酶用量不斷的增加，溶出的還原糖含量和吸光值也逐漸增大，酶處理后麥草得率隨酶用量不斷增加而減小，在酶用量為60 IU/g時，得率有小幅上升，這可能與溶出的還原糖“回吸”有關(guān)[15]。在酶用量為40 IU/g時還原糖的含量升到較大值1.07%，木質(zhì)素的吸光值為0.497，得率為90.35%。當酶用量為60 IU/g時還原糖含量和木質(zhì)素吸光值都較大，而此時麥草得率卻下降較多。綜合考慮酶的生產(chǎn)成本，酶用量為40 IU/g時較為合適酶用量。

2.1.2 液比對木聚糖酶預(yù)處理的影響

由于酶處理液濃度影響酶反應(yīng)速度，預(yù)處理液中酶的濃度則是由液比大小決定。液比越大，酶處理液濃度越小，酶的反應(yīng)速度相對較慢；液比小，則酶處理液濃度大，但又不能使酶處理液與麥草充分均勻混合。因此，選擇合適的液比就顯得十分重要，既能保證一定的酶處理液濃度，又能使酶處理液與麥草充分均勻的混合，結(jié)果如圖2所示。由圖 2 可以知，隨著液比逐漸增大，酶解液中還原糖含量先上升后下降，吸光值也是呈現(xiàn)出相同的趨勢，酶處理后麥草得率變化趨勢同還原糖以及吸光值變化趨勢相似，液比為1∶9時得率在90%左右，還原糖含量為1.07%，吸光值為0.639。

圖2 液比對木聚糖酶預(yù)處理的影響

2.1.3 pH值對木聚糖酶預(yù)處理的影響

酶的活性會受到其所處反應(yīng)環(huán)境的影響，pH過高或者過低都會影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象，甚至使酶不能正常發(fā)揮功能，木聚糖酶反應(yīng)的pH值對麥草木聚糖酶預(yù)處理效果有很大的影響。針對本文所用木聚糖酶酶活特性，pH 值在5.2～8.2范圍進行優(yōu)化實驗，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著pH值不斷增大，處理液中還原糖含量和吸光值均先增加后下降，得率隨著pH值增大而先減小后上升。反映出緩沖液的酸堿強度大小對酶的活性有較大的影響。當pH為7.2時，還原糖含量為1.15%，吸光值為0.711。此時吸光值較大，表明隨木聚糖溶出木質(zhì)素量較大。雖然此時還原糖含量不是最大，但考慮到脫木質(zhì)素的能力及處理后得率，綜上各個因素，pH值在7.2左右接近中性范圍，較為合適。

圖3 pH值對木聚糖酶預(yù)處理的影響

2.1.4 時間對木聚糖酶預(yù)處理的影響

該木聚糖酶具有較好的穩(wěn)定性，在95℃下半衰期為2 h，但不同底物對酶的性質(zhì)有不同影響，因此木聚糖酶預(yù)處理的時間也十分重要。由圖4可以看出，隨著反應(yīng)時間由3 h延長至4 h還原糖含量和吸光值均隨之增加，反應(yīng)時間由4 h延長至6 h吸光值變化較小，此時還原糖含量變化也不大，說明酶解反應(yīng)在前4 h相對較快，隨著時間增加對預(yù)處理的影響越來越小。從圖中可知，隨著時間的推移，還原糖含量又有所增加，可能原因是原料表面木聚糖溶出而形成空隙增加，從而為原料內(nèi)部木聚糖的溶出創(chuàng)造條件。因此酶處理的反應(yīng)時間選擇4 h。

圖4 時間對木聚糖酶預(yù)處理的影響

2.1.5 溫度對木聚糖酶預(yù)處理的影響

木聚糖酶在不同的溫度條件下，其反應(yīng)速率不同，溫度對酶的影響主要有兩方面，一方面是當溫度升高時，酶的反映速率加快；另一方面，隨著溫度的升高，酶的穩(wěn)定性逐漸降低，反應(yīng)時間逐漸縮短，反應(yīng)效果降低。酶促反應(yīng)的最適溫度是這兩種過程平衡的結(jié)果。針對所選用的木聚糖酶對溫度具有較高的適應(yīng)能力及較寬的適應(yīng)范圍，選擇在80～100℃范圍進行優(yōu)化。

圖5 溫度對木聚糖酶預(yù)處理的影響

由圖5可知，隨著溫度的增大，還原糖含量和吸光值均先增大后逐漸減小。還原糖含量在90℃時達到最大值1.16%，然后不斷減小，而吸光值在95℃達到最大值0.710，此時還原糖含量為1.15%。溫度在高于95℃后，酶蛋白的活性開始降低，還原糖含量開始下降。因此，溫度選擇95℃。

綜合以上對木聚糖酶預(yù)處理麥草的研究，木聚糖酶預(yù)處理麥草原料適宜工藝條件為：酶用量40 IU/g，液比：1∶9，pH值7.2，溫度95℃，處理時間4 h。

2.2 耐熱性木聚糖酶處理麥草原料與麥草漿效果的比較

2.2.1 麥草原料及麥草漿木聚糖酶處理效果的對比

在酶處理麥草原料過程中，由于麥草表面含有一層致密層，使得進行酶處理的過程酶與半纖維素接觸相對困難，而麥草經(jīng)蒸煮后，可以消除其影響，為探索酶處理麥草與麥草漿的效果差異，比較兩者作用效果，以酶解液中還原糖含量和木質(zhì)素含量來表示，結(jié)果如表1所示。由表1結(jié)果可知，麥草和麥草漿經(jīng)過木聚糖酶處理后均有降解半纖維素和脫除木質(zhì)素的作用。麥草原料在經(jīng)木聚糖酶處理后酶解液中的原糖含量為1.14%，相對應(yīng)麥草漿酶處理的還原糖含量為1.23%，反映出木聚糖酶對麥草漿降解半纖維素作用明顯優(yōu)于對麥草原料的作用，這是因為漿料的比表面積比麥草原料的比表面積大，木聚糖酶在漿料上的吸附性比原料的吸附性好，酶與木聚糖作用的可及度存在明顯差異。麥草酶解液中木質(zhì)素含量為0.35 g/L，而麥草漿酶解液中木質(zhì)素含量為0.10 g/L，在蒸煮過程中已有大量的木質(zhì)素溶出，原料中木質(zhì)素含量要遠遠大于漿料中木質(zhì)素含量。

表1 麥草和麥草漿酶處理液的分析

2.2.2 木聚糖酶處理麥草及麥草漿后堿抽提效果的對比

對經(jīng)過酶處理的麥草和漿料進行堿抽提，堿抽提時用堿量為2%，通過對比有酶處理和無酶處理原料和漿料堿抽提后的效果如表2所示。

表2 麥草和麥草漿酶處理后堿抽提效果的比較

麥草的酶解液中還原糖含量由堿抽提的0.97%增加到酶處理后堿抽提的1.36%。而漿料則由0.08%增加到1.33%。麥草堿抽提后的木質(zhì)素含量由0.56 g/L增加到0.70 g/L，漿料經(jīng)過堿抽提的木質(zhì)素含量也從0.17 g/L增加到0.25 g/L。不論麥草還是麥草漿，經(jīng)過酶處理比沒經(jīng)過酶處理的堿抽提效果更好。

3 結(jié)論

1）通過對木聚糖酶預(yù)處理麥草的研究，木聚糖酶預(yù)處理最適條件：酶用量40 IU/g、液比1∶9、pH值7.2、時間4 h、溫度95℃。且該木聚糖酶能在偏中性及高溫的環(huán)境下具有較好的酶學穩(wěn)定性，可適應(yīng)于預(yù)處理階段較高溫環(huán)境。

2）在此處理條件下，麥草原料和麥草漿的酶處理效果顯示：麥草漿中木聚糖在木聚糖酶處理下更容易溶出，具有更好的反應(yīng)性能。麥草原料由于其表面結(jié)構(gòu)影響反應(yīng)性能相對較差。酶處理后進行適當?shù)膲A處理可以提高木質(zhì)素和木聚糖的溶出效果。

[1] 發(fā)改委, 工信部. 造紙工業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃[J]. 造紙信息, 2012, 27(2): 6-19.

[2] 中國輕工業(yè)網(wǎng). 生物技術(shù)改造傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè), 鑄造綠色紙業(yè)[J]. 紙和造紙, 2012, 31(2): 81-82.

[3] 丁長河. 鏈霉菌高產(chǎn)木聚糖酶及其酶學性質(zhì)的研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學博士論文, 2003.

[4] Beg Q K, Kapoor M, Mahajan L, et al. Microbial xylanases and their industrial applications: A review[J]. Appl Microbial Biot, 2001, 56 (3-4): 326-338.

[5] Sunna A, Antranihian G. Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 1997, 17(1): 39-67.

[6] Zheng H C, Liu X G, Liu X, et al. Isolation, purification and characterization of a thermostable xylanase from a novel strain Paenibacillus campinasensis G1-1[J]. J Microbiol Biotechnol., 2012, 22(7): 930-938.

[7] Anand A, Kumar V, Satyanarayana T. Characteristics of thermostable endoxylanase and β-xylosidase of the extremely thermophilic bacterium Geobacillus thermodenitrificans TSAA1 and its applicability in generating xylooligosaccharides and xylose from agroresidues[J]. Extremophiles, 2013, 17(3): 357-366.

[8] 鄭宏臣, 劉逸寒, 劉曉光, 等. 堿性木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選、XynG1-3 基因克隆表達及酶學性質(zhì)研究[J]. 生物技術(shù)通報, 2012(10): 106-113.

[9] 陳學敏, 劉培培, 張波. 一株產(chǎn)木聚糖酶嗜熱菌的鑒定及酶學性質(zhì)[J]. 微生物學通報, 2011, 38(2): 151-156.

[10] 梁方方, 莫毅, 楊琳, 等. 木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及酶學性質(zhì)研究[J]. 飼料研究, 2011(3): 45-47.

[11] 劉思園, 邵蔚藍, 裴建軍, 等. 系列木聚糖降解酶基因同向串連表達的研究[J]. 南京師大學報/自然科學版, 2006(1): 93-97.

[12] Lever M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates[J]. Analytical Biochemistry, 1972, 47(1): 273- 279.

[13] 劉超綱, 勇強, 周慶慶, 等. 里氏木霉選擇性合成木聚糖酶的研究(Ⅰ)[J]. 林產(chǎn)化學與工業(yè), 1999, 19(2): 8-12.

[14] 羅清, 趙登, 張安龍, 等. 堿-酶預(yù)處理麥草工藝及其對成漿性能的影響[J]. 中國造紙, 2013, 32(9): 71-74.

[15] 陳毓荃. 生物化學實驗方法和技術(shù)[M]. 北京: 科學出版社, 2002: 97.

[16] 尤紀雪, 陶文娟, 馮建良, 等. 漆酶與木聚糖酶預(yù)處理對稻草蒸煮性能的影響[J]. 纖維素科學與技術(shù), 2005, 13(4): 1-6.

Comparison of Wheat Straw and Straw Pulp with Thermostable Xylanase Preteatments

QIU Yang-yang, TONG Guo-lin*
（Nanjing Forestry University, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Pulp and Papermaking Science, Nanjing 210037, China）

It was investigated that thermostable xylanase was used for the pretreatment if the raw material of wheat straw, and compared with treatment of wheat straw pulp. It was found that the suitable pretreatment condition of thermostable xylanase process was as following, the xylanase charge was 40 IU/g, liquor ratio was 1∶9, pH was 7.2, reaction time was 4h and temperature was 95℃ respectively. The result was shown that thermostable xylanase was very stable under neutral and high temperature conditions. Morever under the pretreatment condition, the thermostable xylanase could give good pretreatment ability as compared with wheat straw pulp, and helped to improve the effect of alkali extraction after pretreatment.

thermostable xylanase; wheat straw; wheat straw pulp; pretreatment; reducing sugar

TS74

A

1004-8405(2015)02-0027-07

2015-01-27

基金課題：江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目。

邱洋洋（1987～），男，碩士研究生；研究方向：制漿化學及生物制漿技術(shù)。

* 通訊作者：童國林，教授，博士生導(dǎo)師；研究方向：制漿化學、廢紙再生、纖維素改性等。gtong@njfu.edu.cn