·論著·

異種凍干骨及與富血小板纖維蛋白的復(fù)合物修復(fù)鈦螺紋釘周骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

賈瑩珍，劉志芳，李冰婷，李冬雪，侯曉薇*

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050051)

[摘要]目的通過將異種凍干骨及其與富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)的復(fù)合物分別植入兔下頜骨骨缺損，即刻植入鈦螺紋釘?shù)膶?shí)驗(yàn)研究，探討異種凍干骨及其與PRF的復(fù)合物對鈦螺紋釘周圍骨缺損區(qū)修復(fù)的作用。方法12只新西蘭大耳白兔，于下頜骨造極限骨缺損，并緊貼骨缺損近中及遠(yuǎn)中邊緣各植入鈦螺紋釘；右側(cè)缺損區(qū)植入異種凍干骨與PRF的復(fù)合物為實(shí)驗(yàn)組，左側(cè)缺損區(qū)植入異種凍干骨作對照組；2組于術(shù)后4、8、12周處死后常規(guī)取材，行大體觀察、X線觀察、骨密度分析、組織學(xué)觀察。結(jié)果術(shù)后4、8、12周實(shí)驗(yàn)組鈦螺紋釘骨缺損新生骨灰度值比對照組大(P<0.05)。組織學(xué)觀察顯示，實(shí)驗(yàn)組骨成熟程度均高于對照組。結(jié)論異種凍干骨可以作為一種骨替代材料修復(fù)鈦螺紋釘周圍骨缺損，與PRF聯(lián)合應(yīng)用后，在修復(fù)骨缺損中顯示出了更好的成骨作用。

[關(guān)鍵詞]牙種植；纖維蛋白；動物實(shí)驗(yàn)doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.10.016

[收稿日期]2014-10-15；[修回日期]2014-11-30

[基金項(xiàng)目]2011年度留學(xué)人員科技活動資助項(xiàng)目

[作者簡介]賈瑩珍(1987-)，女，河北臨漳人，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事口腔修復(fù)學(xué)研究。

通訊作者*

[中圖分類號]R783.4[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

Experimental study on repairing of bone defect around titanium screw by heterogeneous

freeze-dried bone and platelet-rich fibrin compound

JIA Ying-zhen,LIU Zhi-fang,LI Bing-ting,LI Dong-xue,HOU Xiao-wei*

(Department of Stomatology,the Third Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050051,China)

Abstract[] ObjectiveTo discuss the effect of heterogeneous freeze-dried bone and its platelet-rich fibrin(PRF) compound in the repair of the bone defect around titanium screw.MethodsTwelve New Zealand white rabbits received surgery as follow steps:a critical bone defect was made at the buccal side of the mandible,and the titanium screws were implanted into the bone defect near mesial and distal edge of the alveolar.In all experimental rabbits,the right side of the mandible served as the experimental group(placed heterogeneous freeze-dried bone with PRF) and the left side as the control group(placed heterogeneous freeze-dried bone).All the rabbits of experimental group and the control group were killed separately on 4th,8th and 12th week after implanting.Then,the gross observation,X-rays,BMD analysis and histopathology were followed.ResultsAfter operation for 4,8,12 weeks,gray values of the new bone in experimental group were higher than those of control group(P<0.05).Histopathology observation showed the bone maturity in experimental group was higher than in control group.ConclusionHeterogeneous freeze-dried bone as a bone substitute materials can repair bone defects around titanium screw;PRF in its compound with heterogeneous freeze-dried bone plays a positive role in osteogenesis.

[Key words]dental implantaion;fibrin;animal experimentation

越來越多的患者選擇以種植的方法修復(fù)自己的缺失牙，然而種植區(qū)骨缺損、骨量不足制約了種植的適用范圍。骨缺損、骨量不足可行植骨種植[1]，尋找一種既安全又具有良好成骨能力的材料，對骨缺損修復(fù)至關(guān)重要[2]。異種骨具有良好的塑形性，恢復(fù)牙槽嵴高度效果好，且異種骨來源廣、易處理和保存。但是為消除異種骨免疫活性，使用前必須經(jīng)過抗原性處理，如此一來可破壞其成骨相關(guān)生長因子，使其骨誘導(dǎo)性大大降低。富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)是自體血小板濃縮制品，具有促進(jìn)成骨和炎癥調(diào)節(jié)的作用[3]。將骨替代材料與具有促進(jìn)骨形成作用的生長因子復(fù)合物修復(fù)種植周圍骨缺損是目前的研究熱點(diǎn)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物健康成年新西蘭大耳白兔12只(河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供),體質(zhì)量2.5～3.0 kg，雌雄不限,按常規(guī)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)2周。

1.2PRF的制備自兔耳中心動脈緩慢抽取5 mL動脈血，立即置于無抗凝劑的離心管中。將離心管放入離心機(jī)中(轉(zhuǎn)速3 000 r/min)，離心10 min，靜置備用。離心后離心管內(nèi)血液由上至下分為3層：上層無細(xì)胞血漿，中間層PRF凝膠(白色半透明狀)，下層紅細(xì)胞層。取出PRF凝膠層。然后用2層紗布輕柔擠出 PRF 中血清，PRF 凝膠變成堅(jiān)韌的膜狀。

1.3實(shí)驗(yàn)操作及分組將兔按3 mL/kg 5%水合氯醛全身麻醉后，在兔頰側(cè)皮膚沿下頜骨上緣走向作出一長約15 mm的切口，鈍性分離其下肌層、骨膜，充分暴露其無牙區(qū)牙槽骨上緣和頰側(cè)，下頜骨頰側(cè)造約5 mm×4 mm×3 mm的骨缺損，緊貼骨缺損近中及遠(yuǎn)中邊緣牙槽骨各制備 1個(gè)種植窩并植入1.5 mm×3.5 mm 鈦螺紋釘，形成有一壁骨缺損的種植體模型，右側(cè)下頜骨缺損區(qū)植入異種凍干骨復(fù)合PRF為實(shí)驗(yàn)組，左側(cè)下頜骨缺損區(qū)植入異種凍干骨為對照組。嚴(yán)密縫合黏骨膜瓣、肌層、皮膚，分籠飼養(yǎng)。術(shù)后肌內(nèi)注射慶大霉素40萬U/d，連續(xù)3 d。

1.4取材與觀察方法分別于術(shù)后4、8、12周隨機(jī)處死4只兔(4只為一組)，共3組，取下頜骨，行大體、X線片觀察及骨密度分析，選取下頜骨骨缺損區(qū)組織于10%福爾馬林液中固定，脫鈣，包埋，切片后固定于載玻片上，脫蠟脫水后HE染色，光鏡下觀察。

2結(jié)果

2.1大體觀察各期鈦螺紋釘均穩(wěn)固無松動脫落，與骨組織間未見纖維軟組織。4、8、12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組新生骨均比對照組飽滿且質(zhì)硬。

2.2X線觀察4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對照組的鈦螺紋釘骨界面可見明顯的透射影像。實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)骨密度較周圍骨組織低，新生骨與周圍骨界限清楚(圖1A)；對照組低密度影大于實(shí)驗(yàn)組，新生骨與周圍骨界限清楚(圖1B)。8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對照組的骨缺損區(qū)的低密度影均減小，實(shí)驗(yàn)組骨密度與周圍骨組織接近一致，鈦螺紋釘骨界面未見明顯透射影像(圖1C)；對照組新生骨與周圍骨界限仍較清晰，鈦螺紋釘骨界面可見透射影像(圖1D)。12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對照組鈦螺紋釘骨界面未見明顯透射影像。實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)新生骨骨密度與周圍骨組織密度一致，不能明顯發(fā)現(xiàn)二者之間界限(圖1E)；對照組的骨密度仍低于周圍正常骨組織(圖1F)。

2.3骨密度分析不管是骨缺損遠(yuǎn)中區(qū)還是近中區(qū)，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4、8和12周的骨密度灰度值均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)，見表1。

表12組不同治療時(shí)間點(diǎn)骨缺損近中及遠(yuǎn)中新生骨灰度值比較

Table 1X-ray gray value of new bone around mesial titanium screw nail and distal

titanium screw nail at different treatment time between two groups

組別骨缺損遠(yuǎn)中區(qū)4周8周12周骨缺損近中區(qū)4周8周12周實(shí)驗(yàn)組53.00±2.5873.00±3.6588.50±3.7051.75±3.5075.50±2.5290.00±5.72對照組40.50±4.5163.75±4.1174.25±2.2237.50±4.9364.25±1.7176.50±2.38t6.18612.3338.6264.10323.54.653P0.0090.0010.0030.0260.0000.019

2.4組織學(xué)觀察4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組下頜骨骨缺損區(qū)可見活躍的成骨細(xì)胞，骨缺損邊緣見少量新生骨并向骨缺損中心延伸，大量骨細(xì)胞在新形成的骨基質(zhì)中構(gòu)成骨陷窩，可見增生的毛細(xì)血管(圖2A)；對照組下頜骨骨缺損區(qū)成骨細(xì)胞相對實(shí)驗(yàn)組數(shù)量較少，可見大量纖維結(jié)締組織，較實(shí)驗(yàn)組疏松(圖2B)。8 周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組下頜骨骨缺損區(qū)可見豐富的新生血管，新生骨組織更加成熟，骨小梁粗大致密排列規(guī)則、鈣化程度高，能看見板層結(jié)構(gòu)且較致密(圖2C)；對照組下頜骨骨缺損區(qū)可見較多成骨細(xì)胞，纖維結(jié)締組織下有新骨形成，但骨小梁排列不如實(shí)驗(yàn)組規(guī)則、鈣化程度也沒有實(shí)驗(yàn)組高(圖2D)。12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組下頜骨骨缺損區(qū)新生骨組織改建基本完成，可見成熟的骨小梁和板狀新生骨(圖2E)；對照組下頜骨骨缺損區(qū)成骨還在進(jìn)行，能看見板層結(jié)構(gòu)，骨小梁彼此連接但鈣化程度依舊不如實(shí)驗(yàn)組高(圖2F)。

3討論

3.1實(shí)驗(yàn)性骨缺損動物模型的建立建立合適的動物模型在實(shí)驗(yàn)性研究中是重要一環(huán)。骨缺損實(shí)驗(yàn)研究中將不能自然愈合的最小缺損稱之為極限缺損，鄂玲玲等[4]發(fā)現(xiàn)在兔下頜骨至少可作一10 mm×4 mm×3 mm牙槽骨缺損區(qū)。本實(shí)驗(yàn)研究在兔兩側(cè)下頜骨的無牙區(qū)制備5 mm×4 mm×3 mm的缺損符合極限缺損要求，避免了兔頜骨自身愈合因素的影響，且骨缺損近遠(yuǎn)中均有足夠的空間植入鈦螺紋釘，可增加樣本數(shù)量。本研究通過制備頜骨極限缺損，并即刻植入鈦螺紋釘，形成有一壁骨缺損的種植體模型，同期將異種凍干骨及其與PRF的復(fù)合物分別植入兔下頜骨骨缺損，以探討異種凍干骨及其與PRF的復(fù)合物對鈦螺紋釘周圍骨缺損區(qū)修復(fù)的作用。

3.2異種凍干骨作為骨替代材料骨替代材料主要有自體骨、同種異體骨、異種骨和人工合成骨等，它們作為骨替代材料各有利弊。異種骨具有良好塑形性，恢復(fù)牙槽嵴高度效果好，且來源廣、易處理和保存，只要能很好地去除其抗原性，有很大的應(yīng)用價(jià)值。異種骨具有骨引導(dǎo)性，是一種很好的骨支架材料，可以支持細(xì)胞生長誘導(dǎo)細(xì)胞分化[5]。然而異種骨與受體間是存在種屬間差異的，為消除其免疫活性，使用前必須經(jīng)過抗原性處理，如此一來可破壞其成骨相關(guān)生長因子，使其骨誘導(dǎo)性大大降低。因此，骨缺損的修復(fù)重建除了要有能夠?yàn)檠荛L入和新骨形成提供支架作用的異種凍干骨，還需要具有明顯的骨誘導(dǎo)性的生長因子。將骨替代材料與具有促進(jìn)骨形成作用的生長因子復(fù)合物修復(fù)種植周圍骨缺損已是目前的研究熱點(diǎn)。

3.3富血小板纖維蛋白促進(jìn)骨缺損修復(fù)的機(jī)制PRF是法國科學(xué)家Choukroun等[3]研制出的一種自體血制品，被譽(yù)為新一代血小板濃縮物,具有促進(jìn)成骨和炎癥調(diào)節(jié)的作用。PRF的制備法簡單，容易獲取，成本較低且其纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能延長生長因子的作用時(shí)間，含有大量的白細(xì)胞對感染創(chuàng)口有益[6]。PRF中與成骨相關(guān)的生長因子主要包括轉(zhuǎn)化生長因子、血小板衍生因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和基質(zhì)糖蛋白(血小板反應(yīng)素1)[7]，這些生長因子可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞遷移、增殖、分化，促進(jìn)骨愈合[8]。使用PRF血小板凝膠改善骨的再生已成為種植、牙周手術(shù)近年來采用較多的技術(shù)[9]。然而，PRP在臨床上很少單獨(dú)使用，一般需與骨粉等混合應(yīng)用[10]。

本實(shí)驗(yàn)研究中，大體觀察實(shí)驗(yàn)組中缺損區(qū)表面新生骨更為飽滿；在相同的時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后4周、8周或12周)，實(shí)驗(yàn)組鈦螺紋釘骨缺損側(cè)新生骨灰度值比對照組大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組骨成熟程度均高于對照組。表明凍干骨在骨缺損修復(fù)過程中具有較好的骨引導(dǎo)性，作為載體，與PRF聯(lián)合應(yīng)用效果更好，PRF有促進(jìn)骨形成、加快組織愈合的作用[11-12]。

綜上所述，異種凍干骨可以作為一種骨替代材料修復(fù)鈦螺紋釘周圍骨缺損，與PRF聯(lián)合應(yīng)用在修復(fù)骨缺損中有更顯著的促進(jìn)成骨作用，從而為異種凍干骨及其PRF復(fù)合物的臨床應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。(本文圖見封三)

[參考文獻(xiàn)]

[1]栗興超,董福生，石培凱,等.一段式種植修復(fù)前牙即刻負(fù)重的臨床回顧性研究[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,29(3):380-383.

[2]何通文,師愛萍,葛振林.富血小板纖維蛋白應(yīng)用于骨缺損修復(fù)的基礎(chǔ)及臨床研究進(jìn)展[J].中華創(chuàng)傷雜志，2013,29(12):1243-1246.

[3]Choukroun J,Diss A,Simonpieri A,et al.Platelet-rich fibrin(PRF):a second-generation platelet concentrate.Part Ⅳ:clinical effects on tissue healing[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006,101(3):e56-60.

[4]鄂玲玲，王東勝，師占平,等.一種新型的兔牙槽骨缺損模型的建立[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2011,9(3):137-140.

[5]劉日富,陶樹清.干細(xì)胞移植結(jié)合支架材料治療骨質(zhì)疏松[J].臨床薈萃，2014,29(1):96-100.

[6]朱淑倩,吳碧蓮.PRF在口腔種植中的應(yīng)用研究[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2013,26(6):724-726.

[7]徐燕，葉眉，陳芳，等.富血小板血漿的三次離心法制備及其對脂肪干細(xì)胞增殖、成骨礦化的影響[J].國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，38(1):14-18.

[8]董凱,柳忠豪,張曉潔.富血小板纖維蛋白提取液對成骨細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2013,29(4):472-476.

[9]裴延平,林松杉.富血小板纖維蛋白的臨床應(yīng)用[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(7):441-443.

[10]鄭友麗,張國志.富血小板纖維蛋白在口腔醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J/CD].中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志：電子版,2013,7(2):161-163.

[11]Simonpieri A，Choukroun J，Del Corso M，et al.Simultaneous sinus-lift and implantation using microthreaded implants and leukocyte-and platelet-rich fibrin assole grafting material：a six-year experience[J].Implant Dent,2011,20(1):2-12.

[12]Kim BJ，Kwan TK，Baek HS，et al.A comparative study of the effectiveness of sinus bone grafting with recombinant human bone morphogenetic protein 2-coated tricalcium phosphate and platelet-rich fibrin-mixed tricalcium phosphate in Rabbits[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol,2012,113(5):583-592.

(本文編輯：劉斯靜)

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