斯鈣素1對(duì)腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的影響*

**通信作者 E-mail:18985009566@189.cn

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-09-11網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2325.066.html

楊清滔1， 谷江2*， 石家齊1， 賈本忠1， 顧昌世1， 張永春2， 朱致暉3， 姚茂良2， 劉淼2， 夏劍鋒2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)550004； 3.貴州省婦幼保健院， 貴州 貴陽(yáng)550000)

[摘要]目的： 研究斯鈣素1(stanniocalcin1, STC-1)對(duì)腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制。方法： 體外培養(yǎng)腎癌細(xì)胞，用0、0.1、0.5和1.0 nmol/L STC-1溶液浸染腎癌細(xì)胞，分別為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組；分別用MTT法檢測(cè)各組腎癌細(xì)胞的增殖情況，RT-PCR及ELISA法檢測(cè)各組腎癌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、STC-1基因及蛋白的表達(dá)，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。結(jié)果： 隨著STC-1蛋白給藥濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、STC-1的表達(dá)及Ca2+水平逐漸下降，細(xì)胞的促增殖作用逐漸降低，在低劑量組出現(xiàn)一過(guò)性增加。結(jié)論： STC-1蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α、Ca2+的水平，促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖，而該促增殖作用可能會(huì)因?yàn)镾TC-1對(duì)HIF-1α的抑制而逐漸減弱，從而調(diào)控腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)平衡。

[關(guān)鍵詞]腎癌細(xì)胞； 斯鈣素1； 缺氧誘導(dǎo)因子1α； 鈣離子； 增殖； 抑制

[基金項(xiàng)目]*貴州省科技廳社會(huì)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目[黔科合sy字(2011)3060]

[中圖分類號(hào)]R737.11

Influence of STC-1 on Growth Regulation of Renal Carcinoma Cells

YANG Qingtao1, GU Jiang2*, SHI Jiaqi1, JIA Benzhong1, GU Changshi1, ZHANG Yongchun2,

ZHU Zhihui3, YAO Maoliang2, LIU Miao2, XIA Jianfeng2

(1.AffiliatedBaiyunHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Affiliated

HospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.WomenandChild

HealthHospitalofGuizhouProvice,Guiyang550004,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To research the regulation machenism of Stanniocalcin1 (STC-1) on renal carcinoma cells. Methods: Renal carcinoma cells were cultured in vitro, and STC-1 solutions of different concentration were added to the culture medium. According to the different concentration, renal carcinoma cells were divided into control group, low-dose group (0.1 nmol/L STC-1), middle-dose group (0.5 nmol/L STC-1), high-dose group (1.0 nmol/L STC-1). The proliferation of cells, expressions of HIF-1α, STC-1 and levels of Ca2+ were detected by MTT, RT-PCR, ELISA and Fluorescence Spectrophotometer respectively. Results: The results showed that the cells treated with STC-1 protein exhibited characteristics of proliferation. And along with the increase of STC-1 protein concentration, the proliferation of cells, expressions of HIF-1α and STC-1, levels of Ca2+ were down-regulated. And a transient increase of proliferation of cells occurred in the low-dose group. Conclusions: STC-1 protein may participate in malignant proliferation of renal carcinoma cells through depressing HIF-1α or down-regulation Ca2+, which could wear off when HIF-1α is inhibited by redundant STC-1, thus regulate the growth balance of renal carcinoma cells.

[Key words] renal carcinoma cells; stanniocalcin1; hypoxia-inducible factor 1α; calcium; proliferation; inhibition

惡性腫瘤由于其侵襲性和異型性等特性，在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中腫瘤細(xì)胞會(huì)激活一系列相關(guān)分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以適應(yīng)環(huán)境的變化[1]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)作為介導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮重要作用[2]。斯鈣素1(stanniocalcin1, STC-1)是一種高表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡的糖蛋白激素[3]，在多種實(shí)體瘤組織內(nèi)高表達(dá)[4]。Ca2+的動(dòng)態(tài)平衡與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)[5]，HIF-1α亦是誘導(dǎo)STC-1表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6]。本實(shí)驗(yàn)選擇HIF-1α、Ca2+為研究靶點(diǎn)，以外源性STC-1蛋白作為干預(yù)條件，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、STC-1基因及蛋白表達(dá)和Ca2+水平的變化，探討STC-1是否借助調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+及HIF-1α水平參與腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控。

1材料與方法

1.1主要材料

腎癌(GRC-1)細(xì)胞購(gòu)于上海弗雷堡生物公司，MTT購(gòu)于Sigma公司，RPMI1640購(gòu)于Hyclone公司，STC-1蛋白購(gòu)于Prospec公司，總RNA提取試劑盒購(gòu)于Fermentas公司，ELISA試劑盒購(gòu)于R&D公司，F(xiàn)ura-2 AM鈣離子探針購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組

GRC-1細(xì)胞置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清及1%青霉素、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，2～3 d換液或消化傳代1次，取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。用0、0.1、0.5和1.0 nmol/L STC-1溶液浸染細(xì)胞培養(yǎng)基，即為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。

1.3方法

1.3.1HIF-1α、STC-1基因檢測(cè)RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、STC-1基因表達(dá)。使用試劑盒提取各組腎癌細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并合成cDNA。引物序列β-actin，正向5′-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3′，反向5′-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3′，片段長(zhǎng)度531 bp；HIF-1α，正向5′-TCCA GCAGACTCAAATACAAGAAC-3′，反向5′-GTATGTGGGTAGGAGATGGAGATG-3′，片段長(zhǎng)度130 bp；STC-1，正向5′-TGAGGTCGTCCAGCTCCCAATC-3′，反向5′-GGCACAGTGGTCTGTCTGCAGGATG-3′，片段長(zhǎng)度142 bp。RT-PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火53 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)后，終止反應(yīng)72 ℃ 5 min；以β-actin作為內(nèi)參照，PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.3.2HIF-1α、STC-1蛋白的檢測(cè)ELISA法檢測(cè)HIF-1α、STC-1蛋白表達(dá)。使用PMSF與細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞，12 000 r/min離心5 min，取上清滴加于酶標(biāo)包被板中，50 μL/孔，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔，按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3.3Ca2+含量測(cè)定熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量。取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)匯合度約80%時(shí)，分組處理后消化成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min棄上清液，用含0.2%小牛血清白蛋白的D-Hanks液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)約為8×105/mL。加入Fura-2 AM(3.89 μmol/L)，37 ℃避光孵育45 min。用D-Hanks液洗滌細(xì)胞2次，D-Hanks液3 mL重懸細(xì)胞。熒光分光光度計(jì)激發(fā)波長(zhǎng)分別為340 nm、380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)510 nm雙波長(zhǎng)測(cè)定負(fù)載探針細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。加入158 μL 2%Triton-100，5 min后測(cè)定細(xì)胞雙波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度；加380 nmol/LEGTA 42 μL測(cè)定細(xì)胞雙波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度。所得結(jié)果按公式計(jì)算：[Ca2+] =224×F0/Fs×(R-Rmin)/(Rmax-R)[R為實(shí)驗(yàn)測(cè)得的F340/F380，Rmax為加入Triton-100后的F340/F380，Rmin為加入Triton-100后再加EGTA的F340/F380，F(xiàn)s為加入Triton-100后的F380，F(xiàn)0為加入Triton-100后再加EGTA的F380]。

1.3.4細(xì)胞增殖活性MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞接種于96孔板中，約104個(gè)/孔，每組設(shè)6復(fù)孔，培養(yǎng)24 h分組處理后吸取孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加80 μL無(wú)血清培養(yǎng)基和MTT(5 μg/L) 20 μL，37 ℃孵育4 h后棄去孔內(nèi)液體，加二甲亞砜150 μL低速震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度(OD)值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1HIF-1α和STC-1基因的表達(dá)

各劑量組HIF-1α、STC-1基因的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著STC-1劑量的增加而逐漸降低。見(jiàn)圖1。

2.2HIF-1α和STC-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平

除低劑量組外，各劑量組HIF-1α、STC-1蛋白的表達(dá)量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注： MarkerⅠ為100～600 bp作為標(biāo)準(zhǔn)參照； (1)與對(duì)照組相比，P<0.05 圖1　各組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、STC-1基因相對(duì)表達(dá)水平 Fig.1　Relative expression of HIF-1α and STC-1 genes in each group

(1)與對(duì)照組相比，P<0.05 圖2　各組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、STC-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平 Fig.2　Relative expression of HIF-1α and STC-1 proteins in each group

2.3細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量及細(xì)胞增殖活性

STC-1低、中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量均隨STC-1給藥濃度的增加而逐漸減少；除高劑量組外，低、中、高劑組細(xì)胞OD值均高于對(duì)照組，但隨著STC-1劑量的增加OD值逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在低劑量組出現(xiàn)一過(guò)性增加。見(jiàn)表1。

表1　各組細(xì)胞內(nèi)Ca 2+含量及細(xì)胞增殖活性

(1)與對(duì)照組相比，P<0.05

3討論

惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展在很大程度上依賴HIF-1α來(lái)維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新血管形成、細(xì)胞增殖[2]。HIF-1α表達(dá)的增減可使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、血管化和轉(zhuǎn)移出現(xiàn)相應(yīng)的增減，最終影響患者預(yù)后[7]。STC-1高表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡[3]，而Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與了多種腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡調(diào)控[8]。隨著對(duì)STC-1不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)STC-1在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，原因可能與STC-1調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖有關(guān)[5]。鑒于HIF-1α、STC-1及Ca2+之間的相互聯(lián)系，故本研究選擇HIF-1α、Ca2+為研究靶點(diǎn)，用不同濃度STC-1干預(yù)腎癌細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞HIF-1α、STC-1表達(dá)和Ca2+水平的變化，探討STC-1是否借助調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+及HIF-1α水平參與腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控。

本研究中，STC-1干預(yù)腎癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)HIF-1α、STC-1表達(dá)隨著STC-1給藥濃度的增加而逐漸下降，這可能是外源性STC-1蛋白經(jīng)胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(CTP)介導(dǎo)，被其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，其中CTP是一種可攜帶生物活性大分子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)的新型轉(zhuǎn)導(dǎo)肽[9]，被導(dǎo)入的STC-1發(fā)揮其有效蛋白作用，并下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)[10]，亦可能是STC-1蛋白直接作用于細(xì)胞后的負(fù)反饋調(diào)節(jié)所致。本研究結(jié)果顯示STC-1可下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，且隨著STC-1給藥濃度的增加而逐漸降低。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，HIF-1α、STC-1降低Ca2+機(jī)制不盡相同；一方面HIF-1α通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵SERCA2蛋白表達(dá)和增強(qiáng)線粒體Ca2+緩沖能力，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體轉(zhuǎn)移，并且下調(diào)細(xì)胞膜非典型L型鈣通道表達(dá)，從而引起Ca2+內(nèi)流減少[11]；另一方面可能是由于STC-1分泌細(xì)胞上存在鈣離子敏感受體，從而介導(dǎo)STC-1分泌細(xì)胞合成和分泌STC-1，進(jìn)而負(fù)反饋降低Ca2+[12]。結(jié)合本研究MTT結(jié)果，發(fā)現(xiàn)STC-1能促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖，而促增殖作用卻隨著STC-1給藥濃度的增加而降低，其原因可能為隨著STC-1給藥濃度的增加，HIF-1α、Ca2+水平逐漸下降，細(xì)胞增殖活性升高可能是通過(guò)STC-1濃度的增加來(lái)減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，避免鈣超載，從而抑制細(xì)胞凋亡；但HIF-1α是促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的有利基因[7]，STC-1降低Ca2+的同時(shí)也降低HIF-1α，當(dāng)HIF-1α表達(dá)下降到一定程度時(shí)，STC-1對(duì)細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用逐漸被HIF-1α表達(dá)下降所拮抗；故STC-1對(duì)細(xì)胞促增殖的作用在低劑量組出現(xiàn)一過(guò)性增高，在中、高劑量組逐漸降低。

惡性腫瘤是消耗性疾病，腫瘤細(xì)胞對(duì)能量需求過(guò)大或供給不足都將導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受限。HIF-1α是促腫瘤細(xì)胞增殖的有利因子[7]，而STC-1蛋白卻抑制其表達(dá)，這避免了腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖而減少能量消耗，表明STC-1可能作為腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)劑或緩解劑。一方面STC-1通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，避免鈣超載，減少細(xì)胞凋亡，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖；另一方面STC-1通過(guò)下調(diào)HIF-1α表達(dá)，避免細(xì)胞過(guò)度增殖，最終使細(xì)胞達(dá)到一種平衡生長(zhǎng)狀態(tài)。嘗試打破這一生長(zhǎng)平衡可為臨床對(duì)腎癌的治療帶來(lái)新的思考，但腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程受多因素調(diào)控，本研究?jī)H為體外實(shí)驗(yàn)，尚不能更真實(shí)的模擬細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們將建立動(dòng)物模型并選擇性沉默或高表達(dá)STC-1，深入研究STC-1作用于腫瘤細(xì)胞及機(jī)制。

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(2015-05-12收稿，2015-08-23修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

注意正確使用“百分點(diǎn)”

百分點(diǎn)(1百分點(diǎn)=1%)的使用現(xiàn)在越來(lái)越多，但不少媒體用錯(cuò)了。例如某期刊中說(shuō)：“2007年產(chǎn)量為100萬(wàn)t，2008年達(dá)112萬(wàn)t，增加了12個(gè)百分點(diǎn)?！?/p>

百分點(diǎn)是一個(gè)新的基礎(chǔ)數(shù)學(xué)概念，它只用于比較采用百分?jǐn)?shù)形式表示的數(shù)值的增減 ，例如個(gè)人存款的年利率從3.25%降至2.25%，可以說(shuō)降了1百分點(diǎn)，但決不能說(shuō)降了1%。如果是降了1%，則新利率應(yīng)為3.25%～3.25%×0.01=3.217 5%?？梢?jiàn)，上述年產(chǎn)量的增加應(yīng)用百分?jǐn)?shù)表示，即說(shuō)“增加了12%”。

百分點(diǎn)是一個(gè)單位，書寫時(shí)其前面的“個(gè)”應(yīng)刪去，正如“5小時(shí)”“10厘米”不應(yīng)寫作“5個(gè)小時(shí)”“10個(gè)厘米”一樣。